微小分子RNA-508-5p作為抗腫瘤標志物的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種miRNA-508-5p對肝癌和胃癌細胞株新陳代謝的調(diào)控作用，很可能成為預(yù)防與治療腫瘤的標志物。越來越多的證據(jù)表明，microRNA可作為一種癌基因或抑癌基因，參與調(diào)控多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程。本發(fā)明通過構(gòu)建慢病毒侵染腫瘤細胞模型的實驗證明，miRNA-508-5p對腫瘤細胞株HepG2和SGC7901的增殖、遷移和侵襲等具有明顯抑制作用，并且促進其細胞的凋亡，具有調(diào)控細胞周期及新陳代謝的作用，因此miR-508-5p很可能成為腫瘤預(yù)防與治療的全新靶點；并且通過靶基因刪選軟件及雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實miR-508-5p發(fā)揮細胞調(diào)控作用，是通過特異性靶向抑制癌基因S-期激酶相關(guān)蛋白2基因(Skp2)的表達。
【專利說明】微小分子RNA-508-5p作為抗腫瘤標志物的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種內(nèi)源性的非編碼小RNAs的新用途，尤其涉及miR-508-5p在預(yù)防與治療胃癌和肝癌疾病中作為新的腫瘤標志物以及抗腫瘤藥物研制中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是常見的危害人類健康的惡性腫瘤，其病死率居我國惡性腫瘤之首，迄今病因不明，臨床治療效果不佳；原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年增長。因此開展胃癌、肝癌發(fā)病機制及臨床治療的研究是減輕其危害的根本途徑。
[0003]MicroRNA (miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其長約為18~25個核苷酸。miRNA通過Watson-Crick堿基互補匹配原則,對革EmRNA進行降解或抑制翻譯來調(diào)節(jié)蛋白的表達。據(jù)預(yù)測，人類約含有1000個miRNA，參與調(diào)控超過30%的蛋白編碼基因，在生物體的生長、發(fā)育、分化等方面起著重要的作用。miRNA的異常表達，參與腫瘤的各種生物學過程，包括腫瘤細胞增殖、凋亡和遷徙、侵襲等。越來越多的證據(jù)表明，miCToRNA可作為一種癌基因或抑癌基因，參與調(diào)控多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程。依此推斷，miRNA可作為一種癌基因或抑癌基因。
[0004]成熟的miRNA通過和其靶基因3’ UTR結(jié)合，從而降解其靶mRNA或阻礙其靶mRNA的翻譯。通過miRBase檢索成熟miR-508_5p序列信息，TargetScan、miRanda等進行革巴基因預(yù)測，miR-508-5p靶向抑制預(yù)測靶基因SKP2的表達。Skp2基因在各種人類惡性癌癥中都是過表達的，包括大腸癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、以及胃癌等，并且預(yù)后較差。Skp2的大量表達可促進癌細胞的細胞周期進展，與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。SKP2過表達與直腸癌放化療治療預(yù)后不良直接相關(guān)，成為高潛力的治療祀點。
[0005]在眾多的miRNA中，miR-508已經(jīng)被研究證實在胃癌、肝癌、腎癌和卵巢漿液性癌中表達異常下調(diào)，并很可能參與腫瘤的進程，成為潛在的抑癌基因，而目前miR-508-5p在胃癌、肝癌等腫瘤細胞中的調(diào)控作用機制及對其增殖與凋亡進程影響的研究仍不清楚，因此，開發(fā)以miR-508-5p為策略的胃癌和肝癌疾病的預(yù)防、診斷和治療的基礎(chǔ)研究和抗腫瘤藥物研究具有重要的意義和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種微小分子RNA-508-5p (miR-508_5p)在預(yù)防與治療胃癌和肝癌疾病及抗腫瘤藥物中的作用，所述miR-508-5p的核苷酸序列如下所示:5， -UACUCCAGAGGGCGUCACUCAUG-3，。
[0007]本發(fā)明的研究基礎(chǔ):
[0008]1.免疫組化法顯示Skp2蛋白在中低分化胃腺癌中明顯高表達，而在正常胃粘膜中Skp2蛋白幾乎不表達，并且其表達水平與胃癌臨床病理特征呈正相關(guān)，與腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，浸潤深度，分化程度等臨床病理特征密切相關(guān)。相反，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-508-5p在中低分化胃腺癌組織中表達水平相較于在正常胃粘膜中表達水平明顯下調(diào)，并且隨著病理分級越嚴重，表達量成逐級下調(diào)的正相關(guān)趨勢，qRT-PCR檢測結(jié)果和芯片數(shù)據(jù)
結(jié)果一致。
[0009]2.本發(fā)明通過TargetScarumiRanda等預(yù)測軟件對miR-508_5p進行祀基因預(yù)測，通過雙熒光素酶驗證了其對Skp2具有特異性靶向抑制作用。
[0010]3.本發(fā)明成功包裝了含有miR-508-5p小顆粒的慢病毒上清，病毒滴度達到lxl07TU/mlo將計算好的濃縮病毒上清液侵染腫瘤細胞，構(gòu)建細胞模型，通過westernblot和相對定量qRT-PCR檢測方法，同時證實了 miR-508_5p過表達能夠特異性明顯抑制Skp2mRNA (P < 0.05)和蛋白表達水平。
[0011]4.本發(fā)明通過MTT、Hoechst染色和流式細胞術(shù)同時證明，miR-508_5p通過靶標Skp2的表達，下調(diào)其在腫瘤細胞高表達的水平，調(diào)控細胞周期，阻止細胞G1/S期轉(zhuǎn)換而有效抑制細胞的增值，促進腫瘤細胞的凋亡。
[0012]5.本發(fā)明同時從劃痕實驗和transwell細胞遷移和侵襲實驗，證實了 miR-508_5P能有效抑制腫瘤細胞侵襲、水平遷移、垂直遷移和細胞自愈能力。
[0013]6.本發(fā)明表明microRNA在臨床實踐中有非常重要的意義，將成為新一代的腫瘤生物診斷標志物和用于腫瘤治療的分子靶標。尤其是開辟了以miR-508-5p為主的腫瘤疾病全新靶標的研究，也為研制抗腫瘤新藥開辟新的途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1顯示了免疫組化對胃癌組織中Skp2蛋白進行定量與定位，證實Skp2在胃癌組組織中高表達。
`[0015]圖2顯示了提取福爾馬林固定后石蠟包埋組織中RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運用q-RTPCR方法檢測miR-508-5p在胃腺正常組織和癌變組織中表達情況。
[0016]圖3顯示雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-508_5p靶向抑制Skp2熒光素酶活性。
[0017]圖4顯示濃縮病毒上清液侵染腫瘤細胞，通過半定量RT-PCR，western blot和相對定量qRT-PCR檢測方法，同時證實了 miR-508-5p過表達能夠特異性明顯抑制Skp2mRNA(P< 0.05)和蛋白表達水平。
[0018]圖5顯示MTT實驗驗證了 miR-508-5p明顯抑制腫瘤細胞H印G2和SGC7901細胞的增殖。圖6顯示hoechst染色實驗驗證了 miR-508-5p明顯促進腫瘤細胞H印G2和SGC7901細胞的凋亡。
[0019]圖7顯示Transwell實驗驗證了 miR-508_5p明顯抑制腫瘤細胞H印G2和SGC7901細胞的遷移和侵襲。
【具體實施方式】
[0020]1.采用免疫組化的方法檢測癌基因SKP2基因表達情況。收集寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科2013-2月到2013-8月期間中低分化胃腺癌病人福爾馬林固定后石蠟包埋的組織(FFPE) 12例，以及正常胃粘膜病人福爾馬林固定后石蠟包埋的組織(FFPE) 10例，連續(xù)切片，4um厚，經(jīng)過脫蠟水化，ImM EDTA(PH9.0)抗原修復(fù)，H202消除內(nèi)源性過氧化物酶，10%山羊血清封閉，鼠抗人SKP2 —抗孵育4°C過夜，羊抗鼠SKP2 二抗37°C孵育Ih.。采用DAB染色試劑盒對陽性區(qū)域染色，鏡下控制染色程度，最后蘇木素復(fù)染，HCL-酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，透明封片。
[0021]2.石蠟組織RNA抽提和qRT-PCR。收集組織同上，采用FFPE RNA IsolationKit (OMEGA)從石蠟組織中提取RNA，運用q-RT PCR方法檢測miR-508_5p在胃腺正常組織和癌變組織中表達情況。連續(xù)切片4-6片，IOum厚，二甲苯脫蠟，HiBind? RNAMicroElute柱子分離純化RNA,按照promege反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。U6作為內(nèi)參基因，結(jié)果采用相對定量法，公式為2_ΛΛσ。
[0022]3.pSicoR-miR-508-5p 重組慢病毒載體及 pMIR-R印ort-SKP2_3’ UTR 表達載體的構(gòu)建與鑒定。將經(jīng)過Hpa I和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切的pSicoR質(zhì)粒，以及經(jīng)過MIU I和Spe I限制性內(nèi)切酶雙酶切的pMIR-R印ort質(zhì)粒，用12g/L的瓊脂糖凝膠跑電泳并對目的條帶進行膠回收，分別將線性化的pSicoR質(zhì)粒與雙鏈miR-508-5p DNA片段連接，將線性化的pMIR-R印ort質(zhì)粒與SKP23’_UTR連接，反應(yīng)條件為22°C，2h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TopiO感受態(tài)細胞，挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒DNA，分別用Xba 1、Xho I及MIU 1、SpeI限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定并測序。
[0023]4.雙熒光素酶報告系統(tǒng)。將HEK-293T細胞接種于96孔板，使轉(zhuǎn)染時細胞密度達到 I X lOVmL。將 pSicoR-miR-508-5p 過表達載體和 pMIR-R印ort-SKP2_3’ UTR 載體共轉(zhuǎn)染至 293T 細胞中，同時共轉(zhuǎn)染 pMIR-R印ort-SKP2-3’UTR mut 載體及 miR-508_5pinhibitor(5’ -CAUGAGUGACGCCCUCUGG AGUA-3’ )做對照。每組共轉(zhuǎn)染海蜃熒光素酶(PRL-TK)做為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染試劑為Tranglipid Transfection Regent2000。轉(zhuǎn)染48h后，突光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光發(fā)光情況，并裂解細胞，按照promega雙熒光素酶試劑盒說明書進行操作，所用儀器為微孔板發(fā)光分析儀。
[0024]5.包裝慢病毒建立 腫瘤細胞模型。在6孔細胞培養(yǎng)板中接種約IXlO6個HEK-293T細胞，每孔加入2mL含10% FBS DMEM完全培養(yǎng)基，37°C,5% C02培養(yǎng)24h后，細胞密度達到80 %~90 %時，按照TransLipid Transfection Reagent說明書，將三質(zhì)粒系統(tǒng)(pSicoR-miR-508-5p 過表達載體 1.5 μ g，pVSVG0.45 μ g, Δ 8.911.05 μ g)共轉(zhuǎn)染至ΗΕΚ-293Τ細胞中，收集轉(zhuǎn)染48h和72h后的上清液。4°C 3000g離心lOmin，去除細胞碎片，然后將上清用0.45 μ m的PVDF濾膜過濾，_80°C分裝保存。運用倍比稀釋原則對病毒進行滴度測定，侵染腫瘤細胞系HepG2和SGC7901。
[0025]6.Western blot analysis。慢病毒侵染細胞同上，48h后觀察GFP的表達情況，按照凱基提全蛋白試劑盒說明書提全蛋白，_80°C分裝保存。提取的蛋白進行BCA法定量。SDS-PAGE分離，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，50g/L脫脂奶粉封閉，4°C過夜后，加入兔抗的SKP2抗體(1:100)室溫搖晃孵育2h后4°C過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(l:5000)孵育2h，充分洗膜后利用ECL化學發(fā)光法進行暗室曝光。
[0026]7.MTT檢測細胞增殖情況。慢病毒侵染細胞同上，24、48、72h后終止刺激。更換無血清培養(yǎng)液，每孔90 μ L，加入50 μ L MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入150 μ L DMSO溶解結(jié)晶。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490nm的吸光度(A490)值。同時設(shè)置調(diào)零孔和對照孔，每組設(shè)定3復(fù)孔實驗結(jié)果用柱狀圖或不同時間段折線圖表示。
[0027]8.Hoechst染色檢測細胞凋亡情況。6孔板放置無菌細胞爬片，接種合適密度的腫瘤細胞，
[0028]慢病毒侵染后48h，加入固定液，PBS清洗后，每孔加入0.5ml Hoechst33258染色液，避光染色5min。去染液，PBS洗兩遍，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的爬片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡檢測，激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。計數(shù)藍白色的細胞核(凋亡細胞)數(shù)量。
[0029]9.Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲情況。細胞侵襲實驗=Matrigel基質(zhì)膠來源于BD公司，首先將分裝凍存在_20°C的新鮮Matrigel在冰上解凍并按照體積比1:8與無血清DMEM培養(yǎng)基配置成混懸液,包被TranswelI (孔徑8um)小室:用無菌鑷子將Transwell小室放入24孔細胞培養(yǎng)板，將制備好的Matrigel混懸液按70ul/室加入24孔板，放入細胞孵育箱中30min,取出后在超凈工作臺上風干30min,在Transwell小室的下室內(nèi)加入500ul含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，上室中加入制備好的細胞懸液IO4/孔，細胞常規(guī)培養(yǎng)48h，以鑷子小心將Transwell小室取出，棄去上室培養(yǎng)基，用無菌棉簽輕將上室內(nèi)面殘余的細胞及Matrigel膠刮去，滴加90%乙醇在小室的外側(cè)面，固定lOmin，0.1 %結(jié)晶紫染色5min，正置顯微鏡鏡下采集照片，隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)穿膜的細胞數(shù)，并進行統(tǒng)計分析。細胞遷移實驗類似，除了不用鋪`Matrigel基質(zhì)膠，上室接種2xl04/孔細胞，常規(guī)培養(yǎng)24h。
【權(quán)利要求】
1.MiRNA-508-5p通過抑制癌基因Skp2的表達，在預(yù)防與治療胃癌和肝癌等疾病中作為腫瘤標志物的作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，miR-508-5p在腫瘤細胞過表達對相關(guān)腫瘤的調(diào)控作用和相關(guān)疾病藥物中的作 用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805693SQ201310548573
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】徐廣賢, 魏軍, 張愛君, 白靜 申請人:寧夏醫(yī)科大學