專利名稱：一種人乳頭瘤病毒(hpv)的分型定量檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，尤其是一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法及試劑盒。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,簡稱HPV)是一種嗜上皮性病毒，有高度的特異性。根據致病力強弱，HPV被分為高危型和低危型兩種，“是否能致癌”是危險度大小的主要標志。全世界每年宮頸癌的新發病例大約有500，000，是除乳腺癌之外威脅女性生命健康的第二大惡性腫瘤。HPV和宮頸癌的病因學關系已經明確，從HPV感染到宮頸癌發生需要較長時間，在此期間通過檢測可以了解是否感染HPV，早發現早治療，從而有效預防宮頸 癌的發生。目前主要的技術方法如下1.原位雜交優點是特異性好；缺點是操作繁瑣費時耗力、需要大量較純的DNA。2. DNA直接捕捉法優點是有大量的數據支持該技術的應用，能檢測高危型別；缺點是靈敏度低于PCR ;不能確定具體的HPV亞型。3.亞型特異性PCR :優點是特異性較好；缺點是勞動強度大。4.通用引物PCR:優點是靈敏度高，一次可以擴增多種亞型；缺點是不能區分確定具體HPV的亞型。5. PCR產物直接測序優點是在確定目前尚未知道的HPV亞型感染以及突變研究時尤其有用；缺點是不是十分靈敏，特別是對HPV混合感染的臨床樣本更是如此，不宜作為體外診斷方法。6. PCR-酶聯免疫分析法優點是靈敏度高；缺點是樣本消耗大。7. PCR-固相反向雜交法優點是效率高、一次實驗可分出多個HPV亞型；缺點是重復性較差。8.熒光定量PCR:優點是靈敏度高、操作方便、耗時短；缺點是通量少、一次只能檢測1-2個亞型、且不能確切分型。9.優點是成本相對較低，操作簡單；缺點是可以觀察到細胞形態的變化，但不能確定發生細胞形態變化的病因；取樣的部位決定檢測的結果。綜上，目前的人乳頭瘤病毒(HPV)的主要檢測方法存在操作繁瑣費時耗力、靈敏度低、勞動強度大、樣本消耗大、重復性較差、通量少的缺點。

發明內容
本發明的目的是提供一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法。本發明采用如下技術方案本發明的一個方面涉及一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟⑴收集宮頸樣品；⑵樣品DNA提取；(3)以提取的DNA樣品為模板進行PCR反應；
(4)以毛細電泳的方法分離樣品。優選地，所述步驟(2)包括如下子步驟I)取500 μ L細胞保存液于1. 5mL EP管中，13000g離心5分鐘,去掉上清液,底部為宮頸脫落細胞；
2)向含有宮頸脫落細胞的EP管中加入500 μ L裂解液，裂解10分鐘；3)向裂解液中加入100 μ L磁珠吸附游離的DNA ；4)用清洗液將磁珠清洗兩次；5) 100 μ L 洗脫液洗脫 DNA。優選地，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環反應的子步驟。優選地，所述步驟⑶的子步驟中的熱循環溫度分別為94°C、60°C、70°C、4°C。優選地，所述步驟(4)包括制備GeXP遺傳分析儀樣品、準備分離液、毛細電泳分離樣品、結果分析的步驟。 本發明的另一方面涉及一種用于上述方法的試劑盒，包括以下試劑引物管、溶液X、PCR緩沖劑、25mM氯化鎂、聚合酶以及陽性對照。本發明的有益效果為1.靈敏度高、重復性好采用激光誘導熒光-PMT，具有超高靈敏度。2.準確性強=GeXP采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性。3.高通量本系統采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測30-40個位點，可同時做192個反應(如192個患者樣品，每個樣品檢測19種呼吸道病毒，22個位點)，一天出結果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。4.精確定量可精確定量病原體基因拷貝數。5.靈活性強可隨時根據需求增加或刪減HPV亞型。6.成本低利于大規模推廣。
具體實施例方式下面根據實施例對本發明作進一步詳細說明。本發明創立了一種一次性檢測25種HPV亞型，包括6種低危型6、11、42、43、44、81和 19 種高危型 HPV 亞型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83
的分型定量檢測方案，具體亞型見表I。本發明的25種HPV亞型的特異性引物是針對各亞型基因組上的致癌基因E6/E7設計的，再通過多重PCR和毛細電泳的方法，根據擴增片段長度的不同將各亞型分辨出來。建立了可靠的樣品質量及反應過程的對照(表I)a)人DNA完整性的對照內參β -globin :確保在檢驗過程中對樣品質量的判斷，避免假陰性。b)正常反應對照內參pcDNA3.1 (+):監控PCR反應效率，避免假陰性。2.通過人為加入反應內參pcDNA3. 1(+)對HPV亞型的拷貝數進行定量。3. 25種HPV分型檢測的引物序列(見表2)。表1.檢測的HPV亞型和反應參照
權利要求
1.一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟 (1)收集宮頸樣品； (2)樣品DNA提??； (3)以提取的DNA樣品為模板進行PCR反應； (4)以毛細電泳的方法分離樣品。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(2)包括如下子步驟 1)取500μ L細胞保存液于1. 5mL EP管中，13000g離心5分鐘，去掉上清液，底部為宮頸脫落細胞； 2)向含有宮頸脫落細胞的EP管中加入500μ L裂解液，裂解10分鐘； 3)向裂解液中加入100μ L磁珠吸附游離的DNA ； 4)用清洗液將磁珠清洗兩次； 5)100 μ L洗脫液洗脫DNA。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環反應的子步驟。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，所述步驟(3)的子步驟中的熱循環溫度分別為94。。、60。。、70。。、4。。。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(4)包括制備GeXP遺傳分析儀樣品、準備分離液、毛細電泳分離樣品、結果分析的步驟。
6.一種用于前述權利要求中的任一項所述的方法的試劑盒，包括以下試劑引物管、溶液X、PCR緩沖劑、25mM氯化鎂、聚合酶以及陽性對照。
全文摘要
本發明公開了一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟(1)收集宮頸樣品；(2)樣品DNA提?。?3)以提取的DNA樣品為模板進行PCR反應；(4)以毛細電泳的方法分離樣品。本發明具有靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的優點。
文檔編號C12Q1/68GK102994647SQ20121020656
公開日2013年3月27日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者吳勇, 孫婷婷 申請人:寧波海爾施基因科技有限公司