專利名稱：旋毛蟲的lamp檢測方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域中寄生蟲的分子生物學檢測方法，特別是涉及一種旋毛蟲的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。
背景技術：
旋毛蟲病是由旋毛形線蟲[Trichinellaspiralis (Owen, 1835) Railliet, 1895] (簡稱旋毛蟲)引起的食源性人獸共患寄生蟲病，在全世界66個國家或地區均有分布。目前，國際公認的旋毛蟲屬分為8個種及3個基因型，即旋毛蟲(Tl)、鄉土旋毛蟲(T2)、布氏旋毛蟲(T3)、偽旋毛蟲(T4)、米氏旋毛蟲(T5)、納氏旋毛蟲(T7)、巴布亞旋毛蟲(TlO)及津巴布韋旋毛蟲(Tll)及T6、T8、T9。我國已發現存在有2種，即旋毛蟲(Tl)和鄉土旋毛蟲 (Τ2)。目前，已知豬、野豬、狗、鼠等150多種動物可作為旋毛蟲的宿主，由這些動物互相殘食或攝取尸肉而傳播。人患旋毛蟲病主要因生食或半生食含有幼蟲囊包的豬肉或其它動物肉類所致，急性期患者表現為發熱、水腫、肌痛、腹瀉等癥狀，感染后可終生帶蟲，表現為肌肉酸痛無力，重者可因嚴重的并發癥死亡，死亡率為3% 30%。國際旋毛蟲病委員會調查結果顯示，自1995年1月至1997年7月已報道的旋毛蟲感染人數達10，030人，估計全球至少有6，000萬人感染該病。我國1964年至2005年已報道的病例達26，000余人，隱性感染人數達4000萬人，由此產生巨大的醫療費用，僅急性感染者的治療費用就高達數百億元人民幣，而隱性感染所造成的體質下降等各種間接損失則更為巨大。鑒于其暴發頻率、感染人數及危害性，在歐盟2006年公布15種重要新發與再發性人獸共患病病種中，旋毛蟲病作為唯一的食源性寄生蟲病名列其中。旋毛蟲不僅嚴重危害人類健康，也給養豬業和肉類工業造成巨大的經濟損失。世界各國均把屠宰動物的旋毛蟲檢驗作為首檢和強制性必檢項目，以此切斷其由動物向人的傳播，由于大量人力、物力及財力的耗費，致使旋毛蟲病成為了目前世界范圍內投入控制費用最高的寄生蟲病。僅以2004年生豬屠宰的旋毛蟲病檢驗費用為例，歐盟5. 7億歐元/屠宰量為2億頭，美國10億美元/屠宰量為3億頭，我國高達18億元人民幣/屠宰量為6. 18 億頭(3元人民幣/頭)。國際旋毛蟲病委員會預測在未找到更為有效的檢驗方法以前，以上各國所公布的檢驗費用均不可能降低。目前，迫切需要對旋毛蟲感染進行有效的診斷和控制，前者的有效性依賴于檢測方法的可靠性，但至今仍未發現有效的檢測方法。對于屠宰動物旋毛蟲病的檢驗，國際獸疫局的法規檢驗方法為鏡檢法及集樣消化法，目前我國也在延用這兩種方法。然而，以上兩種方法均存在一定的弊端，鏡檢法費時費力而且敏感性差，集樣消化法雖可提高檢出率，但仍十分繁瑣。兩種方法的敏感性均可造成肉類的漏檢而引起人的感染，存在安全隱患。對于人旋毛蟲病的診斷只能憑借病原學檢查或血清學檢查同詢問病史相結合的方法。病原學檢查取病人的肌肉壓片鏡檢，查到旋毛蟲幼蟲囊包即可確診，但是該方法對發病早期和輕度感染者的陽性率不高，而且不易被患者接受。血清學檢查依靠從病人血清中查到旋毛蟲特異抗體而確診，該類方法比較簡單、快速，但由于旋毛蟲抗體在宿主體內出現的時間較晚， 故不能用于旋毛蟲病的早期診斷，而且假陽性率較高。因此，尋找早期、簡單、特異的旋毛蟲檢測方法是旋毛蟲病研究領域的熱點。環介導的等溫核酸擴增技術(LAMP)是由Τ· Notomi (Notomi Τ, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res2000;28(12) :63.)發明的一種新型核酸擴增技術，該技術依賴4條特異設計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地擴增靶序列。 近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。Masaki Imai等人(Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection bynewly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method. J Virol Methods. 2007 ； 141 (2) :173-80.)禾Ij M LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N, Arai R, Tada S, Taguchi H, Ogawa Y. Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp. yeasts with aloop—mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ；24(7-8) :778-85.)針對四種香酒酵母的ITS序列設計了 LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。該技術還用于檢測其它與人類相關的病毒，如巨細胞病毒、埃博拉病毒、慢性伯基特淋巴瘤病毒、虹彩病毒、人類瘡疹病毒、造血組織壞死病毒、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒等。目前，LAMP技術在寄生蟲方面的研究也有開展，如檢測宿主體內的間日及惡性瘧原蟲、日本血吸蟲、非洲錐蟲、巴貝斯蟲、黏液孢子蟲、隱孢子蟲、 弓形蟲、豬帶及牛帶絳蟲等。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測旋毛蟲的LAMP專用引物與試劑盒問世。

發明內容
本發明的目的是提供一種特異性和靈敏度較高的用于檢測旋毛蟲的LAMP檢測專用引物。本發明所提供的用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的專用引物，是根據如序列表中序列1所示的旋毛蟲的特異性保守基因sb4重復序列設計的，用以定性檢測待測樣品中的旋毛蟲。具體來講，所述用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的專用引物為以下三組引物對混合的引物組合，第一組引物對引物1 (F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2 (B3)， 其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二組引物對引物3 (FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三組引物對引物 5 (LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6 (LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7 所示。所述引物組合中各引物對(FIP和BIP) (LF和LB) (F3和B3)的摩爾比為 40 20 5。本發明的第二個目的是提供一種旋毛蟲的LAMP檢測方法。本發明所提供的旋毛蟲的LAMP檢測方法，可包括以下步驟1)以待測物的基因組DNA為模板，在上述引物的引導下進行LAMP擴增；
2)反應結束后進行結果判定在反應液中添加鈣黃綠素指示劑，根據反應液的顏色變化判斷結果，綠色表示待測樣品中存在旋毛蟲，橙色表示待測樣品中不存在旋毛蟲；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來判斷結果，濁度上升表示待測樣品中存在旋毛蟲，濁度無變化表示待測樣品中不存在旋毛蟲。在上述旋毛蟲的LAMP檢測方法中，所述步驟1)中的待測物包括肌肉、血液、糞便等；所述25 μ 1 LAMP反應體系可包括待測物的基因組DNA 2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl，10mM(NH4)2S04，0· 1 % Tween20，0· 8M 甜菜堿(betaine),8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，弓|物力口入量為40pmol FIP 禾口 BIP 所示弓|物，20pmol LF和LB所示引物，5pmol F3和B3所示引物。所述步驟1)中的LAMP擴增條件可為置60-65°C恒溫45-55min，優選為50min。所述步驟2)中鈣黃綠素指示劑的添加量可為1 μ 1(終反應體系為1)，包含有 0. 5mM鈣黃綠素和IOmM氯化錳。本發明的第三個目的是提供一種用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的試劑盒。本發明所提供的試劑盒，包括上述用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的引物。為方便檢測，所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為旋毛蟲的基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系(如雙蒸水)。具體說來，所述試劑盒中包括20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, 10mM(NH4)2S04,0. 1% Tween 20，0. 8M甜菜堿(betaine)，8mM MgSO4，1. 4mM dNTPeach，8U Bst DNA polymerase, 40pmol FIP 和 BIP，20pmol LF 禾口 LB，5pmol F3 和 B3，鈣黃綠素指示劑，旋毛蟲的基因組DNA(25 μ 1 LAMP反應體系中使用2 μ 1)和雙蒸水。采取以上設計，本發明具有以下優點1)高特異性6條引物對旋毛蟲靶序列的8個特異區域的識別保證了 LAMP擴增的高度特異性，即LAMP能從相差僅一個核苷酸的基因標本中找出相應的靶序列進行擴增；2)高靈敏度靈敏度比普通PCR高100倍；3)結果鑒定簡便可通過肉眼觀察結果(鈣黃綠素顯色)，也可以直接用濁度儀判斷結果；4)操作簡單只要將檢測樣品(靶核酸)和檢測試劑一起放入60_65°C恒溫水浴鍋中50分鐘后就可以判斷結果；5)快速、高效擴增整個LAMP擴增反應一小時內即可完成，且產率可達到0. 5mg/
mLo綜上所述，本發明可以在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到旋毛蟲，不需要復雜儀器，為旋毛蟲的檢測提供了新的技術平臺，可用于畜牧業生產單位、基層醫療衛生單位和各疾病預防控制中心篩查和檢測旋毛蟲，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法對旋毛蟲特異性的濁度儀檢測結果圖2為本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法對旋毛蟲特異性的鈣黃綠素染色檢測結果
5
圖3為本發明旋毛蟲LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果圖4為本發明旋毛蟲LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素染色檢測結果圖5為對旋毛蟲的PCR檢測結果
具體實施例方式實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1、用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的引物設計從美國基因數據庫檢索獲得旋毛蟲1. 6kb重復序列(GenBank :X06625. 1)通過 BLAST軟件進行同源性分析得知是旋毛蟲的1. 6kb特異保守序列(序列表中序列1)，再根據該保守靶DNA序列，用軟件I^rimer design V4設計用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的引物， 結果優化得到三組引物對，F3和B3為第一組，FIP和BIP為第二組，LF和LB為第三組，具體引物序列如表1。應用中，三組引物對可以任意比例混合使用，實施例2反應體系中給出了一種具體優化組配作為示例。表1用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的引物
引物名稱序舶‘'.')
B3AMATTGGTAAGMGAACCCTTA (序列表中序列 3)
FIPGGTGTTACAGACATGGCGGTTTTTCAATTTTACACATTCATACCTATGC (序列表中序列 4)
BIPTACTCGTGAAGCTTTGCTAATCATTTTTAGTTTACACATCGACAMCC (序列表中序列 5)
LFGCGATTAATACCATTCCCGGTGG (序列表中序列 6)
LBGCGCCCTAACGAATATGAGC (序列表中序列 7)
WW^WWSSCSSStSMSttWI gBgggggggg&Sg&Sg&SgSjSggggggMg&SggWi'i'l'ii'i'l'i'ii'l'i'i' iiiTCWWTWm ； I ...............................................................................................................................................................■■■■■！............................................................... I ； gWgWWWggggggg ·..·—..■■■■■■■!.■ ggggSgWBgSWS實施例2、本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法的建立用實施例1獲得的用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的六條引物對旋毛蟲河南株(來自鄭州大學醫學院人體寄生蟲教研室)進行LAMP檢測，以獲得最佳反應體系及反應條件， 具體方法如下—、最佳反應體系的確定在相同反應條件(置63°C恒溫50min)下，在反應體系中添加不同濃度的Mg2+，以確定最佳反應體系，包括以下步驟1)以旋毛蟲基因組DNA (用TIANGEN公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取待測樣品中的核酸)為模板，在實施例1獲得的六條引物的引導下進行LAMP擴增， 其中，25 μ 1 LAMP反應體系包括含旋毛蟲的基因組DNA 2 μ 1，20mMTris · HCl (pH 8.8)， IOmM KCl，IOmM (NH4)2SO4,0· 1 % Tween20，0· 8M 甜菜堿(betaine)，分別添加 ^nM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、IOmM) MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase (購自 NEB 公司)，力口入的引物量為:40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3 ；反應條件為置63°C恒溫水浴鍋中50min。2)反應結束后進行結果判定在反應液中添加1 μ 1的(終反應體系為沈μ 1)含有0. 5mM鈣黃綠素和IOmM氯化錳的鈣黃綠素顏色指示劑，根據反應液的顏色變化判斷結果(原理鈣黃綠素是金屬離子指示劑，能指示反應液中Mg2+的變化)。綠色表示待測樣品中存在旋毛蟲(陽性)，橙色表示待測樣品中不存在旋毛蟲(陰性)；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來判斷結果(原理LAMP反應的過程中會產生焦磷酸鎂，焦磷酸鎂是一種白色沉淀，濁度儀可以根據濁度的變化來判斷LAMP反應)。濁度上升表示待測樣品中存在旋毛蟲(陽性)，濁度無變化表示待測樣品中不存在旋毛蟲(陰性)。在上述引物組合的引導下，用含有不同濃度MgSO4W反應體系檢測待測樣品中的旋毛蟲，結果含有8mM MgSO4的反應體系的檢測效果最好，因此，將本發明最佳的旋毛蟲的 LAMP檢測體系定為本發明最佳的旋毛蟲的LAMP檢測體系定為(25 μ 1)待測物的基因組 DNA 2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl，IOmM(NH4)2S04，0· 1 % Tween20，0· 8M 甜菜堿 (betaine),8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U BstDNA polymerase，加入的引物量為:40pmol FIP 禾口 BIP，20pmol LF 禾口 LB，5pmol F3 禾口 B3。二、最佳反應條件的確定在步驟一確定的相同的反應體系下，在不同反應條件下對旋毛蟲的基因組DNA進行LAMP檢測，以確定最佳反應條件，包括以下步驟1)以旋毛蟲的基因組DNA為模板，在實施例1獲得的六條引物的引導下進行 LAMP擴增，其中，25 μ 1 LAMP反應體系包括旋毛蟲的基因組DNA 2 μ 1，20mMTris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl，10mM(NH4)2S04，0· 1 % Tween20，0· 8M 甜菜堿(betaine),8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，加入的引物量為:40pmol FIP和BIP，20pmol LF禾口LB， 5pmol F3 和 B3。LAMP 的擴增條件為置 60_65°C恒溫 40_60min。2)結果判定反應結束后，用與步驟一相同的方法進行結果判定。檢測結果表明，本發明最佳的旋毛蟲LAMP擴增條件為置60-65°C恒溫40_60min。實施例3、本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法的特異性、靈敏性檢測一、本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法的特異性檢測分別以旋毛蟲(Tl)、鄉土旋毛蟲(T2)、偽旋毛蟲(T4)、納氏旋毛蟲(T7)、似蚓蛔線蟲、蟯蟲、鞭蟲、十二指腸鉤口線蟲、華支睪吸蟲、布氏姜片蟲、日本血吸蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲、曼氏迭宮絳蟲(所有蟲株均來自鄭州大學醫學院人體寄生蟲教研室)的基因組DNA 為模板，以雙蒸水為陰性對照，檢測實施例2獲得的最佳的旋毛蟲的LAMP檢測方法的特異性。本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法對旋毛蟲特異性的濁度儀檢測結果如圖1所示，鈣黃綠素染色檢測結果如圖2所示(1，陰性對照(雙蒸水)；2，旋毛蟲(Tl) ；3，鄉土旋毛蟲 (T2) ；4，偽旋毛蟲(T4) ；5，納氏旋毛蟲(T7) ；6，似蚓蛔線蟲；7，蟯蟲；8，鞭蟲；9，十二指腸鉤口線蟲；10，華支睪吸蟲；11，布氏姜片蟲；12，日本血吸蟲；13，豬帶絳蟲；14，牛帶絳蟲；15，曼氏迭宮絳蟲)。圖1濁度曲線顯示2-5號樣品濁度上升，表明檢測到旋毛蟲；圖2中可以看出只有旋毛蟲種株的樣品2、3、4、5顯示出綠色，表明發生了 LAMP反應，檢測到旋毛蟲，其余均未檢測到旋毛蟲。鈣黃綠素染色方法及濁度儀檢測方法的檢測結果一致，說明本發明的旋毛蟲的LAMP檢測方法具有較高的特異性，可以特異性地檢測到旋毛蟲。二、本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法的靈敏度檢測本實驗測試本發明LAMP檢測方法與普通PCR方法檢測旋毛蟲的靈敏度，方法為 提取旋毛蟲總DNA，然后以10倍梯度(1倍、10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7 倍、IO8倍、IO9倍)進行稀釋，使1-10模板中總DNA的濃度分別為3620ng/ μ l、362ng/ μ 1、 36. 2ng/y 1、3. 62ng/y l、362pg/y 1、36. 2pg/μ 1、3. 62pg/y 1、0. 362pg/y 1、0. 036pg/ μ 1、0. 0036pg/y 1，再以經梯度稀釋的DNA為模板，分別用本發明的LAMP檢測方法與普通 PCR方法(引物序列為F3和B； )進行靈敏度檢測。本發明旋毛蟲LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果如圖3所示(代號1_10模板對應濃度分別為:3620ng/y l,362ng/y 1,36. 2ng/y 1、3· 6&ig/μ l、362pg/μ 1、36· 2pg/ μ 1、3· 62pg/y 1、0. 362pg/y 1、0· 036pg/y 1、0· 0036pg/μ 1)，代號 1-8 號樣品濁度上升表示檢測到旋毛蟲，表明本發明引物組合對旋毛蟲的最低檢測靈敏度為0. 362pg/yl ； 鈣黃綠素染色檢測結果如圖4所示(3620ng/y l、362ng/y 1、36. 2ng/μ 1、3. 62ng/μ 1、 362pg/y l、36.2pg/y l、3.62pg/y 1、0. 362pg/y l、0.036pg/y 1、0. 0036pg/y 1)，其中 1-8號試管顯示出綠色，檢測到旋毛蟲，表明本發明引物組合對旋毛蟲的最低檢測靈敏度為 0. 362pg/y 1 ；PCR檢測結果如圖 5所示(3620ng/μ l,362ng/μ 1,36. 2ng/y 1、3· 62ng/y 1, 362pg/y 1、36. 2pg/y 1、3. 62pg/y 1、0. 362pg/y 1、0. 036pg/y 1、0. 0036pg/y 1，M, DNA marker D2000)，其中1_6號樣品有條帶出現，表明PCR方法的檢測靈敏度為36. 2pg/y L· 比較可知。本發明旋毛蟲的LAMP檢測方法可檢測到0. 362pg/ μ 1，而普通PCR方法僅能檢測到36. 2pg/y 1，而且鈣黃綠素染色方法及濁度儀檢測方法的結果一致，表明本發明旋毛蟲的LAMP檢測法比普通PCR檢測方法的靈敏度高100倍。實施例4、用于旋毛蟲的LAMP檢測的試劑盒將20mM Tris 'HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4jO. 1 % Tween 20，0·8Μ 甜菜喊(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，弓|物40pmol FIP 禾口 BIP,20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，鈣黃綠素指示劑(用染色法檢測時使用)以及作為陽性對照的旋毛蟲的基因組DNA 2 μ 1，作為陰性對照的不含DNA的LAMP擴增體系(雙蒸水)共同包裝，再配以產品使用說明書(記載染色法和濁度法兩種檢測方法)，得到用于旋毛蟲的LAMP檢測的試劑盒。
權利要求
1.用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的專用引物，是根據如序列表中序列1所示的旋毛蟲的特異性保守基因sb4重復序列設計的，用以定性檢測待測樣品中的旋毛蟲。
2.根據權利要求1所述的專用引物，其特征在于為以下三組引物對混合的引物組合， 第一組引物對引物1 (F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2 (B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二組引物對引物3 (FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4 (BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三組引物對引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6 (LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
3.根據權利要求2所述的專用引物，其特征在于所述引物組合中各引物對(FIP和 BIP) (LF 和 LB) (F3 和 B3)的摩爾比為 40 20 5。
4.一種旋毛蟲的LAMP檢測方法，包括以下步驟1)以待測物的基因組DNA為模板，在權利要求1或2或3所述引物的引導下進行LAMP 擴增；待測物為肌肉、血液或糞便等；2)反應結束后進行結果判定在反應液中添加鈣黃綠素指示劑，根據反應液的顏色變化判斷結果，綠色表示待測樣品中存在旋毛蟲，橙色表示待測樣品中不存在旋毛蟲；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測反應前后反應液的濁度變化來判斷結果，濁度上升表示待測樣品中存在旋毛蟲，濁度無變化表示待測樣品中不存在旋毛蟲。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的；所述25μ1LAMP反應體系包括待測物的基因組 DNA 2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4, 0.1 % Tween20，0. 8M 甜菜堿(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTPeach，8U Bst DNA polymerase，引物加入量為40pmol FIP和BIP所示引物，20pmolLF和LB所示引物，5pmol F3和B3所示引物。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的LAMP擴增條件為 置 60-65°C恒溫 45-55min，優選為 50min。
7.根據權利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述步驟2~)中鈣黃綠素指示劑的添加量為1 μ 1，包含有0. 5mM鈣黃綠素和IOmM氯化錳。
8.一種用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的試劑盒，包括權利要求1或2或3所述用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的引物。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為旋毛蟲的基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系(如雙蒸水)。
10.根據權利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括 20mMTris ‘ HCl (pH 8. 8)，IOmM KCl，IOmM(NH4) 2S04，0. 1 % Tween 20，0·8Μ 甜菜堿 (betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase, 40pmol FIP 禾口 BIP， 20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，鈣黃綠素指示劑，旋毛蟲的基因組DNA和雙蒸水。
全文摘要
本發明公開了一種旋毛蟲的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。用于對旋毛蟲進行LAMP檢測的專用引物，是根據如序列表中序列1所示的旋毛蟲的特異性保守基因sb4重復序列設計的，用以定性檢測待測樣品中的旋毛蟲。綜上所述，本發明可以在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到旋毛蟲，不需要復雜儀器，為旋毛蟲的檢測提供了新的技術平臺，可用于畜牧業生產單位、基層醫療衛生單位和各疾病預防控制中心篩查和檢測旋毛蟲，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102424841SQ201110432470
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者劉威, 李雪蓮, 王中全, 王雪松, 袁靜, 鄒大陽, 黃留玉 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所