專利名稱：白血病病變前期mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與白血病病變前期mRNA表達(dá)改變(病理演變過程)的相關(guān)檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
白血病是造血系統(tǒng)的惡性疾病，俗稱“血癌”，是海內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，其特點為造血組織中某一類型的白血病細(xì)胞在骨髓或其他造血組織中的發(fā)生惡性增生，并浸潤體內(nèi)各臟器、組織，導(dǎo)致正常造血細(xì)胞受抑制，產(chǎn)生各種癥狀，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、出血、貧血、肝、脾、淋逢迎腫大為特點。白血病一般按天然病程和細(xì)胞幼稚程度分為急性和慢性，按細(xì)胞類型分為粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等類型，臨床表現(xiàn)各有異同之處。可經(jīng)中藥及化療， 大部分可達(dá)緩解，也可骨髓移植治療，一部分可持久存活甚或治愈。我國白血病患者約為3 4人/10萬人口，小兒的惡性腫瘤中以白血病的發(fā)病率最高。據(jù)調(diào)查，我國〈10歲小兒白血病的發(fā)病率為2. 28/10萬，不論什么年齡均可發(fā)病，男的的發(fā)病率高于女性。一年四季均可發(fā)病，農(nóng)村多于城市。近十余年來美國、日本、英國等國家白血病發(fā)生率和死亡人數(shù)的比率也有上升趨勢，全世界約有24萬急性白血病患者。急性白血病屬于中醫(yī)學(xué)的“虛癆”、“血證”、“瘟病”等范疇。人類白血病的確切病因至今未明。很多因素被認(rèn)為和白血病發(fā)生有關(guān)。病毒可能是首要因素，此外尚有電離輻射、化學(xué)毒物或藥物、遺傳因素等。I、病毒人類白血病的病毒病因研究已有數(shù)十年月歷史，但至今只有成人t細(xì)胞白血病肯定是由病毒引起的。其他類白血病還沒有法證明其病毒因素，并不具備傳染性；2、電離輻射電離輻射有致白血病效用，其效用與放射劑量大小和照射部位有關(guān)，一次大劑量或多次小劑量照射均有致白血病效用；3、化學(xué)物質(zhì)苯致白血病效用比較肯定。苯致急性白血病以急粒和紅白血病為主；4、遺傳因素某些白血病發(fā)與遺傳因素有關(guān)；5.最主要的致病因素是長期、累積使用農(nóng)藥對人類生活環(huán)境的污染。急性白血病在臨床上分急性髓細(xì)胞白血病(acutemyeloblastic leukia, ami)及急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukia, all)。白血病在臨床上稱之血癌，與癌癥同類。2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進(jìn)行回顧，報告認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是1.腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細(xì)胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計思路不完善(動物模型設(shè)計不科學(xué))等。同時，該報告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、癌胚抗原、糖類激素、細(xì)胞膜因子、細(xì)胞核因子、細(xì)胞流式技術(shù))指標(biāo)來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標(biāo)記物。傳統(tǒng)臨床觀念認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認(rèn)真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募?xì)胞學(xué)角度來分析，I公分的腫塊約有一億個腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止2億個腫瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨的病灶，可能癌細(xì)胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細(xì)胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實這時已經(jīng)是晚期診斷和晚期治療，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正原因。白血病的臨床診治也是如此，一旦發(fā)現(xiàn)都是晚期了，不做骨髓干細(xì)胞移植，大部分很難治愈，而且，骨髓干細(xì)胞移植的配型人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于白血病發(fā)病人數(shù)。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥，已取得長足進(jìn)步。至今，我們已有可能在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預(yù)測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(白血病患者、高危人群、正常對照)，對TWIST基因與白血病的早期預(yù)警進(jìn)行檢測·分析。研究人員，通過檢測病人的骨髓樣本，發(fā)現(xiàn)骨髓異常增殖綜合征中的兩個轉(zhuǎn)錄因子(TWIST和DJ— I)表達(dá)異常。而利用核苷酸干擾技術(shù)降低異常表達(dá)的TWIST和DJ—1，可以顯著的增高抑癌基因P 53的表達(dá)，從而大大促使異常增殖的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。骨髓異常增殖綜合征簡稱為“MDS”，以往被稱為“白血病前期”，是一組起源于多功能造血干細(xì)胞克隆性骨髓增殖性疾病。以往認(rèn)為這種病易發(fā)在50多歲的中老年人，但近年來，該病有增多的趨勢，且在青少年中發(fā)現(xiàn)的病例也不少。經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，該病并不一定都會發(fā)展成白血病，如果前期診斷及時，采取有效的治療手段，病人的治愈率較高。利用基因芯片和蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)，通過分析近百名病人的骨髓樣本后發(fā)現(xiàn)了 TWIST有預(yù)防性診斷和早期介入治療“白血病前期”有著重要的臨床意義。將TWIST的mRNA作為早期篩查白血病病變前期有非常重要的臨床診斷意義。TffIST的mRNA在白血病前期及病變過程中表達(dá)過度。它作于白血病病變前期篩查、及白血病治療后的復(fù)發(fā)預(yù)警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病,只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率,降低社會成本和醫(yī)療成本。因此,發(fā)明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了大膽創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、高危人群、白血病患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)白血病前變的mRNA水平，與白血病早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要的靶標(biāo)，能將臨床上癌癥形成后診治模式變成癌癥(白血病)的預(yù)防性診治，爭取了白血病診治的時間和空間，達(dá)到預(yù)防白血病。目前對TWIST基因的研究都采用高通量基因芯片技術(shù)和蛋白譜技術(shù)，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，特別是個性化的應(yīng)用在我國現(xiàn)階段條件尚不成熟。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料TWIST基因mRNA水平的檢測技術(shù)及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計了不同數(shù)據(jù)例組(白血病患者、高危人群、正常對照人)例組，用原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明以上白血病病人TWIST基因都過度表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá)15-25%，正常人都是零表達(dá)。表明TWIST基因是白血病病變前期篩查的重要標(biāo)志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進(jìn)行探測，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結(jié)果沒有影響(因為，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過600bp以上)。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫(yī)學(xué)和生化指標(biāo)物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達(dá)到預(yù)防性診治，將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技術(shù)，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技術(shù)，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與白血病發(fā)生、復(fù)發(fā)相關(guān)的TWIST基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針如SEQ ID NO. I所示序列，是TffIST基因CDS序列，從堿基352到960bp, TWIST基因的核苷酸序列長度是1669bp，基因序列號NM_000474，如SEQ ID NO. 2所示序列，⑶S是352. . 960bp，位于染色體7p21. 2〃。(在探針標(biāo)記過程中如果基因序列太長，超過IOOObp以上，我們會用CDS的序列來設(shè)計探針，如果CDS的序列也超過IOOObp以上，會采用基因的中間一段堿基序列來合成探針，堿基序列不少于500bp，探針合成后要做序列檢測，并對功能進(jìn)行臨床意義的分析)。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的癌變前期TWIST基因篩查試劑盒應(yīng)用價值在于，能在mRNA水平，及早對白血病病變前期篩查及白血病經(jīng)治療后復(fù)發(fā)的早期預(yù)警。TWIST基因是一種類似致癌基因， 它的聞表達(dá)表明有白血病如變的可能及治療后有可能復(fù)發(fā)，提不臨床醫(yī)生及早介入診治。本發(fā)明還提供一種TWIST基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和
(2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本來自白血病患者、高危人群、正常對照。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的白血病高危人群，經(jīng)治療后病人復(fù)發(fā)及白血病患者。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以TWIST基因為檢測對象，合成探針是TWIST基因的RNA序列，檢測的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供TWIST基因的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達(dá)量，正常人TWIST基因表達(dá)低或不表達(dá)，即不顯色，TWIST基因在白血病病人和正常人有顯著差異，該基因的表達(dá)量比正常人表達(dá)量都高，高危人群有低表達(dá)。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以TWIST基因為目的基因合成的核酸探針用地高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細(xì)胞中的TffIST基因表達(dá)量，用來確定白血病是否發(fā)生及治療后有沒有復(fù)發(fā)，因為TWIST基因在正常 人中低表達(dá)或不表達(dá)，如果TWIST基因表達(dá)高度，說明白血病病變風(fēng)險非常高，已及治療后病人可能已復(fù)發(fā)，從而獲得白血病病變前期的篩查和診斷信息，幫助臨床醫(yī)生及早介入。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述，當(dāng)檢測到TWIST基因的表達(dá)高于正常對照時，則可預(yù)測受試者為白血病病變已發(fā)生。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測白血病病變發(fā)生和病理演變過程中白血病病變的發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測標(biāo)志物(癌抗原、癌胚抗原、糖類激素、細(xì)胞膜因子、細(xì)胞核因子)和影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測TWIST基因異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，白血病發(fā)病前期，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床白血病病變前期高風(fēng)險人群，一個真正的早期篩查以及治療后復(fù)發(fā)的及早預(yù)測。這樣才有可能實施乳癌的早期篩查、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治白血病惡疾。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖I是本發(fā)明TWIST基因原位雜交實施例圖。圖2是本發(fā)明實施例中白血病病人TWIST過量表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實施例中正常人TWIST表達(dá)圖片。圖4是高危人群TWIST表達(dá)圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例I
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以TWIST基因為檢測目的基因設(shè)計的雜交探針、標(biāo)記物、說明書，其中
本實施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。
權(quán)利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針如序列表SEQ ID NO. I所不的序列。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種TWIST基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)在權(quán)利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2)檢測所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液白細(xì)胞標(biāo)本選自白血病患者、高危人群、正常對照標(biāo)本。
10.TffIST基因在制備檢測白血病病變原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與白血病病變前期病理演變有密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(TWIST)基因的mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測TWIST基因的表達(dá)量，現(xiàn)有的臨床生化檢測指標(biāo)更早期，能實現(xiàn)真正的白血病病變前期mRNA水平篩查，同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102925543SQ20111044293
公開日2013年2月13日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者張玉麗, 裘霖, 張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司