專利名稱：檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)snp位點(diǎn)的試劑盒及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用多重PCR結(jié)合分子開(kāi)關(guān)技術(shù)檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法，特別涉及一種檢測(cè)同型半胱氨酸代謝的MTHFR基因 rsl801133 SNP 位點(diǎn)、MTR 基因 rsl805087 SNP 位點(diǎn)、MTRR 基因 rsl801394 SNP 位點(diǎn)和CBS基因rs5742905的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的試劑盒以及多重PCR擴(kuò)增方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
同型半胱氨酸(HCY)，或稱為高半胱氨酸或同半胱氨酸，是從S-腺苷基甲硫氨酸透過(guò)兩個(gè)反應(yīng)步驟途徑形成，并能回轉(zhuǎn)成甲硫氨酸，或經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)硫途徑而回轉(zhuǎn)為半胱氨酸或牛磺酸。缺乏維他命如葉酸、VB6或VB12，HCY水平都會(huì)上升。補(bǔ)充葉酸、VB6、VB12或三甲基甘氨酸會(huì)減少血液內(nèi)的HCY的濃度。高水平的HCY與心腦血管疾病，胎兒發(fā)育異常，腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。葉酸，HCY的代謝中相關(guān)酶基因的突變將導(dǎo)致酶活性的降低，使HCY水平上升。MTHFR編碼的四氫葉酸還原酶是葉酸和HCY代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶，能將5，10-亞甲基四氫葉酸裝變?yōu)?-甲基四氫葉酸，從而參與甲硫氨酸代謝循環(huán)和DNA甲基化。正常的MTHFR活性能保持葉酸和甲硫氨酸循環(huán)的有效性，維持體內(nèi)HCY的正常水平，C677T多態(tài)使酶活性顯著降低，導(dǎo)致5-甲基四氫葉酸生成障礙，引起HCY血癥。MTR編碼的5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，是一種維生素B12依賴的甲硫氨酸合酶，催化甲硫氨酸生物合成的最后一步，由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的5-甲基四氫葉酸提供甲基，催化HCY再甲基化生成甲硫氨酸，MTR基因2756A/G突變導(dǎo)致919位氨基酸由天冬氨酸轉(zhuǎn)為甘氨酸，引起MTR功能障礙，導(dǎo)致HCY再甲基化途徑受阻，體內(nèi)HCY水平和甲硫氨酸循環(huán)異常。MTRR基因是甲硫氨酸合成酶的輔助因子，催化甲鈷胺再生，其常見(jiàn)的多態(tài)性66A/G會(huì)導(dǎo)致甲硫氨酸被異亮氨酸所取代，因此對(duì)于維持甲硫氨酸和四氫葉酸及HCY在體內(nèi)正常水平有重要作用。CBS是磷酸吡哆醛酶，是體內(nèi)HCY分解代謝的關(guān)鍵酶，在其催化下與絲氨酸縮合成胱硫醚，進(jìn)一步代謝為半胱氨酸和α -酮丁酸隨尿液排出體外，T833C位點(diǎn)突變是其最常見(jiàn)突變位點(diǎn)，使異亮氨酸代替278位的蘇氨酸，引起CBS結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象變化，造成CBS缺陷，進(jìn)而影響體內(nèi)HCY的代謝，導(dǎo)致HCY的升高。

發(fā)明內(nèi)容
同型半胱氨酸代謝相關(guān)酶MTHFR、MTR、MTRR和CBS的基因遺傳多態(tài)性直接或間接影響同型半胱氨酸在體內(nèi)的代謝過(guò)程。本發(fā)明提供一種利用多重PCR結(jié)合分子開(kāi)關(guān)技術(shù)檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案:一種檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒能同時(shí)對(duì)MTHFR基因rsl801133 SNP位點(diǎn)、MTR基因rsl805087 SNP位點(diǎn)、MTRR基因rsl801394 SNP位點(diǎn)和CBS基因rs5742905SNP位點(diǎn)的四個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)檢測(cè)。所述試劑盒包括檢測(cè)MTHFR基因rsl801133位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、檢測(cè)MTR基因rs 1805087 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、檢測(cè)MTRR基因rsl801394 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物和檢測(cè)CBS基因rs5742905 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物所述檢測(cè)MTHFR基因rsl801133位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型弓I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG正向突變型弓I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA
反向共用弓 I 物:TGCTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCC所述檢測(cè)MTR基因rsl805087位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGT正向突變型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGC反向共用引物:CCAGTCCCTTCTTTGGCTTGTGCAG所述檢測(cè)MTRR基因rsl801394位點(diǎn)的引物喊基序列如下所不:正向野生型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAT正向突變型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAC反向共用引物:TGTGGCTCAAGTTTTGTTCAGGTTCTTG所述檢測(cè)CBS基因rs5742905位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAA正向突變型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAG反向共用引物:TTGGGTTTCTCATCCTGCCTCTGAGG。所述的檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒所采用的檢測(cè)方法，對(duì)受檢樣本DNA分別用野生型和突變擴(kuò)增緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，在每個(gè)反擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)對(duì)4個(gè)目的片段和I個(gè)內(nèi)參片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段由大到小依次是:內(nèi)對(duì)照733bp，MTRR rsl801394515bp, MTR rsl805087 319bp, CBS rs5742905 193bp, MTHFR 基因 rsl801133 123bp ;擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳在紫外光下見(jiàn)到根據(jù)片段大小區(qū)分開(kāi)的產(chǎn)物條帶，根據(jù)條帶的有無(wú)判斷4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。所述的檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒的多重PCR擴(kuò)增方法，包括以下步驟:預(yù)變性由I次循環(huán)構(gòu)成,其條件為:溫度為94°C，時(shí)間為5分鐘；PCR擴(kuò)增由30次循環(huán)構(gòu)成，其條件為:變性:溫度為94°C，時(shí)間為30秒；退火:溫度為56 °C，時(shí)間為30秒；延伸:溫度為72°C，時(shí)間為90秒； 擴(kuò)增結(jié)束后于4°C保存至電泳檢測(cè)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果:(I)本發(fā)明采用多重PCR擴(kuò)增技術(shù)，在一次PCR反應(yīng)中對(duì)4個(gè)包含SNP位點(diǎn)的DNA片段和I個(gè)內(nèi)參片段同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，提高檢測(cè)效率降低檢測(cè)成本。(2)本發(fā)明采用SNP敏感性分子開(kāi)關(guān)技術(shù)，使3’端不能與模板互補(bǔ)的引物所引發(fā)的擴(kuò)增非成熟性終止，無(wú)法形成產(chǎn)物，避免假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。(3)引入內(nèi)參，為陰性結(jié)果的判讀提供依據(jù)，避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。(4)本發(fā)明擴(kuò)增后只需通過(guò)DNA凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)即可完成檢測(cè)，不需添置貴重設(shè)備，快速，準(zhǔn)確，靈敏，特異，重復(fù)性好，大幅降低了檢測(cè)成本和操作復(fù)雜程度，適合臨床和科研使用。(5)無(wú)需DNA提取，只需裂解全血細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后的懸液加入反應(yīng)體系即可完成擴(kuò)增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染。(6)本發(fā)明的試劑盒，分別提供野生型和突變型的2X擴(kuò)增緩沖液，使用者只需加入全血裂解懸液和聚合酶即可進(jìn)行擴(kuò)增，減少了操作步驟，提高勞動(dòng)速率，可以實(shí)現(xiàn)高效率檢測(cè)。(7)本發(fā)明的試劑盒 所提供的野生型和突變型2X擴(kuò)增緩沖液，使用了不同顏色的擴(kuò)增指示染料，方便加樣時(shí)區(qū)分，擴(kuò)增后即可直接進(jìn)行凝膠電泳，無(wú)需加入loadingbuffer,避免人為錯(cuò)誤。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒，所述試劑盒可同時(shí)對(duì)MTHFR基因rsl801133 SNP位點(diǎn)、MTR基因rsl805087SNP位點(diǎn)、MTRR基因rsl801394 SNP位點(diǎn)和CBS基因rs5742905 SNP位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增分型檢測(cè)，以ACTB基因?yàn)閮?nèi)參來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增條件；野生型2X緩沖包含上述4個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型正向序列特異性引物、共用反向引物和內(nèi)參序列上下游引物，通過(guò)擴(kuò)增后DNA電泳條帶的有無(wú)判斷是否攜帶對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的野生型表型；突變型2X緩沖液包含上述4個(gè)SNP位點(diǎn)的突變型正向序列特異性引物、共用反向引物和內(nèi)參序列上下游引物，通過(guò)擴(kuò)增后DNA電泳條帶的有無(wú)判斷是否攜帶對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的突變型表型；當(dāng)其中一個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的片段長(zhǎng)度條帶僅在野生型擴(kuò)增中得出陽(yáng)性結(jié)果，突變型擴(kuò)增對(duì)應(yīng)位置條帶為陰性時(shí)判讀為野生純合型，相反為突變純合型，野生型和突變型擴(kuò)增都出現(xiàn)陽(yáng)性條帶其結(jié)果為雜合型，通過(guò)野生型和突變型的特異性擴(kuò)增經(jīng)過(guò)DNA凝膠電泳綜合分析確認(rèn)受試者的基因型。所述檢測(cè)MTHFR基因rsl801133位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型弓I 物 AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG正向突變型弓I 物 AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA反向共用引物:TGCTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCC所述檢測(cè)MTR基因rsl805087位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGT正向突變型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGC反向共用引物:CCAGTCCCTTCTTTGGCTTGTGCAG所述檢測(cè)MTRR基因rsl801394位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物 CCATGTACCACAGCTTGCTCACAT正向突變型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAC
反向共用引物:TGTGGCTCAAGTTTTGTTCAGGTTCTTG所述檢測(cè)CBS基因rs5742905位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAA正向突變型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAG反向共用引物:TTGGGTTTCTCATCCTGCCTCTGAGG本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:細(xì)胞裂解液，野生型2 X擴(kuò)增緩沖混合液，突變型2 X擴(kuò)增緩沖混合液，聚合酶，液體石蠟油。本試劑盒共40人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_(kāi)20°C。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。

實(shí)施例檢測(cè)試劑盒的使用步驟1:全血基因組DNA的提取取受檢者外周靜脈血300 μ 1，加入700 μ I細(xì)胞裂解液，顛倒混勻5次，12000rpm離心I分鐘，倒去上清，并將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留2分鐘，確保沉淀在管中，加Λ 300 μ I雙蒸水，渦旋震蕩混勻成細(xì)胞裂解懸液。步驟2 =PCR擴(kuò)增反應(yīng)1、配置野生型反應(yīng)體系:PCR管內(nèi)加入細(xì)胞裂解懸液4.8 μ 1、加入5 μ 12Χ野生型擴(kuò)增緩沖液和0.2 μ I聚合酶(2.5U/ μ I)混合構(gòu)成獨(dú)立的反應(yīng)體系，加樣后充分混勻，短暫離心，最后沿管壁輕輕加入20 μ I液體石蠟油封閉體系，具體見(jiàn)下表:
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒能同時(shí)對(duì) MTHFR 基因 rsl801133 SNP 位點(diǎn)、MTR 基因 rsl805087SNP 位點(diǎn)、MTRR 基因 rsl801394SNP位點(diǎn)和CBS基因rs5742905 SNP位點(diǎn)的四個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)MTHFR基因rs 1801133位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、檢測(cè)MTR基因rsl805087 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物及一個(gè)反向引物、檢測(cè)MTRR基因rsl801394 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向弓I物及一個(gè)反向弓I物和檢測(cè)CBS基因rs5742905 SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于: 所述檢測(cè)MTHFR基因rsl801133位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示: 正向野生型弓 I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG 正向突變型弓 I 物:AAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA 反向共用引物:TGCTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCC 所述檢測(cè)MTR基因rsl805087位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示: 正向野生型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGT 正向突變型引物:TACCACTTACCTTGAGAGACTCATAATGGC 反向共用引物:CCAGTCCCTTCTTTGGCTTGTGCAG 所述檢測(cè)MTRR基因rsl801394位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示: 正向野生型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAT 正向突變型引物:CCATGTACCACAGCTTGCTCACAC 反向共用引物:TGTGGCTCAAGTTTTGTTCAGGTTCTTG 所述檢測(cè)CBS基因rs5742905位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示: 正向野生型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAA 正向突變型引物:ACCCTTCGGGATCCACCCCAG 反向共用引物:TTGGGTTTCTCAT CCTGCCTCTGAGG。
4.一種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒所采用的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)受檢樣本DNA分別用野生型和突變擴(kuò)增緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，在每個(gè)反擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)對(duì)4個(gè)目的片段和I個(gè)內(nèi)參片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段由大到小依次是:內(nèi)對(duì)照 733bp, MTRR rsl801394515bp, MTR rsl805087 319bp, CBS rs5742905 193bp, MTHFR 基因rsl801133123bp ;擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳在紫外光下見(jiàn)到根據(jù)片段大小區(qū)分開(kāi)的產(chǎn)物條帶，根據(jù)條帶的有無(wú)判斷4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。
5.一種采用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的試劑盒的多重PCR擴(kuò)增方法，其特征在于，包括以下步驟: 預(yù)變性由I次循環(huán)構(gòu)成，其條件為: 溫度為94°C，時(shí)間為5分鐘； PCR擴(kuò)增由30次循環(huán)構(gòu)成，其條件為: 變性:溫度為94°C，時(shí)間為30秒； 退火:溫度為56°C，時(shí)間為30秒； 延伸:溫度為72°C，時(shí)間為90秒；擴(kuò)增結(jié)束后于4°C保存至 電泳檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用多重PCR技術(shù)結(jié)合SNP敏感性分子開(kāi)關(guān)技術(shù)檢測(cè)同型半胱氨酸代謝相關(guān)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒及其擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。所述試劑盒對(duì)同型半胱氨酸代謝相關(guān)的四個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，包括MTHFR基因rs1801133 SNP位點(diǎn)、MTR基因rs1805087 SNP位點(diǎn)、MTRR基因rs1801394SNP位點(diǎn)和CBS基因rs5742905 SNP位點(diǎn)。所述試劑盒包含野生型2×擴(kuò)增緩沖液、突變型2×擴(kuò)增緩沖液、聚合酶、細(xì)胞裂解液和甘油，兩種緩沖液中分別含有對(duì)應(yīng)SNP野生型和突變型表型的序列特異性引物和內(nèi)參引物，可在兩個(gè)多重PCR反應(yīng)中完成對(duì)上述四個(gè)SNP位點(diǎn)的分型，從而了解受試者同型半胱氨酸代謝能力和葉酸、VB12和VB6需求。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103184269SQ20111044779
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者韓俊領(lǐng), 杜宏偉, 周毓玲, 崔麗娟 申請(qǐng)人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司, 天津?yàn)I海協(xié)和基因科技有限公司