專利名稱：在用人胎兒肝干細胞注射的免疫缺陷動物中產生抗體的方法
在用人胎兒肝干細胞注射的免疫缺陷動物中產生抗體的方
法本申請是申請日為2007年5月9日、發明名稱為“在用人胎兒肝干細胞注射的免疫缺陷動物中產生抗體的方法”的中國專利申請200780008799. 7 (國際申請號PCT/ EP2007/004085)的分案申請。本發明涉及產生抗體的方法、抗體生成細胞的組合物、它們的生產方法及其用途。
背景技術：
長期以來認為單克隆抗體(MAB)是癌癥的免疫療法、感染或自身免疫病等的妙方。然而，由于人抗小鼠的免疫應答，人類中使用的第一代鼠抗體很不成功。人抗體大部分來自攜帶有受限的一組人類Ig基因的轉基因小鼠或使用噬菌體展示、酵母展示或類似重組技術選自多數人工抗體庫。這些策略已經被設計用來消除針對人類背景中的單克隆抗體的任何免疫反應。人抗體可以在轉基因動物(例如小鼠)中產生， 所述轉基因動物經免疫后能夠在沒有內源性免疫球蛋白產生的情況下產生人抗體。在此類種系轉基因小鼠中轉移人類種系免疫球蛋白基因陣列導致抗原攻擊時產生人抗體(見， 例如，van Dijk, Μ. Α.和 van de Winkel, J. G.，Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374 ； Jakobovits, Α.,等)κ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555 Jakobovits, A.， 等人，Nature 362(1993)255-258 ；Bruggemann, Μ.,等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。 人抗體也可在噬菌體展示文庫中產生(Hoogenboom，H. R.和Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等人，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole 等人和Boerner等人的技術也適用于人單克隆抗體的制備(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；禾口 Boerner, P.,等人’ J. Immunol. 147(1991)86-95)。然而此類轉基因小鼠只能提供具有受限的一組人類Ig基因的抗體-由轉染的免疫球蛋白基因陣列引起的那些。基于對人類免疫球蛋白基因轉基因的小鼠的方法學已經允許產生來自人類種系序列的抗體，根據報道所述抗體與鼠類的或小鼠-人嵌合抗體相比已經降低所獲抗體藥物的免疫原性。然而，來自轉基因小鼠的人抗體與天然人類免疫所有組成成分相比在它們的多樣性、親和力及特異性上有限。類似地，基于噬菌體或酵母展示的組合文庫方法的主要缺點是抗體重鏈和輕鏈的隨機配對。為鑒定具有高親和力的重鏈和輕鏈對，原始抗體重鏈和輕鏈對——非同源對的解離需要篩選多數克隆。此外，此類非同源對可能呈現與人類自身抗原不想要的交叉反應性。最后，由于固有的選擇偏倚，通過組合文庫的選擇和篩選鑒定的靶特異性抗體的遺傳多樣性通常受限。Traggai，E.等人，Science 304(2004) 104-107描述了在移植了人類臍血細胞的 Rag 2-/-γ C-/-小鼠中開發人類免疫系統的方法，其可用作評估對疫苗或活體感染性病原體的應答和靶定人類免疫系統的藥學化合物的臨床前模型。已表明重建并隨后接種病原體的小鼠可產生低水平的破傷風類毒素特異性抗體應答。發明概述
本發明包含從免疫缺陷型非人類動物中產生人單克隆抗體的方法，所述方法包括使新生免疫缺陷型非人類動物與人類胎兒肝干細胞(FL細胞)接觸來產生免疫移植的非人類動物(重建動物)，隨后使所述重建動物與抗原接觸，從所述重建動物中收集產生針對所述抗原的人抗體的人細胞，并從所述抗體產生細胞中分離所述抗體。本發明優選包括本發明的方法，其特征在于通過轉化方法或細胞融合方法建立所述抗體產生細胞，優選無限增殖的抗體產生細胞。優選地所述無限增殖細胞能夠保持活力至少50代。優選地，所述非人類動物是嚙齒類動物并更優選為小鼠、大鼠或兔。進一步優選所述小鼠是 I ag2-/- y c-/-、裸 fcig 2-/-、NOD (NOD 指根據本發明優選 NOD. Cg-RagltmlMom PrfltmisdVSzJ)或SCID米色小鼠并且大鼠是裸大鼠。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述FL細胞是人類造血胎兒肝干細胞 (HFL 細胞)，優選 CD133+、CD 117+、CD 31+和域 CD34+。在另一實施方案中，所述方法優選地特征在于所述FL細胞是HFL細胞和人類非造血胎兒肝干細胞的組合。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述抗體產生細胞是人類B細胞。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述FL細胞經腹膜內、皮下或肝內注射到動物中用于接觸。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述抗原是多肽、MHC/肽復合體或DNA。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述抗原作為抗原、抗原片段、編碼抗原的 DNA和/或抗原攜帶細胞與重建動物接觸。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述免疫缺陷非人類動物與FL細胞接觸前接受亞致死照射。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述小鼠與所述FL細胞接觸后5到18周小鼠第一次與抗原接觸。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述小鼠與抗原接觸高達10次。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述收集的細胞是人CD19+或CD22+細胞。本發明包括本發明的方法，其特征在于所述細胞通過雜交瘤技術建立。本發明包括本發明的方法，其特征在于融合伴侶細胞系是MFP-2、HK_U8、K6H6/B5 或Karpas 707細胞系。本發明包括用于產生多數人類B細胞的方法，所述B細胞產生完全多數的針對抗原的人抗體，所述方法的特征在于使新生免疫缺陷的非人類動物與FL細胞接觸來產生免疫重建動物，隨后使所述重建動物與抗原接觸，收集所述人類B細胞，產生所述完全多數的抗體。本發明包括非人類動物用于產生本發明的產生抗原的無限增殖細胞的用途。如果所述無限增殖細胞是雜交瘤細胞，用于雜交瘤產生的一種融合伴侶是來自所述移植并重建動物的人類B細胞，另一種融合伴侶是例如來自人、嚙齒動物或其它動物的骨髓瘤細胞。或者通過EBV轉化產生無限增殖的移植并重建的B細胞。本發明包含多數的人類B細胞，所述人類B細胞產生完全多數的針對人類蛋白質的人抗體。
本發明包含無限增殖細胞的組合物，其提供完全多數的針對人類蛋白質的人抗體。本發明包含重建動物用于產生多數無限增殖B細胞的用途，所述B細胞產生完全多數的針對人類蛋白質的人抗體。本發明包括在非人類動物中發生并產生單克隆人抗體的方法，所述抗體針對人類蛋白質(包括片段)，其與所述非人類動物的對應蛋白質有至少80% (BLAST)的同源性。此實例是CXCR5。人和鼠的CXCR5有84%的同源性。本發明因此提供方法來產生針對高保守蛋白質或蛋白質區的人抗體，即使所述蛋白質或其片段在人和所述非人類動物間具有至少 95%或更高的同源性或甚至100%的同源性。因此本發明的另一目標是對人類蛋白質特異的單克隆人抗體，所述人類蛋白質與非人類動物，優選小鼠、大鼠和/或兔的對應蛋白質具有至少95%，優選98%并甚至100% 同源性(BLAST)。本發明的優選目標是對人蛋白特異的單克隆人抗體，所述人類蛋白質與對應鼠類(小鼠)蛋白質具有至少95%，更優選98%并甚至100%同源性(BLAST)。本發明包括用于重組產生抗體的方法，其特征在于使新生免疫缺陷的非人類動物與FL細胞接觸，隨后使所述非人類動物與抗原接觸，從所述非人類動物中收集產生針對所述抗原的人抗體的人細胞，并分離所述抗體，將可變區測序，構建編碼重鏈和/或輕鏈至少 CDRs的與人恒定鏈組合的表達載體，在合適的宿主細胞中表達所述載體并從所述宿主細胞或發酵上清液中分離所述抗體(免疫活性蛋白)。本發明包含用于重組產生抗體的方法，其特征在于使新生免疫缺陷的非人類動物與FL細胞接觸，隨后使所述非人類動物與抗原接觸，從所述非人類動物中收集產生針對所述抗原的人抗體的人細胞，并從產生人抗體的所述人細胞中分離mRNA，產生抗體特異性 cDNA(例如通過使用免疫球蛋白特異的引物)，構建編碼重鏈和/或輕鏈至少CDRs與人恒定鏈組合的表達載體，在合適的宿主細胞中表達所述載體并從所述宿主細胞或發酵上清液中分離所述抗體(免疫活性蛋白)。本發明包括用于選擇產生人抗體的無限增殖細胞的方法，所述人抗體顯示出特異性結合抗原，所述方法的特征在于提供來自非人類動物脾的產生完全多數人抗體的多數人類B細胞，將所述細胞或其亞群與無限增殖的骨髓瘤細胞融合或通過EBV轉化使所述B細胞或亞群無限增殖，并選擇產生人抗體的雜交瘤細胞，所述人抗體特異性結合所述抗原。本發明包括用于選擇產生抗體的無限增殖細胞的方法，所述抗體以至少1. 5μ g/ ml的量對抗原顯示出至少10_6mOl/l的特異結合親和力，所述方法的特征在于提供來自非人類動物脾的產生完全多數人抗體的多數人類B細胞，將所述細胞或其亞群與無限增殖的骨髓瘤細胞融合或通過EBV轉化使所述B細胞或亞群無限增殖，并選擇產生抗體的雜交瘤細胞，所述抗體對抗原顯示出至少10_6mOl/l的特異結合親和力。優選地分離的抗體的量是至少1. 5 μ g/ml。優選地所述抗體對所述抗原顯示出至少10_9mol/l的特異結合親和力。發明描述術語完全多數的人抗體或人免疫球蛋白基因指抗體或免疫球蛋白基因，其包含或編碼-來自2號染色體(76個基因，其中31到35個是有功能的)上2pll中至少20個，優選31到33個κ基因的κ鏈，-來自22號染色體22qll位置中至少20個，優選四到33個λ基因和J基因的 λ鏈；(有4到5個功能性λ鏈基因，λ J基因在每種基因之前)，和-來自14號染色體(11個重鏈基因，其中9個是有功能的并且分別對應9個重鏈同種型μ、δ、Yl、Υ2、γ3、γ4、α 1、α2禾口 ε)上14q32中的至少5個，優選9個重鏈
基因的重鏈。例如，抗原可以是來自人類的物質，像人類蛋白質、激素、腫瘤相關的糖脂(例如 US 5，091，178)或參與天然發生的人類代謝的另一物質。抗原也可以是健康人類耐受的來自非人類的物質，使得此人類不以可檢測到的方式產生針對此類抗原的抗體。術語人類蛋白質(其包括多肽)指人類的任意蛋白質，其是天然耐受的或在自身免疫疾病中被攻擊的。術語人類蛋白質根據本領域技術人員的知識也包括所述蛋白質的片段，其能夠在本發明合適的非人類動物中誘導對此類人類蛋白質特異的抗體。此類片段可以包括在例如更大蛋白質中，例如眾所周知可以用來自另一物種像小鼠的同源蛋白質通過免疫來誘導針對人類蛋白質的抗體。人類蛋白質優選為耐受性人類蛋白質。術語耐受性人類蛋白質指人類的蛋白質，其為天然耐受性的并在自身免疫疾病像古德帕斯丘綜合征、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫癜、重癥肌無力(MG)、多發性硬化(MQ、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)或甲狀腺毒癥(格雷夫斯病)中不受攻擊的。例如，人類蛋白質可以是跨膜分子(例如受體)或配體如生長因子。示例性抗原包括分子如腎素；生長激素，生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白； α -1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促濾泡素；降鈣素；黃體生成素； 胰高血糖素；凝血因子如因子VIII、因子IX、組織因子(TF)，和血管性血友病因子；抗凝血因子如C蛋白；心鈉素；肺表面活性物質；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α和β ；腦咖啡酶； RANTES(激活時受調節，通常T細胞表達和分泌)；人類巨噬細胞炎性蛋白質(MIP-1-α)； 血清清蛋白如人血清清蛋白；Muellerian抑制物質；松弛素A鏈；松弛素B鏈；前松弛素； 小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質，如β內酰胺酶；DNA酶；IgE;細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4 ；抑制素；激活蛋白；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子受體；A蛋白或D蛋白；類風濕因子；神經營養因子如骨衍生的神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、-4、-5或-6 (ΝΤ-3、ΝΤ-4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)，或神經生長因子如NGF_b ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)如 TGF-α 和 TGF-β，包括 TGF-bl、TGF_b2、TGF_b3、TGF_b4 或 TGF_b5 ；腫瘤壞死因子(TNF)如TNF-α或TNF-β ；胰島素樣生長因子I和II ；胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD 19、⑶20、CD22和CD40 ；促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素α、β和Y ；集落刺激因子(CSFs)，例如 M-CSF、GM-CSF 和 G-CSF ；白細胞介素(ILs)，例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL_7、 IL-8、IL-9和IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白質；衰變加速因子；病毒抗原例如，AIDS外殼的部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整聯蛋白如⑶11a、 CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ；腫瘤相關的抗原如 HER2、HER3 或 HER4 受體，和任何上面列出蛋白質的片段。其它人類蛋白質是ErbB受體家族的成員如EGF受體、HER2、 HER3或HER4受體；腫瘤壞死受體超家族的成員，包括DR5 ；前列腺干細胞抗原(PSCA)；細胞黏著分子如 LFA-I、Macl、pl50. 95、VLA_4、ICAM-I、VCAM、α 4/β 7 整聯蛋白，和 α ν/β 3 整聯蛋白包括其α或β亞基(例如抗⑶11a、抗⑶18或抗⑶lib抗體)；組織因子(TF) ； α 干擾素(α IFN)；白細胞介素，如IL-8 ；IgE ；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(OB)受體或mpl受體。
術語無限增殖細胞指雜交瘤細胞或通過其它方法，像EDV轉化、端粒酶置換或逆轉錄病毒無限增殖化使其無限增殖的細胞。
如此處所用的術語動物指非人類動物，優選嚙齒類動物并尤其優選小鼠或大鼠。
優選地，所述非人類動物是嚙齒類動物并更優選地是小鼠、大鼠或兔。進一步優選的是所述小鼠是Rag2-/_ y C-/-、裸Rag 2_/_、NOD或SCID米色小鼠并且所述大鼠是裸大鼠°
SCID米色是攜帶scid突變的雙突變小鼠，所述scid突變由于V(D) J重組中的缺陷引起T和B淋巴細胞的缺失。它也攜帶米色突變，其導致細胞毒性T細胞和巨噬細胞缺陷及NK細胞功能的選擇性缺損。SCID米色小鼠是接受人類造血細胞的潛在改良模型。
優選的NOD 小鼠是 NOD. Cg-Ragltmlmom Prf ltmlsdz/SzJ, NOD. Cg-Prkdcscid I12rgtmlffJ1/ SzJ, NOD. 129S7(B6)-RagltmlM。m/J、NOD. Cg-Prkdcscid B2mtmlUn7j 和 NOD. CB17-Prkdcscid/SzJ0 每一品種缺少成熟的T和B細胞并且沒有可檢測的NK細胞毒素活性。品種支持用人類造血細胞增強移植，具有相對較長的壽命并且顯著地對輻射更有抵抗力。
Rag2對在T和B細胞中產生功能性抗原受體的V (D) J基因重排是必要的；純合的 Rag2-/_突變體沒有成熟的有功能的T和B細胞。常見的Y (Yc)KO小鼠缺少許多細胞因子包括11^-2、11^-4、11^-7、11^-9和11^-15的功能受體。結果淋巴細胞發育受到很大損害。所述小鼠缺少自然殺傷(NK)細胞并僅產生少量的T和B細胞。
如此所用，術語人抗體包括具有可變和恒定區(結構域)的抗體，所述可變和恒定區因為它們與確定的人類種系免疫球蛋白序列具有高序列相似性或同一性，所以可以被分配到這些種系序列。人抗體包括抗體的多種形式，優選單克隆抗體，包括但不局限于完整抗體、單個重鏈或輕鏈、抗體片段、類別改變的抗體和遺傳改造的抗體(變體或突變抗體)，只要保留了本發明的特征性性質。尤其優選的是重組人抗體。如此處所用的術語“單克隆抗體”指所有具有基本上相同氨基酸序列的抗體分子制劑。
如此處所用，術語“重組人抗體”旨在包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的所有人抗體，如從宿主細胞如NS0、HEK 293或CHO細胞中分離的抗體，所述宿主細胞包含能夠表達所述抗體的重鏈和/或輕鏈的重組表達載體并且該載體能被轉染到此類宿主細胞中。此類重組人抗體具有重排形式的可變和恒定區。本發明的重組人抗體已經在體內進行了體細胞高變。因此，重組抗體VH和VL區的氨基酸序列是可以分配給特定人類種系VH和 VL序列的序列，但在體內可以不天然存在于人抗體種系所有組成成分中。
如此處所用“可變區”(輕鏈(VL)的可變區，重鏈(VH)的可變區)表示直接參與抗體與抗原結合的每一對輕鏈和重鏈。可變的人輕鏈和重鏈結構域具有相同的一般結構并且每一結構域包含4個構架區(FR)，其序列高度保守，連接有3個“高變區”(或互補性決定區，⑶Rs)。構架區采取β片層構象并且⑶Rs可以形成連接所述β-層結構的環。每一條鏈中的CDRs通過構架區保持在它們三維結構中并與來自其它鏈的CDRs —起形成抗原結合位點。抗體重鏈和輕鏈CDR3區，優選重鏈CDR3在本發明抗體的結合特異性/親和力中起特別重要的作用，并因此提供了本發明的另一目標。
當在此處使用時，術語“高變區”或“抗體的抗原結合部分”指負責抗原結合的抗體的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補性決定區”或“⑶Rs”的氨基酸殘基。“構架”或 “FR”區是除了如此處定義的高變區殘基之外的那些可變結構域區。因此，抗體的輕鏈和重鏈包含從N-到C-末端的結構域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根據Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. ,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)的標準定義來確定 CDR 和 FR 區。
“恒定結構域”不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應功能。根據它們重鏈恒定區的氨基酸序列，抗體或免疫球蛋白被分為如下類別IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM，并且這些的若干可以進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，IgAl 和IgA2。對應不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區分別被稱作μ、δ、Υ、α和ε。提供以下實施例、參考文獻、序列表和圖來幫助理解本發明，在所附權利要求中給出的其真實范圍。 應理解可以在不背離本發明精神的情況下對提出的方法進行修改。
從抗體產生細胞、腹水和/或上清液中分離抗體可以根據本領域中已知的方法像層析或透析來進行。例如可以使用選自免疫親和純化、硫酸銨沉淀、A蛋白/G蛋白純化、離子交換層析、凝膠過濾和/或硫酸銨沉淀的一種或更多種方法來純化抗體。此類方法在 Nau, D. R. , Optimization of monoclonal antibody purification, In :Techniques in Protein Chemistry, Hugli, T. ('ΦΜ ) Academic Press, New York, 1989, M 339-347 ； Coligan, J. E.等人(編輯)，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. (2005)中有描述。
除了雜交瘤產生，可以使用備選方法產生本發明的抗體。此類方法例如基于抗體的核酸序列的鑒定。通常鑒定可變區、CDR區或甚至僅重鏈CDR3區的序列就足夠了。優選地，從抗體產生細胞庫中分離mRNA并用于在合適表達載體中構建編碼此類區域的cDNA庫。 將cDNA文庫轉染到宿主細胞如NSO或CHO中并篩選特異性抗體的產生并鑒定和分離特異的克隆并用于在沒有雜交瘤產生的情況下產生抗體。
FL細胞是能夠發育成多種血細胞類型例如B細胞、T細胞、粒細胞、血小板和紅細胞的干細胞。人類造血胎兒肝干細胞通常表達表面抗原⑶31、⑶34、⑶117 (c-kit)和/或 ⑶133。根據本發明優選使用表達⑶133的FL細胞。也可以使用前體細胞(即胚胎干細胞)作為FL細胞，，所述前體細胞用細胞因子處理后發育成為FL細胞。
表達⑶133的FL細胞可以從人類胎兒肝臟中分離并通過⑶133譜系，優選通過免疫磁性分離方法例如Miltenyi “MACS separation system”進一步分離。分離FL細胞的另一優選方法包括用生物素綴合的CD133抗體標記單核細胞并回收CD133陽性干細胞群的額外步驟。
在X染色體上攜帶細胞因子受體共有Y鏈(Yc)無效突變的小鼠已經由 DiSanto，J. P.等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 92(1995)377-381 描述。γ c+ 雌性可以與突變純合的雄性雜交，所述突變破壞了 RAG2基因Ghinkai，Y.等人，Cell 68 (199 855-867)。RAG2缺失雜合及Y c缺失半合子的Fl雄性可以與γ c〃-RAG2v+雌性回交。所獲后代的RAG2基因型可以通過tail DNA PCR來確定(Horton，R. Μ.等人， BioTechniques 19 (1995) 690-691)。將 RAG2 雜合子育種來產生 Y C+RAG2+ 雌性和 γ c" yRAG2^雄性小鼠(Y c7RAG2_)。這些小鼠具有U901a、Balb/c和C57BL/6的混合背景。
本發明的免疫重建通過將合適量的人FL細胞移植到新生的并預照射的免疫缺陷型動物例如小鼠或大鼠的肝臟中發生。
可以用純化的或濃縮的抗原制劑、編碼所述抗原的核酸和/或表達所述抗原的細胞，通過免疫本發明免疫重建的非人類動物，優選免疫重建的嚙齒類動物，最優選地免疫重建的大鼠或小鼠來產生本發明的人單克隆抗體。然后獲得所述動物的B細胞(例如脾的B 細胞)并將其與合適的人融合伴侶，像骨髓瘤細胞融合來形成無限增殖的雜交瘤細胞，其通過與合適的人融合伴侶，像骨髓瘤細胞融合或通過用例如EBV將所述細胞無限增殖化來分泌針對抗原的人單克隆抗體。例如，可溶性抗原或其片段任選綴合到其它分子上，并用作產生抗體的免疫原。對于跨膜分子，如受體，這些受體的片段(例如受體的胞外結構域)可以用作免疫原。或者，表達跨膜分子的細胞可以用作免疫原。此類細胞可以來自天然來源 (例如癌細胞系)或可以是通過重組技術轉化過而表達跨膜分子的細胞。用于制備抗體的其它抗原和其形式對本領域的技術人員是顯而易見的。
優選地，免疫重建的非人類動物在第一次免疫時將是6-16周齡。例如，編碼目的抗原(例如CD20或HER3抗原)的DNA的純化或濃縮制劑可以用于經肌內免疫本發明免疫重建的非人類動物。可以用眶后取血獲得的血漿樣品在免疫方案過程中監測免疫反應。血漿可以通過ELISA來篩選，并且免疫重建的非人類可以用于對應B細胞的無限增殖化，所述免疫重建的非人類具有針對所述抗原的足夠效價的抗體。在處死并除去脾臟和淋巴結和外周血前用目的抗原經靜脈內對小鼠進行加強。發現每一種抗原需要進行2-3次融合。若干小鼠將用每一種抗原免疫。
可以分離小鼠淋巴細胞并基于標準方案使用PEG或電融合與人類的或異源骨髓瘤細胞融合來產生雜交瘤。電融合基于細胞膜可逆的結構變化，其由電場效應引起并應用于多種細胞，用于相同或不同來源的兩個或更多細胞的融合，包括它們的完整結構(核、 膜、細胞器、細胞質)來產生新的有活力的細胞。
然后篩選得到的雜交瘤用于產生抗原特異性抗體。例如，將來自免疫小鼠的脾和淋巴結衍生淋巴細胞的單細胞懸浮液融合到K6H6/B5非分泌型異源骨髓瘤細胞(ATCC、CRL 1823)。將約2 X IO5的細胞涂布在平底微量滴定板中，隨后在選擇培養基上進行約兩周的溫育ο
然后通過ELISA篩選各孔中針對抗原的人單克隆抗體(例如IgG)。通常10-14天后，一旦大范圍的雜交瘤生長出現，就分析培養基。將分泌抗體的雜交瘤重新涂布，再次篩選，并且如果對針對抗原的人單克隆抗體仍然呈現陽性，可以通過有限稀釋進行亞克隆至少兩次。然后在體外培養穩定的亞克隆以在組織培養基中產生抗體用于表征。
抗原可以通過任何合適的方法引入動物中。優選地，單獨或與合適免疫調節劑 (例如CFA)組合經脾內、靜脈內、腹膜內、皮內、肌內、皮下免疫動物。每一種抗原的劑量優選在1-500 μ g的范圍內。
優選地，本發明的方法包括在最后一次注射后 -7 天提供給動物抗原1-500 μ g 的加強劑量的額外步驟。優選地，加強所述動物1到5次。
動物的免疫可以在有或沒有藥物載體的情況下進行。合適載體是例如IFA、 Al3 (OH) 4、Abisco。
此外，這些載體可以作為免疫刺激劑(“佐劑”)起作用。除了藥物載體，動物的免疫可以在有或沒有佐劑的情況下進行。
增強組合物有效性的優選佐劑包括但不局限于例如CFA、IFAai3(OH)4^Abisco0
用于本發明的優選的抗體產生細胞包括B細胞。可以通過從動物中去除免疫系統中任何合適的細胞組分來回收用于本發明的這些抗體產生細胞。優選地，通過從動物中去除脾臟、淋巴結、外周血或骨髓或其部分來回收抗體產生細胞。


圖1在移植后第15周對重建小鼠外周血的流式細胞分析。
人類造血細胞移植。直方圖顯示的是三種代表性動物的活的門控外周血細胞的覆蓋圖，所述代表性動物在重建后15周用抗人⑶45-FITC mAb染色(填充區域)，或同一動物用同種型相匹配的、無關的對照mAb (暗線)的背景染色，其中所述對照mAb用作產生覆蓋直方圖統計的標準直方圖。統計代表指定區域(Ml、iC)中事件相比于門內事件總數目的數目和百分比。顯示了平均熒光強度。
A
分子直方圖
文件Probe. 002
X 參數抗人 CD45-FITC
標準直方圖
文件Probe. 001
X 參數抗人 CD45-FITC
權利要求
1.從免疫缺陷型非人類動物中產生人單克隆抗體的方法，所述方法包括將新生免疫缺陷型非人類動物與人類胎兒肝干細胞(FL細胞)接觸來產生免疫移植的非人類動物(重建動物)，隨后將所述重建動物與抗原接觸，從所述重建動物中收集產生針對所述抗原的人抗體的人細胞，并從所述抗體產生細胞中分離所述抗體。
2.權利要求1的方法，其特征在于所述免疫重建的非人類動物是嚙齒類動物。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于所述重建的非人類動物是小鼠或大鼠。
4.權利要求1到3的方法，其特征在于所述重建小鼠是Rag2+y c+、裸Rag 2-/-、N0D 或SCID米色小鼠。
5.權利要求1到4的方法，其特征在于所述FL細胞是人類造血胎兒肝干細胞(HFL細胞)。
6.權利要求1到5的方法，其特征在于所述FL細胞是HFL細胞和人類非造血胎兒肝干細胞的組合。
7.權利要求1到6的方法，其特征在于所述抗體產生細胞是人的B細胞。
8.權利要求1到7的方法，其特征在于所述抗原是多肽。
9.權利要求1到8的方法，其特征在于所述抗原作為抗原、抗原片段、MHC/肽復合體、 編碼抗原的DNA和/或抗原攜帶細胞與所述重建動物接觸。
10.權利要求1或9的方法，其特征在于所述重建的非人類動物在與所述FL細胞接觸前被亞致死照射。
11.權利要求1到10的方法，其特征在于所述小鼠在與所述FL細胞接觸后5到18周第一次與所述抗原接觸。
12.權利要求1到11的方法，其特征在于所述小鼠與所述抗原接觸高達10次。
13.權利要求1到12的方法，其特征在于所述收集的細胞是人⑶19+或⑶22+細胞。
14.權利要求1到13的方法，其特征在于所述細胞通過雜交瘤技術建立。
15.權利要求1到14的方法，其特征在于所述融合伴侶細胞系是MFP-2、HK-U8、K6H6/ B5或Karpas 707細胞系。
16.用于產生多數人類B細胞的方法，所述人類B細胞產生多數針對抗原的人抗體， 所述方法的特征在于將新生免疫缺陷的非人類動物與FL細胞接觸來產生免疫重建動物， 隨后將所述重建動物與抗原接觸，從所述非人類動物中收集所述產生多數抗體的人類B細胞。
17.多數人類B細胞，其產生完全多數的針對人類蛋白質的人抗體。
18.無限增殖B細胞的組合物，其提供完全多數的針對人類蛋白質的人抗體。
19.重建動物用于產生多數無限增殖B細胞的用途，用于產生完全多數的針對人類蛋白質的人抗體。
20.重組產生抗體的方法，其特征在于將新生免疫缺陷的非人類動物與FL細胞接觸， 隨后將所述非人類動物與抗原接觸，從所述非人類動物中收集產生針對所述抗原的人抗體的人細胞，并分離所述抗體，將可變區測序，構建編碼重鏈和/或輕鏈至少CDRs與人恒定鏈組合的表達載體，在合適的宿主細胞中表達所述載體并從所述宿主細胞或發酵上清液中分離所述抗體(免疫活性蛋白)。
21.重組產生抗體的方法，其特征在于將新生免疫缺陷的非人類動物與FL細胞接觸，隨后將所述非人類動物與抗原接觸，從所述非人類動物中收集產生針對所述抗原的人抗體的人細胞，并從產生人抗體的所述人細胞中分離mRNA，產生抗體特異性cDNA (例如通過使用免疫球蛋白特異性引物)，構建編碼重鏈和/或輕鏈至少CDRs與人恒定鏈組合的表達載體，在合適的宿主細胞中表達所述載體并從所述宿主細胞或發酵上清液中分離所述抗體 (免疫活性蛋白)。
22.包含完全多數的針對抗原的人免疫球蛋白基因的多數人類B細胞用于產生針對所述抗原的單克隆抗體的用途，其特征在于所述多數B細胞具有用于產生雜交瘤細胞的至少 IO6個B細胞/ml的濃度。
23.用于選擇產生人抗體的無限增殖細胞的方法，所述人抗體顯示出特異性結合抗原， 所述方法的特征在于提供來自非人類動物脾的產生完全多數人抗體的多數人類B細胞，將所述細胞或其亞群與無限增殖骨髓瘤細胞融合或通過EBV轉化使所述B細胞或亞群無限增殖，并選擇產生人抗體的雜交瘤細胞，所述人抗體顯示出特異性結合所述抗原。
24.選擇產生抗體的無限增殖細胞的方法，所述抗體顯示出對抗原至少10_6mOl/l的特異結合親和力，所述方法的特征在于提供來自非人類動物的脾的產生完全多數人抗體的多數的人類B細胞，將所述細胞或其亞群與無限增殖的骨髓瘤細胞融合或通過EBV轉化使所述B細胞或亞群無限增殖，并選擇產生抗體的雜交瘤細胞，所述抗體顯示出對抗原至少 10_6mol/l的特異結合親和力。
全文摘要
本發明涉及從免疫缺陷型非人類動物中產生人單克隆抗體的方法，所述方法包括將新生免疫缺陷型非人類動物與人類胎兒肝干細胞(FL細胞)接觸來產生免疫移植的非人類動物(重建動物)，隨后將所述重建動物與抗原接觸，從所述重建動物中收集產生針對所述抗原的人抗體的人細胞，并從所述抗體產生細胞中分離所述抗體。
文檔編號C12N15/13GK102532318SQ20111043207
公開日2012年7月4日 申請日期2007年5月9日 優先權日2006年5月11日
發明者A·利夫克, B·穆勒-貝克曼, T·施奈澤爾, V·利夫克 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司