專利名稱：人胚皮層神經干細胞的原代細胞的分離培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種人胚皮層神經干細胞的原代細胞的分離培養方法，其應用于人胚皮層神經干細胞的分離和培養過程。
背景技術：
神經干細胞的發現是神經科學領域的重大突破，為神經發育和神經組織移植等研究領域開辟了廣闊前景。神經干細胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細胞，它處于分化的非終末狀態，可通過對稱或不對稱分裂出新的干細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產生中樞神經系統的三種主要細胞，即神經元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。一般認為神經干細胞主要存在于哺乳動物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區等，成年哺乳動物腦的側腦室壁和海馬等區。有關哺乳動物胚胎階段和成年動物在特定腦區存在神經干細胞已不斷得到證實，但對人類神經干細胞的研究尚少。

發明內容
本發明從人胚皮層中分離培養并鑒定神經干細胞利用無血清培養和單細胞克隆技術在人胚皮層中分離具有單細胞克隆能力的細胞，并進行培養、傳代，貼壁分化觀察，采用間接免疫熒光檢測克隆細胞的神經巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特異性成熟神經細胞抗原的表達。具體的，為實現本發明的目的，所述的人胚皮層神經干細胞的分離培養方法包括以下步驟Sl 原代細胞的分離和培養取胚齡12周水囊引產的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細胞培養液中漂洗三次，用細吸管反復吹打瓶內組織碎塊至完全散開，制成細胞懸液，經100目不銹鋼網過濾， 制成單細胞懸液，經分胎藍染色計數活細胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12無血清培養基， 調整細胞含量為1 X IO51Iir1，將細胞懸液分裝于25ml細胞培養瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2條件下靜置培養7天。S2 傳代培養及單細胞克隆、傳代將原代培養7天后的細胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進行機械分離，制成單細胞懸液，用含化7和bFGF的無血清培養液將細胞懸液按 IXIOW濃度傳代接種于培養瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養7天，同時進行克隆形成實驗，計數每代的克隆形成率，每7-9天機械分離傳代，方法同前。采用有限稀釋法，將原代克隆細胞制成的單細胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，于96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，選取僅有一個細胞的培養孔作記號，并動態觀察。待長成單細胞克隆球后機械分離成單細胞懸液，再將一個克隆的所有細胞種至培養瓶中，待次代克隆長成后連續傳代，最后得到大量來自某單個細胞的亞克隆。S3 克隆誘導分化分別選取部分傳代及單細胞克隆的細胞種植于多個多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，觀察其生長分CN 102533639 A
化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測。S4 間接免疫熒光檢測將克隆細胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時后用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫熒光染色(抗Nestin IgG)。分別將傳代及單細胞克隆的細胞種植于預置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養集中，于7天、14天時取出， 進行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫熒光單標染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標染色。本發明采用無血清培養和單細胞克隆技術從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經干細胞，該細胞具有連續克隆能力，可傳達培養，表達神經巢蛋白抗原。 分化后的細胞表達神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原。


通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發明的人胚皮層神經干細胞的分離培養方法的步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示的本發明的人胚皮層神經干細胞的分離培養方法的步驟流程圖，所述方法包括以下步驟Sl 原代細胞的分離和培養取胚齡12周水囊引產的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細胞培養液中漂洗三次，用細吸管反復吹打瓶內組織碎塊至完全散開，制成細胞懸液，經100目不銹鋼網過濾， 制成單細胞懸液，經分胎藍染色計數活細胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12無血清培養基， 調整細胞含量為1 X IO51Iir1，將細胞懸液分裝于25ml細胞培養瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2條件下靜置培養7天。S2 傳代培養及單細胞克隆、傳代將原代培養7天后的細胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進行機械分離，制成單細胞懸液，用含B27和bFGF的無血清培養液將細胞懸液按 IXIOW濃度傳代接種于培養瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養7天，同時進行克隆形成實驗，計數每代的克隆形成率，每7-9天機械分離傳代，方法同前。采用有限稀釋法，將原代克隆細胞制成的單細胞懸液，稀釋到40Π1Γ1，于96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，選取僅有一個細胞的培養孔作記號，并動態觀察。待長成單細胞克隆球后機械分離成單細胞懸液，再將一個克隆的所有細胞種至培養瓶中，待次代克隆長成后連續傳代，最后得到大量來自某單個細胞的亞克隆。S3 克隆誘導分化分別選取部分傳代及單細胞克隆的細胞種植于多個多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，觀察其生長分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測。S4 間接免疫熒光檢測將克隆細胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時后用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫熒光染色(抗Nestin IgG)。分別將傳代及單細胞克隆的細胞種植于預置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養集中，于7天、14天時取出， 進行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫熒光單標染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標染色。實驗結果與分析1.克隆細胞形態觀察人胚皮層原代培養細胞成圓形球狀，懸浮生長，經分胎藍染色計數活細胞在80 %以上，培養7天時細胞數目明顯增加，可見數十個至數萬個細胞組成的細胞球，細胞形態規則，邊界清楚，折光性強。有少數細胞貼壁生長，分化出有突起的神經原細胞，經傳代克隆后仍未出現與原代培養相同的大量次代克隆。單細胞克隆顯示單個細胞在培養3天時細胞克隆增大至數十個，此后隨密度增加生長加快，經傳代后仍成懸浮生長，細胞形態不變。2.誘導分化結果將傳代克隆及單細胞克隆后獲得的克隆細胞經胎牛血清培養 12h后即見部分克隆細胞團向四周發出放射狀細胞索，2天后可見大部分細胞貼壁生長，形態不規則，細胞索不斷增粗和伸長，一周后大部分細胞已從其邊緣向外遷移分化成大量形態不一的、分散成片的多突起星狀細胞或神經原樣細胞，突起互相交織成網狀，2周后部分神經細胞開始衰退、死亡。3.間接免疫熒光檢測將原代、傳代和單細胞克隆的細胞進行Nestin免疫熒光染色，結果顯示大部分細胞呈Nestin抗原陽性，尤其是傳代3次以上的克隆90%以上均呈陽性。NeuN免疫熒光染色呈陰性。經含血清培養7天、14天行NeuN、GFAP和CNP免疫熒光單標染色顯示均有陽性表達細胞存在，NeuN、GFAP和CNP雙標染色證實有神經元細胞和膠質細胞同時存在。Nestin免疫熒光染色在7天時尚可見部分陽性細胞，2周時幾乎未找到 Nestin陽性細胞。本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
權利要求
1. 一種人胚皮層神經干細胞原代細胞的分離培養方法，其應用于人胚皮層神經干細胞的分離和培養過程，所述人胚皮層神經干細胞的分離和培養過程包括步驟原代細胞的分離和培養、傳代培養及單細胞克隆和傳代、克隆誘導分化以及間接免疫熒光檢測；所述原代細胞的分離和培養方法如下取胚齡12周水囊引產的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的細胞培養液中漂洗三次，用細吸管反復吹打瓶內組織碎塊至完全散開，制成細胞懸液；使用100目不銹鋼網過濾，制成單細胞懸液，經分胎藍染色計數活細胞加入含化7和 bFGF的DMEM/F12無血清培養基，調整細胞含量為1 X ΙΟ^ιΓ1，將細胞懸液分裝于25ml細胞培養瓶，每瓶:3ml，37°C ,5% CO2條件下靜置培養7天。
全文摘要
本發明提出一種人胚皮層神經干細胞的原代細胞的分離培養方法，其其應用于人胚皮層神經干細胞的分離和培養過程，所述人胚皮層神經干細胞的分離和培養過程包括步驟原代細胞的分離和培養；傳代培養及單細胞克隆、傳代；克隆誘導分化；以及間接免疫熒光檢測。本發明采用無血清培養和單細胞克隆技術從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經干細胞，該細胞具有連續克隆能力，可傳達培養，表達神經巢蛋白抗原。分化后的細胞表達神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原。
文檔編號C12N5/0797GK102533639SQ201110448000
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者陸華 申請人:陸華