專利名稱：人乳頭瘤病毒(hpv)16,18型多通道熒光pcr檢測方法與試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，且涉及人乳頭瘤病毒(HPV) 16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒。
背景技術：
宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，在全球范圍內，每年約有20萬女性死于宮頸癌其發病率僅次于乳腺癌，居全世界女性惡性腫瘤的第二位。在中國每年新發現病例達13萬多，。宮頸癌是目前唯一找出治病原因的癌癥。1995年世界衛生組織(WHO)將人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的感染確定為宮頸癌的治病原因。有研究統計，有99.7%的的宮頸癌患者存在人乳頭瘤病毒病毒的感染。人乳頭瘤病毒是一種具有種屬特異性的嗜上皮病毒，為雙鏈閉環的小DNA病毒，約有8000個堿基對。其中包括8個早期開放讀碼框架(E1-E8)、2個晚期讀碼框架和I個非編碼長控區。E6和E7基因 對細胞生長刺激最為重要，E6、E7編碼的蛋白引起宮頸細胞的永生化。人乳頭瘤病毒是一組病毒的總稱，其病毒形態類似，但各個型別的DNA限制性內切酶圖譜有差異，核殼體蛋白質和抗原性不同。目前確定的HPV型別達100多種，其中根據感染部位不同可分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，據統計感染婦女生殖道的型別約有35種，其中20種與腫瘤的發生有關。HPV根據與腫瘤的發生的危險性高低可分為高危型和低位型HPV，低位型別HPV包括HPV6、11、42、43、44等型別，能夠引起外生殖器濕疣等良性病變，高危型的 HPV 包括 HPV16、18、31、33、39、45、51、52、56、58、59、68 等型別。高危型別的 HPV 能夠引起宮頸癌及宮頸上皮瘤變，尤其是HPV16U8。在HPV引起的宮頸癌患者中有2/3患者是由HPV16U8引起的。大多數新發現的HPV感染者可以通過自身免疫作用的清除實現自愈，但是如果是持續感染則可引起一系列的癌前病變，如果仍未接受治療，可能發展為癌癥，尤其是HPV16、18的持續感染。HPV的初期感染沒有明顯的臨床癥狀，但在短期內可以檢出HPV。因此對高危型HPV檢測用于宮頸癌的早期篩查具有顯著的臨床意義，從而濃縮高風險人群，進行有效的監控、早期發現宮頸癌。2005年，國際癌癥研究機構和世界衛生組織推薦HPV檢測用于宮頸癌篩查。目前，宮頸癌的篩查方法有細胞學方法、肉眼篩查法和HPV DNA檢測。各國推薦HPVDNA檢測與細胞學檢查想結合是宮頸癌的最佳方案。其中HPV DNA檢測方法是針對于高危型的HPV，方法有DNA印跡法、原位雜交法、雜交捕獲法、基因芯片法和熒光PCR法，其中熒光PCR法相對于其他幾種方法具有快速、簡便、準確、成本低、適合群體篩查的優點。實時熒光PCR具有上述特點，其關鍵是需要設計高特異性、高靈敏度的引物和探針以及優化的反應體系與擴增程序，這樣才能真正的成為高特異性和高靈敏度的檢測方法。另外，針對多亞型的檢測若能同時在一個PCR反應管中將不同亞型的準確的區分開對引物和探針的要求則需更高，并且需要更加優化的反應體系和反應條件。
高危型HPV16、18自身存在多態性，尤其是HPV16，根據地域的可分為歐洲型(E)、非洲型(Af)、亞洲型(As)、以及亞美型(A-A)，這些變異可導致某些人群罹患宮頸疾病的風險增加。通過測序發現檢測病毒基因組變異發現HPV各型的非編碼區級E1、E6、E7和LI區均有保守序列。通用引物一般選擇在El和LI區，而特異性引物則在E6和E7區。實時熒光PCR反應是在常規PCR的一對引物基礎上加入熒光探針或熒光染料，通過熒光PCR儀實時檢測PCR反應過程中熒光的變化。目前，臨床診斷中熒光PCR反應用到Taqman探針比較多。Taqman探針為一寡核苷酸，探針的5’端標記一個報告突光基團和3’端一個淬滅熒光基團。PCR未擴增是時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’至3’外切酶活性將5’端報告基團從探針上切割下來游離于反應體系中，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光PCR儀的熒光探測系統能夠實時檢測熒光的變化。即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。因此，通過熒光PCR儀可以定時動態檢測沒一循環，并繪出擴增曲線。最后通過突光閾值(Threshold)的設定獲得CT值(Cycle Threshold),從而對樣本進行定性定量檢測。多通道熒光PCR檢測是基于單通道PCR的基礎上建立起來的，其通過在同PCR反應單管中加入一對通用引物或一對以上的特異引物，并加入一對以上不同熒光標記的探針，利用多通道熒光PCR儀分別檢測不同的熒光信號，從而做到能夠在同一 PCR反應管中監測到不同的PCR產物擴增情況。多通道熒光PCR檢測相對于單通道檢測有眾多優點，如方便、快速、效率高、節約成本。

發明內容
本發明是基于Taqman探針技術和多重PCR技術建立了一套人乳頭瘤病毒(HPV) 16、18多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒。本發明實現了快速、簡便、高效的檢測并區分HPV 16、18高危型別。為達到上述目 的，本發明的采用的技術方案是:1.針對HPV 16型，在其E6區域設計了一對特異性的擴增引物和特異性探針，擴增片段長度為94bp。引物探針序列如下: HPV16F: 5 ’ AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT3，HPV16R: 5 ’ AGAGTCACACTTGCAACAAAAGGT3，HPV16P: 5 ’ ACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCAT3 ’2.針對HPV18，在其El區域設計了一對特異性的擴增引物和特異性探針，擴增片段長度為171bp。引物和探針如下:HPV18F: 5 ’ ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGA3 ’HPV18R:5’ AACCGTGGACTTAACTCTGTATCCA3’HPV18P:5’ ACAGCACAGGCATTGTTCCATGCG3’3.本試劑盒使用了管家基因三磷酸甘油醒脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH)作為內參對照，設計了一對特異性引物和特異性探針，單獨放在一PCR單管中擴展，擴增片段長度為。設置內參對照可以檢測每個樣本的取樣和提取前的效果，從而有效的降低了假陰性的出現，使實驗結果更加可信。GAPDH的擴增出來的片段長度為108bp，特異性引物和探針序列如下:
GAPDHF:5’ TGTGGCTCCCTTGGGTATATG3’GAPDHR:5，CATCGCCCCACTTGATTTTG3’GAPDHP:5，CCCCCACCCCCATAGGCGAGAT3’4.試劑盒中設置了陽性校準品和陰性對照。陰性對照為超純水。陽性校準品的制備是根據HPV16引物(HPV16 F、HPV16 R)、HPV18引物(HPV18 F、HPV18 R)和內參對照GAPDH引物(GAPDH F、GAPDH R)擴增的3段序列而合成的3條核苷酸片段。核苷酸片段序列如下:HPV16 E7 Seq:AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCAT TACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCT
HPV18 El Seq:ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGCAGGAGGTCCACAATGATGCACAAGTGTTGCATGTTTTAAAACGAAAGTTTGCAGGAGGCAGCACAGAAAACAGTCCATTAGGGGAGCGGCTGGAGGTGGATACAGAGTTAAGTCCACGGTTGAPDH Seq:TGTGGCTCCCTTGGGTATATGGTAACCTTGTGTCCCTCAATATGGTCCTGTCCCCATCTCCCCCCCACCCCCATAGGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATG5.根據不同的熒光定量PCR儀器，從以下熒光基團中選擇分布于不同的儀器檢測通道的熒光進行組合。熒光的發光基團為FAM、TET、JOE、CY3、CY5、CY5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine 6G、Orengon Greeen 488、Orengon Greeen 500、Orengon Greeen514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine Orange、ROX 中的任意一種，突光粹滅基團為DABCYL、DABSYL, TAMRA, BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3的任意一種或一種以上組合。6.本試劑盒每個樣品分2管檢測。其中一管為雙通道檢測，檢測HPV 16,18型；另一管為單通道檢測，檢測內參基因GAPDH。因此，試劑盒在選擇優化的探針組合:HPV16 P用 FAM-TMARA 標記、HPV18 P 用 J0E-TMARA 標記、GAPDHP 用 FAM-TMARA 標記。7.本試劑盒的組分包括PCR反應液1、PCR反應液2、HPV16U8型探針、內參熒光探針、Mgcl2、Taq酶、DNA提取液、陽性校準品、臨界陽性校準品、陰性對照。8.本試劑盒PCR緩沖液I和PCR緩沖液2中均包含Tris-HCL緩沖液(PH8.3)、KCL、d(AGC) TP、dUTP 和引物。其中 PCR 緩沖液 I 中包含引物 HPV16 F、HPV16 R、HPV18 F、HPV18 R, PCR 反應液 2 包含 GAPDH F、GAPDH R。9.本試劑盒中Taq酶中加入了 UNG酶，用dUTP代替了 dTTP其目的在于防止擴增前污染。在50°C情況下UNG酶可以水解擴增反應前反應體系中包含有dUTP的DNA模板，從而有效的防止了擴增前的污染。10.該設計盒的擴增程序根據不同的熒光PCR儀不同略有不同。如針對ABI7500熒光檢測系統程序優化如下:程序段一:50°C 2min，程序段二:94°C 5min，程序段三:94°C 15s, 60°C 45s, 40個循環，每個循環在60°C熒光檢測。若為空氣加熱的儀器，程序段三60°C延伸的時間可以縮短到30s。
具體實施例方式實施案例一——人乳頭瘤病毒(HPV) 16，18高危型熒光多通道檢測含內參檢測方法及其試劑盒使用方法1.試劑的準備按樣本數(待測樣本+對照品)n分別配制反應液I和反應液2:反應液1:取 PCR 緩沖液 l(n+l) X18ul、MgC12(n+l) X3ul、HPV16 18 熒光探針(η+1) X:3ul、Taq 酶(n+1) X 2ul 預混于一管反應液2:取PCR緩沖液2(n+l) X18ul、MgC12(n+l) X3ul、內參熒光探針(n+1) X3ul、Taq 酶(n+1) X 2ul 預混于一管將反應反應液I和反應液2放至漩渦震蕩儀上混勻10秒鐘，低速理性數秒，按沒管26ul分裝至PCR反應管。2.標本的采集與處理尿道、陰道、宮頸分泌物:分泌物棉拭子放入有Iml注射用生理鹽水的1.5ml離心管中，充分洗滌后擠干，棄去棉球，將浸出液15，OOOrpm離心15分鐘，棄上清。在沉淀中加入50ulDNA提取液，吹打均勻后100°C沸水浴15分鐘，15，OOOrpm離心10分鐘。3.加樣、PCR擴增將樣品處理上清液(凍存樣品使用前室溫充分融化,振蕩混勻數秒，13，OOOrpm離心2分鐘)和陽性校準品，臨界陽性校準品(使用前應先離心，再充分振蕩混勻)陰性對照各4ul分別加入反應管1、2中，混勻后置于自動熒光PCR儀上，立即進行PCR擴增反應。其中反應管I采用雙通道檢測(FAM-TAMRA和J0E-TAMRA)，反應管2用單通道檢測(FAM-TAMRA)。反應程序為:程序段一:50°C 2min，程序段二:94°C 5min，程序段三:94°C 15s，60°C 45s，40個循環，每個循環在60°C熒光檢測。若為空氣加熱的儀器，程序段三60°C延伸的時間可以縮短到30s。4.結果判斷:定性判斷
權利要求
1.人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒，其特征在于，試劑盒包括:PCR反應液1、PCR反應液2、HPV16U8型探針、內參熒光探針、Mgcl2、Taq酶、DNA提取液、陽性校準品、臨界陽性校準品、陰性對照。
2.根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測檢測方法與試劑盒，其特征在于，在Taq酶加入了防污染的UNG酶，在50°C時其能有效降解擴增前存在于反應體系中包含dUTP的DNA片段。
3.根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒，其特征在于，利用HPV16的早期開放讀碼框架E7設計一對HPV16特異性引物和特異性探針，利用HPV18的早期開放讀碼框架El設計一對HPV18特異性引物和特異性探針，并且管家基因三憐酸甘油醒脫氫!酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內參對照設計了另外一對特異引物和探針以檢測取樣和提取的效果。其序列如下: HPV16的引物與探針:HPV16F:5’ AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT3，HPV16R:5’ AGAGTCACACTTGCAACAAAAGGT3’HPV16P:5’ ACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCAT3， HPV18的引物與探針:HPV18F:5’ ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGA3 HPV18R:5’ AACCGTGGACTTAACTCTGTATCCA3’HPV18P:5’ ACAGCACAGGCATTGTTCCATGCG3’ GAPDH的引物與探針:GAPDHF:5’ TGTGGCTCCCTTGGGTATATG3’GAPDHR:5’ CATCGCCCCACTTGATTTTG3’GAPDHP:5， CCCCCACCCCCATAGGCGAGAT3，。
4.根據權利2所述的一種人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒，其特征在于，陽性校準品中包含了三段人工合成的核苷酸片段，即HPV16引物(HPV16F、HPV16R)、HPV18 引物(HPV18F、HPV18R)和內參對照 GAPDH 引物(GAPDH F、GAPDHR)擴增的3段序列而合成的3條核苷酸片段。核苷酸片段序列如下:HPVI6 E7 Seq:AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTHPV18 El Seq:ATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGCAGGAGGTCCACAATGATGCACAAGTGTTGCATGTTTTAAAACGAAAGTTTGCAGGAGGCAGCACAGAAAACAGTCCATTAGGGGAGCGGCTGGAGGTGGATACAGAGTTAAGTCCACGGTTGAPDH Seq:TGTGGCTCCCTTGGGTATATGGTAACCTTGTGTCCCTCAATATGGTCCTGTCCCCATCTCCCCCCCACCCCCATAGGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATGo
5.根據權利要求3所述的人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒，其特征在于，標記探針的熒光發光基團為FAM、TET、JOE、CY3、CY5、CY5.5、Fluorescein、RhodamineΛ Rhodamine 6G、Orengon Greeen 488、Orengon Greeen 500、Orengon Greeen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine Orange 或 ROX 中的任意一種或一種以上的組合，熒光猝滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-U BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上組合。
6.根據權利要求5所述的人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒，其特征在于，探針HPV16 P用FAM-TMARA標記、HPV18 P用J0E-TMARA標記、GAPDHP用FAM-TMARA 標記。
7.根據權利要求1-6所述的人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒，其特征在于，每個樣本通過2管檢測，其中一管利用雙通道檢測HPV 16，18型，另外一管檢測GAPDH， 該方法能在同一管中準確檢測并區分出HPV16，18高危型。
全文摘要
本發明提供了一種人乳頭瘤病毒(HPV)16，18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒。本檢測方法針對HPV 16，18的DNA序列分別設計了2對特異性引物和2條Taqman引物探針，利用不同的熒光基團組合進行標記探針，從而在同一擴增管中準確的檢測并區分出HPV16，18感染。同時，該方法利用人的管家基因三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參基因，設計了一對了特異性引物與探針。內參對照可以有效監測HPV檢測過程中擴增前樣本取樣和處理效果，從而有效的降低了假陰性的出現。本發明的試劑盒性能穩定、檢測快速、操作簡便、結果準確，能有效的檢測出區分出HPV16，18高危型別，可作為宮頸癌篩查的有效方案。
文檔編號C12Q1/68GK103184294SQ20111044822
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者徐棟, 江培學 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司