專利名稱：旋毛蟲(chóng)Ts27基因、其編碼蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種旋毛蟲(chóng)基因，具體涉及一種旋毛蟲(chóng)Ts27基因、其編碼的蛋白，以及所述基因和蛋白的用途。
背景技術(shù)：
旋毛形線蟲(chóng)(Trichinella spiralis，簡(jiǎn)稱旋毛蟲(chóng))，可感染人及150多種動(dòng)物，它所引起的旋毛蟲(chóng)病是一種人畜共患寄生蟲(chóng)病，呈全球性分布，嚴(yán)重地威脅了人類健康并對(duì)畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。旋毛蟲(chóng)生活史簡(jiǎn)述如下當(dāng)人或動(dòng)物宿主生食或半生食含旋毛蟲(chóng)囊包的肉類(豬肉、狗肉等)，囊包內(nèi)幼蟲(chóng)在胃液、腸液作用下逸出并在小腸內(nèi)發(fā)育為成蟲(chóng)。雌、雄蟲(chóng)交配后雌蟲(chóng)產(chǎn)新生幼蟲(chóng)。新生幼蟲(chóng)侵入腸粘膜淋巴管或靜脈，隨淋巴和血循環(huán)到達(dá)宿主橫紋肌繼續(xù)發(fā)育。旋毛蟲(chóng)的致病過(guò)程分為三期侵入期、幼蟲(chóng)移行及囊包形成期， 即在該蟲(chóng)生活史的每個(gè)環(huán)節(jié)均可使宿主致病。旋毛蟲(chóng)病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，診斷較困難，給及時(shí)的治療造成一定難度，因此該病的免疫診斷及預(yù)防成為當(dāng)務(wù)之急。目前常用的旋毛蟲(chóng)病的診斷方法有兩種一種是病原學(xué)檢查即肌肉活組織檢查，從患者肌肉組織中查出旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)是最準(zhǔn)確的診斷方法。但因受摘取肌肉組織部位局限性的影響，在發(fā)病早期和輕度感染者肌肉活檢陽(yáng)性率不高。而且由于是有創(chuàng)檢查，病人很難接受此種檢查方法。第二種是血清學(xué)檢查，檢測(cè)IgG水平。用于檢測(cè)抗旋毛蟲(chóng)抗體的血清學(xué)方法有間接血凝試驗(yàn)(IHAT)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)、乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)、免疫酶染色試驗(yàn)(IEST)、酶聯(lián)免疫印漬技術(shù)(ELIB)及ELISA等。其中ELISA 因其具有經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化、敏感性比較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在是常規(guī)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)感染的血清學(xué)方法。目前在ELISA檢測(cè)中常用的抗原有肌幼蟲(chóng)排泄-分泌(excretory-secretory， ES)抗原、不同蟲(chóng)期蟲(chóng)體抗原或重組蛋白如53kDa和人工合成的泰威糖(tyvelose，3，6_雙脫氧己糖)抗原等。但ES和蟲(chóng)體抗原與并殖吸蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)和囊尾蚴等存在交叉反應(yīng)，故特異性較差。而重組蛋白雖然能夠提高特異性，但其敏感性不高。由于旋毛蟲(chóng)病原體不能在體外大量傳代培養(yǎng)，限制了抗原的獲取；加之旋毛蟲(chóng)抗原的復(fù)雜性、多樣性，造成目前尚無(wú)很好的高敏感度高特異性的抗原作為診斷候選抗原。

發(fā)明內(nèi)容
為了獲得更好的診斷候選抗原，發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)尋找并克隆了旋毛蟲(chóng)抗原新基因Ts27基因，通過(guò)重組表達(dá)和純化獲得了 Ts27基因的重組蛋白，進(jìn)一步獲得了特異性抗體，并用實(shí)驗(yàn)證明Ts27基因編碼蛋白具有良好的免疫原性和特異性。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的多核苷酸分子，其含有選自以下的核苷酸序列a. SEQ ID NO 1所示序列或SEQ ID NO 1所示序列中的編碼序列；b.與a的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a的核苷酸序列不同的序列；c.在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
3
d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列；和f.與上述a e所示序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為SEQ ID NO 1所示序列或其編碼序列，即SEQ ID NO 1序列中第1位至第693位堿基所示的序列。本發(fā)明的另一方面涉及分離的蛋白，其氨基酸序列由本發(fā)明的多核苷酸分子編碼。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的另一方面涉及含有本發(fā)明多核苷酸分子的重組載體，和含有所述重組載體的重組細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組載體為將Ts27基因片段插入 PET-28a(+)所獲得的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為將本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21株所得到的細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面涉及抗體，其可特異性地結(jié)合本發(fā)明的蛋白，所述抗體可以為單克隆抗體或多克隆抗體。所述單克隆或多克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的免疫方法制備。例如可從被免疫動(dòng)物的血清中得到和分離多克隆抗體，并使用常規(guī)方法試驗(yàn)其對(duì)抗原的特異性。或者，也可使用由培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)制備并分離單克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將Ts27基因重組蛋白免疫小鼠，可以獲得高滴度的抗體血清，得到針對(duì)Ts27基因編碼蛋白的多克隆抗體。本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，其含有本發(fā)明的蛋白，或者本發(fā)明所述的抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的另一方面涉及寡核苷酸分子，其為根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸分子的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物或探針，所述引物能夠擴(kuò)增多核苷酸分子，所述探針能夠特異性地與多核苷酸分子雜交。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸分子為引物，所述引物序列為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示序列。本發(fā)明的另一方面涉及一種試劑盒，其包含本發(fā)明所述的多核苷酸分子、本發(fā)明所述的蛋白、本發(fā)明所述的抗體或本發(fā)明所述的寡核苷酸分子。本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的多核苷酸分子、蛋白、抗體或寡核苷酸分子用于制備診斷動(dòng)物或人中旋毛蟲(chóng)感染的檢測(cè)試劑中的用途。可以用上述的多核苷酸分子作為診斷試劑，檢測(cè)被旋毛蟲(chóng)感染的動(dòng)物體液或組織樣品中旋毛蟲(chóng)特異性多核苷酸。上述的蛋白可用作診斷試劑，以檢測(cè)新近被旋毛蟲(chóng)感染的、或已被旋毛蟲(chóng)感染的動(dòng)物血液或血清樣品中旋毛蟲(chóng)特異性抗體的存在；或者可用作抗原產(chǎn)生旋毛蟲(chóng)特異性抗體 (例如單克隆或多克隆抗體)，可以使用所述抗體作為診斷試劑，例如以Western印跡檢測(cè)法等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)篩選動(dòng)物細(xì)胞、組織或體液樣品中的旋毛蟲(chóng)特異性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的寡核苷酸分子可用于疾病的鑒別診斷，例如可使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)動(dòng)物組織或體液等樣品中旋毛蟲(chóng)特異性多核苷酸分子的存在。特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生可支持旋毛蟲(chóng)感染的診斷，而缺少擴(kuò)增的產(chǎn)物則可能指示沒(méi)有感染。本發(fā)明的核苷酸序列可以用免疫篩選從旋毛蟲(chóng)cDNA基因文庫(kù)中獲得。本發(fā)明還涉及該序列的變異體，例如一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、添加或替換，但不改變所編碼的蛋白質(zhì)的功能。變異體可以是天然存在的等效變異體或非天然存在的變異體。本發(fā)明的蛋白可以通過(guò)構(gòu)建上述基因的原核或真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到適合的宿主細(xì)胞中，從培養(yǎng)物中純化蛋白來(lái)制備。本發(fā)明的蛋白包括SEQ ID NO :2所示蛋白，以及具有等效功能的它的衍生物、片段或類似物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，發(fā)明人利用分子生物學(xué)技術(shù)，如cDNA文庫(kù)免疫篩選、分子克隆、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、DNA序列測(cè)定、Southern雜交、Western印跡雜交法，克隆鑒定了旋毛蟲(chóng)抗原新基因Ts 27基因；利用基因表達(dá)及免疫學(xué)技術(shù)獲得該基因的重組蛋白及高效價(jià)免疫血清；并對(duì)該蛋白的免疫原性、敏感性和特異性進(jìn)行了分析。具體達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.在本發(fā)明中采用cDNA文庫(kù)免疫篩選獲得該基因的cDNA序列。長(zhǎng)1096bp，編碼的蛋白質(zhì)含231個(gè)氨基酸。2.旋毛蟲(chóng)Ts27基因的231個(gè)氨基酸重組蛋白在大腸桿菌BL21株中獲得表達(dá)并純化。3.旋毛蟲(chóng)Ts27基因重組蛋白免疫動(dòng)物獲高滴度抗Ts27免疫血清。4.旋毛蟲(chóng)Ts27基因重組蛋白為感染旋毛蟲(chóng)的病人血清、病豬血清、病兔、病鼠血清所識(shí)別。并與Ts27基因重組蛋白免疫血清發(fā)生反應(yīng)。發(fā)明的有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了旋毛蟲(chóng)Ts27基因cDNA ；獲得了純化的Ts27基因重組蛋白并進(jìn)行了免疫學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)證明Ts27基因編碼蛋白具有較好的免疫原性、敏感性和特異性，為旋毛蟲(chóng)病的診斷提供了新的候選抗原。


圖1Ts27基因重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1為蛋白分子量Marker， 泳道2為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白， 泳道3為IPTG誘導(dǎo)后的空載體全菌蛋白，
泳道4為IPTG誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化有Ts27基因的大腸桿菌的全菌蛋白， 泳道5為純化的Ts27基因重組蛋白， 箭頭所指為重組蛋白帶。
圖2鑒定Ts27基因重組蛋白的免疫特性的Western印跡圖，其中泳道1為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，
泳道2為純化的Ts27基因重組蛋白與旋毛蟲(chóng)病人血清反應(yīng)，
泳道3為純化的Ts27基因重組蛋白與感染旋毛蟲(chóng)的豬血清反應(yīng)，
泳道4為純化的Ts27基因重組蛋白與感染旋毛蟲(chóng)的兔血清反應(yīng)，
泳道5為純化的Ts27基因重組蛋白與感染旋毛蟲(chóng)的鼠血清反應(yīng)，
泳道6為純化的Ts27基因重組蛋白與Ts27基因重組蛋白免疫鼠血清反應(yīng)。
圖3鑒定Ts27基因重組蛋白敏感性和特異性的^iestern印跡圖，一抗為不同人血清，其中圖A中，泳道1-19為旋毛蟲(chóng)感染病人血清圖B中，泳道1-15為不同寄生蟲(chóng)病人血清(其中1-3為蛔蟲(chóng)病人血清；4_5鉤蟲(chóng)病人血清；6-7為鞭蟲(chóng)病人血清；8-10華支睪吸蟲(chóng)病人血清；11-13為血吸蟲(chóng)病人血清；14-15 為絳蟲(chóng)病人血清)圖C中，泳道1-10為健康人血清
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來(lái)分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C ； “中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性；0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說(shuō)，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來(lái)形成雜交體，例如， 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。為便于說(shuō)明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA (ρΗ8· 0)溶液預(yù)洗；在 50-65°C下在 5 X SSC 中雜交過(guò)夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過(guò)2-45個(gè)，或者不超過(guò)2-30個(gè)，或者不超過(guò)3-20個(gè)，或者不超過(guò)4-15個(gè)，或者不超過(guò)5-10個(gè)，或者不超過(guò)6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。通過(guò)一種多核苷酸進(jìn)行說(shuō)明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID N0:1的參考核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說(shuō)，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄校渲胁迦氲暮塑账峥啥噙_(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開(kāi)序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述寡核苷酸分子較好是至少長(zhǎng)約15nt，更好是長(zhǎng)約25nt，尤其是至少50nt，并可在高度嚴(yán)緊條件下與一種或多種上述多核苷酸分子雜交。所說(shuō)的高度嚴(yán)緊條件是在6XSSC/0. 5%焦磷酸鈉中洗膜，并且洗膜溫度對(duì)于長(zhǎng)約14堿基者為大約37°C，長(zhǎng)約17堿基者為大約48°C，長(zhǎng)約20堿基者為大約55°C，長(zhǎng)約23堿基者為大約60°C。本發(fā)明的較長(zhǎng)寡核苷酸分子的其他雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)確定。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸分子互補(bǔ)于本發(fā)明上述多核苷酸分子至少之一的一部分。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸分子”、“寡核苷酸分子”、“編碼序列，，等是指單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個(gè)或多個(gè)原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列，化學(xué)合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應(yīng)的反義鏈。生產(chǎn)和操作本文公開(kāi)的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的重組技術(shù)(參見(jiàn)Maniatis等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)，Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY :Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Irmis等(編)，1995，PCR策略，Academic Press, Inc.，San Diego ；和 Erlich (編)，1992，PCR 技術(shù)，牛津大學(xué)出版社，New York)完成。在本發(fā)明中，所述Ts27基因重組蛋白、Ts27基因編碼蛋白和Ts27蛋白為同一含義，均指根據(jù)Ts27基因cDNA序列中的編碼序列翻譯得到的蛋白。下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1旋毛蟲(chóng)Ts27基因的克隆及序列分析1.篩選血清的制備
收集旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)蟲(chóng)株ISS533)，實(shí)驗(yàn)豬(五指山小型豬)，20kg/頭， 共4頭，經(jīng)口感染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)20000條，新西蘭大耳白兔和BALB/C小鼠各2只，經(jīng)口分別感染旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)4000條和500條，4周后獲人工感染豬血清、感染兔血清以及感染鼠血清。經(jīng)ELISA測(cè)定血清滴度，感染豬血清達(dá)1 10000以上，感染兔血清以及感染鼠血清達(dá) 1 1000 以上。2.免疫篩選表達(dá)文庫(kù)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)λ ΖΑΡΙIcDNA表達(dá)文庫(kù)購(gòu)自劉明遠(yuǎn)(參考文獻(xiàn)《中國(guó)旋毛蟲(chóng)分離株成蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選》，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18 (2) :147-150.)。Ιμ 旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)λΖΑΡ II cDNA表達(dá)文庫(kù)，稀釋液加入600 μ 1宿主菌XLl-Blue 中，37°C，吸附20分鐘加入頂層瓊脂，倒置于42°C溫箱中培養(yǎng)至有針尖大小的噬菌斑長(zhǎng)出。 把硝酸纖維素膜鋪在平板上，放在37°C溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。第二天在室溫下將膜做好標(biāo)記，從平板上揭下，浸入實(shí)施例1制備的旋毛蟲(chóng)感染豬血清(1 10000)2小時(shí)，用TBST (TBS含 0. 5 % Tween20)洗膜3次，再把膜浸入二抗工作液_1 10000辣根過(guò)氧化物酶-兔抗豬 IgG (Sigma公司)2小時(shí)。將膜浸入顯色液DAB中(Pierce公司)，顯色充分后，加入H2O終止反應(yīng)。用1 10000實(shí)施例1制備的旋毛蟲(chóng)感染豬血清進(jìn)一步篩選獲得的陽(yáng)性噬菌斑， 經(jīng)三輪復(fù)篩，獲得74個(gè)陽(yáng)性噬菌斑。隨后進(jìn)行陽(yáng)性噬菌斑的體內(nèi)剪切。將500 μ 1宿主菌 XLl-Blue和500 μ 1篩選得到的陽(yáng)性噬菌斑液(可以根據(jù)情況改變加入量)加入至5ml的 NZY Broth中，37°C振搖培養(yǎng)4 釙！·，再加入3滴氯仿，37°C，振搖培養(yǎng)15min，3000rpm, 4°C 離心15min后，用1. 5ml離心管分裝上清，每管加5 μ 1氯仿，4°C保存?zhèn)溆谩?00 μ 1宿主菌XL1-Blue、150y 1上述擴(kuò)增后噬菌體上清和5 μ 1輔助噬菌體混合，37°C水浴15min ；加入:3ml的LB液體培養(yǎng)基，37°C，振搖培養(yǎng)!3hr ；65°C水浴20min ；4000rpm，4°C離心15min后取上清分裝，即為噬菌體體內(nèi)剪切后的上清。取4 μ 1體內(nèi)剪切后的上清加入至200 μ 1宿主菌SOLR中，37°C，水浴15min ；涂布于平板上，進(jìn)行藍(lán)白篩選，白色菌落為陽(yáng)性克隆。經(jīng)PCR 鑒定后，選取1^27克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定。3. Ts27cDNA序列與編碼的氨基酸分析Ts27基因的cDNA長(zhǎng)1096bp，編碼231個(gè)氨基酸，其理論分子量為沈.2KD。以下為 Ts27基因的cDNA序列(SEQ ID NO 1)和其表達(dá)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。GAAAATATGGCACATAGCAATGAAAATGtTGACtTTATGaAATATGCaAtTGAGGAgGCTCCAGCTGCG gCATTTTACATTCCAGAATATTTTAaTGACaAGGAGGAAGAGTTTTATACACAGCAGATATATTCAGCTCCCGCTCC GAAATGGACTAGCCTTAGTGCTAGGCGtTTGCTAAATTACGGAGGTATTGTTGGCAAAAAGGGACTCATTCAAGTTA ATGATATACCTTTCTGGTTACGTGCACTGATGAAGCGGGTTTGTAAGTCAGTACCATTGTTTACTCCAGGTAATGAA CCGAATCATGTTCTAATCAATGAATATTTACCTGGTCAAGGAATTATGCCTCATACTGATGGGCCAGCTTATTTTCC TGTGGTTGCCAACATTACTTTGGGGAGTCATACTGTGCTTGATCTCTATGAAACAGAAACGAGAAATTATATTGGAT CATTTCTCCTTGAACGGAAAAGCTTATTAATAATTTCTGAGCAGCTGTATGTAAATTTCCAGCATGGTATCAAAGAA GTTAAAGAAGATGAAATCAGTGAAAAAATACTAAACTATAAATTATGCTCAGAAAAGTATAGTAGCGAAGAAAAAAT TCCTCGTAAAACACGAATATCCATTACAATTCGAAACGTGCCGAAAACGATTACAGCTTTTACAGCTGTTTTCAATA ACCGTGCATGAATACGCATGGGATGCTGGATTCCAGTGAAAATTTTACCGAGAGAGACTATCTCGGTTATTATTAAA GTTCGTTTCTCATTCGATGTTCATTGCCAAGTCAGATTGATTTTTTTAATCTAATTGTTCATTGATTCAAATTTCTT TTTTTTGATTAGTTGCTAAATGTTCATTTCATTGTCCAAATATTTCCATTGACGATTATGTGACTTTATCATTTATGTAATAATCGTTTTCTTTTACATTTCACACGTTTCAGCAATCAGTATTTTtAATATCAATTTTTTCGtTATTTTATAT TTTGTtATTGTAcCATGATGAAATTTTATaAAATATGATAGCAATAGATAGGTCAACAAAAGCAGCAAAATATATtA AAAAAAAAAAAAAAAACtCgAGGGGC (SEQ ID NO 1)；(其中第1位至第693位堿基所示序列為編碼序列，即黑色下劃線之間的序列)ENMAHSNENVDFMKYAIEEAPAAAFYIPEYFNDKEEEFYTQQIYSAPAPKWTSLSARRLLNYGGIVGKK GLIQVNDIPFWLRALMKRVCKSVPLFTPGNEPNHVLINEYLPGQGMPHTDGPAYFPWANITLGSHTVLDLYETET RNYIGSFLLERKSLLIISEQLYVNFQHGIKEVKEDEISEKILNYKLCSEKYSSEEKIPRKTRISITIRNVPKTITAF TAVFNNRA(SEQ IDNO 2)。實(shí)施例2制備Ts27基因重組蛋白及免疫血清1. Ts27基因原核表達(dá)及純化(1)擴(kuò)增 Ts27 基因以實(shí)施例1獲得的陽(yáng)性克隆pBlUeSCript/TS27菌液為模板進(jìn)行全菌PCR擴(kuò)增，引物為5' -CGGGATCCGAAAA TATGGCACATAGCAATG-3 ‘ (SEQ ID NO 3)；禾口 5，-CGCTCGAGTGCACGGTTA TTGAAAACAGC-3’ (SEQ ID NO :4)。擴(kuò)增條件:95V5min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0(2)擴(kuò)增純化后的Ts27基因片段經(jīng)BamH I和)(h0 I酶切后，亞克隆于原核表達(dá)載體PET48a(+)。正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株，經(jīng)37°C 150轉(zhuǎn)/分1. OmM IPTG 誘導(dǎo)3小時(shí)后，將菌液分裝至50ml離心管中，IlOOOrpm, 4°C離心5min，棄上清，收集菌體，用 200ml 的 20mM Tris-HCl (pH7. 9)充分懸浮。加入 Iml 蛋白酶抑制劑 II (Protease Inhibitor Cocktail Set II)。在冰上充分超聲，超聲輸出強(qiáng)度85%，每次6秒，間隔3秒；llOOOrpm， 4°C離心15min，棄上清，收集包涵體及細(xì)胞碎片；再用100ml的20mM Tris-HCl (pH7. 9)懸浮沉淀。加入新鮮配制的溶菌酶溶液至終濃度為10(^8/1111，置于冰上301^11，期間用玻璃棒不斷攪拌；在冰上充分超聲，超聲輸出強(qiáng)度85%，每次6秒，間隔3秒；llOOOrpm，4°C離心 15min，棄上清，獲得1^27基因重組蛋白，重組蛋白經(jīng)HiS-binding(N0Vagen公司)親和層析柱純化后，經(jīng)電洗脫儀洗脫使純度更高，純度達(dá)80%以上(圖1)。2. Ts27基因重組蛋白免疫血清的制備純化的Ts27重組蛋白與佐劑ISA 50V混合后，經(jīng)皮膚多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠 (25 μ g/只)，每2周加強(qiáng)1次，共加強(qiáng)2次。初次免疫5周后摘眼球取血，采集的血液置室溫放置2 3hr后，3000rpm，4°C離心IOmin ；取上清，3000rpm，4°C離心lOmin。收集血清并分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩LISA測(cè)定抗體效價(jià)高達(dá)1 80000以上。實(shí)施例3Ts27基因重組蛋白的免疫特性1.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)Wlyg實(shí)施例2制備的Ts27基因重組蛋白為抗原包被96孔酶標(biāo)板，一抗為待檢血清，一抗待檢血清分別為旋毛蟲(chóng)病人血清(35例，華中科技大學(xué)提供，工作濃度為 1 200)、感染旋毛蟲(chóng)的兔及鼠血清(各2例，實(shí)施例1制備，工作濃度均為1 1000)，感染旋毛蟲(chóng)的豬血清O例，實(shí)施例1制備，工作濃度均為1 10000)。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(羊抗鼠、羊抗兔、羊抗人二抗，購(gòu)自北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品，兔抗豬二抗購(gòu)自Sigma，工作濃度為1 5000)，將健康人血清、未感染旋毛蟲(chóng)的正常兔、豬和鼠血清設(shè)為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該蛋白可與旋毛蟲(chóng)病人血清、感染旋毛蟲(chóng)的兔、豬及鼠血清產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，OD值與陰性血清比值大于2.0。說(shuō)明Ts27基因的重組蛋白具有特異的免疫原性， 是極具潛力的診斷試劑。2.1Western 印跡分析實(shí)施例2制備的純化的Ts27基因表達(dá)蛋白(200ng)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham公司)檢測(cè)，分別以病人血清1 200 (華中科技大學(xué)提供)、感染豬血清1 10000、感染兔血清1 1000、感染鼠血清1 1000(上述三種血清均為實(shí)施例1制備)、Ts27基因重組蛋白免疫鼠血清(實(shí)施例2制備)1 10000作為第一抗體，二抗與本實(shí)施例的1中相同。結(jié)果顯示約33KDa處均呈現(xiàn)一明顯的蛋白印跡帶(圖2)，進(jìn)一步表明Ts27基因重組蛋白具有良好的免疫原性，可為感染旋毛蟲(chóng)的人、豬、 兔、鼠血清及Ts27基因重組蛋白免疫血清所識(shí)別，且特異性好，可用于旋毛蟲(chóng)感染的診斷。實(shí)施例4Ts27基因表達(dá)蛋白敏感性和特異性的鑒定1.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)Wlyg實(shí)施例2制備的Ts27基因重組蛋白為抗原包被96孔酶標(biāo)板，一抗為待檢血清，一抗待檢血清分別為旋毛蟲(chóng)病人血清(35例，華中科技大學(xué)提供，工作濃度為 1 200)、其他寄生蟲(chóng)感染病人血清(蛔蟲(chóng)病人、鉤蟲(chóng)病人、鞭蟲(chóng)病人、華支睪吸蟲(chóng)病人、日本血吸蟲(chóng)病人、豬帶絳蟲(chóng)病人血清各5例，華中科技大學(xué)提供，工作濃度均為1 200)，健康人血清(10例，首都醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)教研室職工，工作濃度均為1 200)。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人二抗(購(gòu)自北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品，工作濃度為1 5000)，將健康人血清設(shè)為陰性對(duì)照。該蛋白可與旋毛蟲(chóng)病人血清產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，OD值與陰性血清比值大于2.0。同時(shí)，該蛋白不與其他寄生蟲(chóng)感染病人血清發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明Ts27基因的重組蛋白具有特異的免疫原性，敏感性為91. 4% (32/35)，特異性為100% (0/35)，是極具潛力的診斷抗原。2. Western 印跡分析實(shí)施例2制備的純化的Ts27基因表達(dá)蛋白(IOOng)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham公司)檢測(cè)，分別以旋毛蟲(chóng)病人血清、其他寄生蟲(chóng)病人血清(蛔蟲(chóng)病人、鉤蟲(chóng)病人、鞭蟲(chóng)病人、華支睪吸蟲(chóng)病人、日本血吸蟲(chóng)病人、豬帶絳蟲(chóng)病人血清各5例，華中科技大學(xué)提供)以及健康人血清10例(首都醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)教研室職工)，工作濃度為1 200，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人二抗(購(gòu)自北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品，工作濃度為1 5000)。結(jié)果顯示有32例旋毛蟲(chóng)病人血清與Ts27基因表達(dá)蛋白反應(yīng)，在約33KDa處均呈現(xiàn)一明顯的蛋白印跡帶，有3例不反應(yīng)，而其他病人血清以及正常人血清與Ts27基因表達(dá)蛋白均未出現(xiàn)雜交信號(hào)(附圖幻。敏感性和特異性與ELISA 一致，進(jìn)一步表明Ts27基因重組蛋白具有良好的敏感性和特異性，可用于旋毛蟲(chóng)感染的診斷。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸分子，其含有選自以下的核苷酸序列a.SEQ ID NO 1所示序列或SEQ ID NO 1所示序列中的編碼序列；b.與a的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與a的核苷酸序列不同的序列；c.在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d.對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；e.與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列；和f.與上述a e所示序列互補(bǔ)的序列。
2.分離的蛋白，其氨基酸序列由權(quán)利要求1的多核苷酸分子編碼。
3.權(quán)利要求2的蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
4.重組載體，其含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸分子。
5.重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求4的重組載體。
6.抗體，其可特異性地結(jié)合權(quán)利要求2或3的蛋白，所述抗體優(yōu)選單克隆抗體或多克隆抗體。
7.藥物組合物，其含有權(quán)利要求2或3的蛋白，或者權(quán)利要求6的抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
8.寡核苷酸分子，其為根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸分子的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物或探針，所述引物能夠擴(kuò)增權(quán)利要求1的多核苷酸分子，所述探針能夠特異性地與權(quán)利要求1的多核苷酸分子雜交。
9.試劑盒，其包含權(quán)利要求1的多核苷酸分子、權(quán)利要求2或3的蛋白、權(quán)利要求6的抗體或權(quán)利要求8的寡核苷酸分子。
10.權(quán)利要求1的多核苷酸分子、權(quán)利要求2或3的蛋白、權(quán)利要求6的抗體或權(quán)利要求8的寡核苷酸分子用于制備診斷動(dòng)物或人中旋毛蟲(chóng)感染的檢測(cè)試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及旋毛蟲(chóng)Ts27基因和其編碼的蛋白。本發(fā)明還涉及含有Ts27基因的重組載體和重組細(xì)胞，以及與Ts27基因編碼蛋白特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明還涉及所述Ts27基因、其編碼蛋白、抗體用于制備診斷動(dòng)物和人旋毛蟲(chóng)感染的檢測(cè)試劑的用途以及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的Ts27基因重組蛋白免疫動(dòng)物后能夠產(chǎn)生高滴度的抗體，并且Ts27基因重組蛋白能夠特異性地被旋毛蟲(chóng)感染的動(dòng)物或人血清所識(shí)別。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102181450SQ20111005372
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者楊雅平, 楊靜, 秦佳佳, 諸欣平 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)