專利名稱：人臍血間充質干細胞的核細胞的分離及培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種人臍血間充質干細胞的核細胞的分離及培養方法，其應用于人臍血間充質干細胞分化為神經元細胞的二甲基亞礬誘導過程。
背景技術：
長期以來中樞神經系統(central nervous system, CNS)的損傷與再生一直是困擾人類健康的難題，也是科學家們致力于研究的焦點。源于胚胎組織的神經干細胞(neural stern cells，NSC污)曾被認為是治療中樞神經系統疾病的希望，但它的利用因來源的缺乏和倫理道德的約束而受到明顯的限制。近年來通過對骨髓基質干細胞能產生骨骼肌、 心肌、肝細胞和神經膠質細胞及神經元樣細胞的研究，已說明這種橫向分化具有相當的普遍性，也就是說，“橫向分化”可以利用患者自身的健康組織干細胞，誘導分化為病損組織的功能細胞，從而達到治療各種組織壞損性疾病的目的。人臍血(human umbilieal cord blood, HUCB)是胎兒出生時臍帶內及胎盤近胎兒一側血管內的血液，含有豐富的干細胞和祖細胞，其主要包含造血干細胞和間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其中間充質干細胞與骨髓的間質干細胞相似，具有較強的可塑性，能發育成多種不同的細胞。將臍血細胞通過鼠尾靜脈注射入腦損傷模型的大鼠體內，于腦組織損傷部位可檢測到有臍血源性神經元和膠質細胞抗原的表達，且在功能上有明顯的恢復。

發明內容
本發明的方法擬通過體外條件下獲取臍血MSCs，探討其在體外培養、純化和擴增的最佳條件，并應用二甲基亞礬誘導向神經元樣細胞定向分化，論證其可塑性，為中樞神經系統的損傷修復提供一種新的細胞來源。具體的，為達到本發明的目的，本發明提出一種人臍血間充質干細胞的核細胞的分離及培養方法，其應用于人臍血間充質干細胞分化為神經元細胞的二甲基亞礬誘導過程，所述的誘導過程包括如下步驟Si.臍血的收集和單個核細胞的分離無菌條件下取正常足月剖腹產胎兒的臍帶血40-60ml，肝素抗凝，濃度為20U/ml，所有樣本均于采集后12h內分離。用Hank’ S平衡鹽溶液1 1稀釋、混勻，疊加于Fieoll-Hypaque上面，相對密度為1.0779/L，稀釋血與 Fieoll-Hypaque液的柱高比為2 1，以2000r/min離心20min，取界面層的單個核細胞，加 Hank’ S平衡鹽溶液離心、洗滌兩次，加入培養基中，調整細胞濃度為IxlOfVml左右。S2.細胞的培養、純化及擴增培養基采用Mesencult 培養液，并調整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印，將細胞分裝于25T培養瓶中，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5 %的培養箱中培養48-7 后，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每3-5d半量換液一次。待細胞達到80%-90%融合時，用1 1的2.5g/L胰蛋白酶和 0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例進行傳代接種培養，并記為P1代。傳代培養過程中每3d半量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復上述操作，傳代培養記為幾代，其余類推。S3.定向誘導MSCs 向神經元樣細胞分化取傳至第3代的MSCS按虹105/1密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內制備細胞爬片，用含有lmmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20 % FCS)預誘導Mh，PBS洗滌3遍后，換成含10g/L的二甲基亞礬(DMSO)和 lOOmmol/L的丁化輕基苯甲醚(BHA)的無血清DMEM進行誘導，每隔30min在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態變化。S4.免疫組織化學鑒定誘導后的細胞用4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3 遍，加入過氧化物酶阻斷液以消除內源性過氧化物酶，山羊血清工作液室溫下封閉20min， 去除血清后分別加入小鼠抗人神經元特異性烯醇化酶(NSE)和神經絲蛋白(NF)單抗工作液，置于濕盒中4°C下過夜，PBS洗滌3遍，分別滴加羊抗小鼠的Ig-FITC和TRITC的二抗工作液，37°C下孵育》i，PBS漂洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察。鏡下隨機取10個非重疊視野 (X100)，計算NSE和NF-M陽性細胞占總細胞的比例。


通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發明的人臍血間充質干細胞分化為神經元細胞的二甲基亞礬誘導過程的步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示的本發明的人臍血間充質干細胞分化為神經元細胞的二甲基亞礬誘導過程的步驟流程圖，所述實施例的方法具體步驟如下Si.臍血的收集和單個核細胞的分離無菌條件下取正常足月剖腹產胎兒的臍帶血40-60ml，肝素抗凝，濃度為20U/ml，所有樣本均于采集后12h內分離。用Hank’ S平衡鹽溶液1 1稀釋、混勻，疊加于Fieoll-Hypaque上面，相對密度為1.0779/L，稀釋血與 Fieoll-Hypaque液的柱高比為2 1，以2000r/min離心20min，取界面層的單個核細胞，加 Hank’ S平衡鹽溶液離心、洗滌兩次，加入培養基中，調整細胞濃度為IxlOfVml左右。S2.細胞的培養、純化及擴增培養基采用Mesencult 培養液，并調整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印，將細胞分裝于25T培養瓶中，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5 %的培養箱中培養48-7 后，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每3-5d半量換液一次。待細胞達到80% -90%融合時，用1 1的2. 5g/L胰蛋白酶和 0.2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例進行傳代接種培養，并記為P1代。傳代培養過程中每3d半量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復上述操作，傳代培養記為幾代，其余類推。S3.定向誘導MSCs 向神經元樣細胞分化取傳至第3代的MSCS按虹105/1密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內制備細胞爬片，用含有lmmol/L的件琉基乙醇的DMEM(20 % FCS)預誘導Mh，PBS洗滌3遍后，換成含10g/L的二甲基亞礬(DMSO)和 lOOmmol/L的丁化輕基苯甲醚(BHA)的無血清DMEM進行誘導，每隔30min在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態變化。
S4.免疫組織化學鑒定誘導后的細胞用4%的多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3 遍，加入過氧化物酶阻斷液以消除內源性過氧化物酶，山羊血清工作液室溫下封閉20min， 去除血清后分別加入小鼠抗人神經元特異性烯醇化酶(NSE)和神經絲蛋白(NF)單抗工作液，置于濕盒中4°C下過夜，PBS洗滌3遍，分別滴加羊抗小鼠的Ig-FITC和TRITC的二抗工作液，37°C下孵育》i，PBS漂洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察。鏡下隨機取10個非重疊視野 (X100)，計算NSE和NF-M陽性細胞占總細胞的比例。實驗結果及分析1.臍血MSCs的純化、擴增從臍血中分離出的單個核細胞接種于培養基 (MeseneultTM)中48_7池后開始有細胞貼壁，逐漸伸出突起，4_7d出現大量的貼壁細胞，很少有集落形成，以間充質樣細胞為主，同時有大量的破骨樣細胞混雜。破骨樣細胞胞體較大，多個核，圓形，MSCs為成纖維樣的長梭形細胞，單個核，有較長的突起，折光性強。隨著在條件培養基的環境下培養，1-2周后細胞生長達80% -90%融合。傳代后，細胞擴增明顯減慢，傳至P3代后，大部分細胞(包括破骨樣細胞)逐漸被去除，剩下形態為成纖維樣細胞和略寬大的扁平形細胞，即為臍血源性的MSCs，形態上類似于骨髓MSCs，將這些細胞再次傳代培養，1-2周左右可達到融合，并表現出較強的傳代擴增能力。2. MSCs誘導為神經元樣細胞的形態學觀察臍血源性MSCs在含件琉基乙醇的 DMEM (20% FCS)預誘導24h后，換成DMSO和BHA的無血清DMEM進行誘導24h后細胞形態發生變化，胞質逐漸回縮，呈典型的核周形態，有突起伸出，7-8h后，大多數細胞均轉變為類似神經元樣的形態，伸出較長的突起，并可見一級和二級分支，類似樹突樣。3.免疫組化鑒定采用神經元標志物NSE和NF進一步鑒定MSCs經DMSO和BllA 誘導他后，大多數細胞表現為NSE和NF熒光染色陽性，NSE用FITC標記，NF用TRITC標記。從雙極到多極細胞均有出現，對照組則無陽性標記細胞出現。隨機計數10個視野，計算結果顯示誘導后大多數細胞均轉變為神經元樣細胞，NSE陽性細胞占67. 4%士 2. 6%,NF 陽性細胞為65. 8%土 2.3%。本發明的方法應用含10g/L的二甲基亞礬和lOOmmol/L的丁化輕基苯甲醚的無血清DMEM誘導來源于人臍血間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化成神經元細胞。無菌條件下收集正常足月剖腹產胎兒的臍帶血，經肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離臍血的單個核細胞，以偏酸性的Mesencul 作為培養基進行培養和純化，獲得貼壁細胞，取擴增第三代后的應用二甲基亞礬誘導MSCs向神經元細胞誘導分化，免疫組化標記顯示經誘導后的MSCs表達神經絲蛋白(NF)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)。人臍血MSCs在體外可以培養、擴增，應用二甲基亞礬誘導能向神經元樣細胞分化，為中樞神經系統的損傷修復提供一種新的細胞來源。本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
權利要求
1.一種人臍血間充質干細胞的核細胞的分離及培養方法，其應用于人臍血間充質干細胞分化為神經元細胞的二甲基亞礬誘導過程，所述誘導過程包括步驟臍血的收集和單個核細胞的分離、細胞的培養、純化及擴增、定向誘導MSCs以及免疫組織化學鑒定；其中所述臍血的收集和單個核細胞的分離方法包括無菌條件下取正常足月剖腹產胎兒的臍帶血40-60ml，肝素抗凝，濃度為20U/ml，所有樣本均于采集后12h內分離；用Hank’ S平衡鹽溶液1 1稀釋、混勻，疊加于Fieoll-Hypaque上面，相對密度為 1. 0779/L，稀釋血與Fieoll-Hypaque液的柱高比為2 1，以2000r/min離心20min，取界面層的單個核細胞；以及加Hank’S平衡鹽溶液離心、洗滌兩次，加入培養基中，調整細胞濃度為lxl06/ml左右。
2.如權利要求1所述的人臍血間充質干細胞的核細胞的分離及培養方法，其中所述細胞的培養、純化及擴增方法包括培養基采用Mesencult 培養液，并調整其pH值使呈偏酸性，加入1 %的Pen-str印， 將細胞分裝于25T培養瓶中，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的培養箱中培養48-7 后，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每3-5d半量換液一次；待細胞達到80% -90%融合時，用1 1的2. 5g/L胰蛋白酶和0. 2g/LEDTA混合液消化，然后按2 1的比例進行傳代接種培養，并記為P1R;傳代培養過程中每3d半量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復上述操作， 傳代培養記為幾代，其余類推。
全文摘要
本發明提出一種人臍血間充質干細胞的核細胞的分離及培養方法，其應用于人臍血間充質干細胞分化為神經元細胞的二甲基亞礬誘導過程，所述誘導過程應用含二甲基亞礬和丁化輕基苯甲醚的無血清DMEM誘導來源于人臍血間充質干細胞分化成神經元細胞。在無菌條件下收集正常足月剖腹產胎兒的臍帶血，經肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離臍血的單個核細胞，以偏酸性的培養基進行培養和純化，獲得貼壁細胞，取擴增第三代后的應用二甲基亞礬誘導MSCs向神經元細胞誘導分化，免疫組化標記顯示經誘導后的MSCs表達神經絲蛋白(NF)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)。人臍血MSCs在體外可以培養、擴增，應用二甲基亞礬誘導能向神經元樣細胞分化，為中樞神經系統的損傷修復提供一種新的細胞來源。
文檔編號C12N5/0789GK102533645SQ201110448030
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者陸華 申請人:陸華