專利名稱：一種質粒dna或反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法
技術領域：
本發明屬于胚胎轉染領域，涉及一種質粒DNA或反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法。
背景技術：
哺乳動物早期胚胎發育由其自身的遺傳機制所控制，研究該遺傳機制所采用的基本方法是調控關鍵基因的表達，觀察后續的發育情況并分析該關鍵基因在發育過程中所發揮的作用。目前，將外源基因導入胚胎進行過表達或抑制基因的表達是研究基因功能一貫且經典的方法。把外源基因轉入到細胞/胚胎或整合到基因組主要通過轉染、病毒載體的感染和顯微注射，而抑制基因的表達主要依靠基因敲低和基因敲除技術。然而，就附植前胚胎而言，通過轉染或病毒載體的感染而把外源基因導入十分困難，因為附植前胚胎外面由一層透明帶包裹。基因敲除技術雖好但不能廣泛的應用，因為此技術費時費力且花費巨大。目前外源基因和下調基因表達的序列包括dsRNA、siRNA以及反義寡核苷酸主要通過顯微注射導入附植前胚胎。此種方法效率很低，因為將外源基因和dsRNA、siRNA以及反義寡核苷酸導入2-細胞期以后的附植前胚胎需要逐個卵裂球的注射，費時費力且每次只能操作一個胚胎。抑制基因表達的方法根據原理不同大致可分為兩類第一，利用siRNA或dsRNA降解靶mRNA，使關鍵基因失去翻譯的模板；第二，利用反義寡核苷酸與靶mRNA進行結合，要么抑制靶mRNA的翻譯，要么改變靶mRNA的剪切，進而表現出某關鍵基因失活的表型。以前， 抑制基因的表達時，運用最多的是siRNA和dsRNA，但最近幾年，反義寡核苷酸的運用有上升的趨勢，因為反義寡核苷酸不降解靶mRNA且不易被RNase H降解，在細胞或胚胎內能維持較長時間。目前，發育生物學家多采用顯微注射的方法將反義寡核苷酸注入卵子或者斑馬魚、青蛙、海鞘、海膽等的受精卵中進而研究胚胎發育。此方法能準確控制反義寡核苷酸的導入時間，但該方法對操作人員的技術要求很高，且每次只能注射一個胚胎，效率很低因此，亟待尋求一種將外源基因或特異序列快速高效導入小鼠附植前胚胎的方法，為進一步深入研究小鼠早期胚胎發育機理提供技術支持。電穿孔技術主要是利用瞬時的脈沖電場改變細胞膜脂質雙層的結構，使細胞膜形成暫時性的孔洞，大分子在電場的作用下進入細胞或胚胎。在成功的電轉中，電通透作用和電泳作用起著非常關鍵的作用，此外，大分子的被動擴散和細胞內吞也起了一定的作用。而利用電穿孔技術將質粒DNA或反義寡核苷酸導入附植前胚胎的報道至今未見。

發明內容
本發明解決的問題在于提供一種質粒DNA或反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法，實現對胚胎進行安全、簡便、高效的轉染。本發明是通過以下技術方案來實現
一種質粒DNA或反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法，包括以下步驟 1)將待轉染的質粒DNA用電轉緩沖液稀釋至濃度為10 80 μ g/ml，得到質粒DNA
電穿孔溶液；或者將待轉染的反義寡核苷酸用電轉緩沖液稀釋至濃度為0. 2mM，得到反義寡核苷酸電穿孔溶液；2)將待轉染的附植前胚胎置于酸性臺氏液中，室溫孵育10 20s，然后終止消化并清洗；3)將質粒DNA電穿孔溶液或反義寡核苷酸電穿孔溶液加入電轉皿兩根電極之間的凹槽中，將附植前胚胎線性排列在電轉皿的兩根電極之間，在脈沖電場下，利用電穿孔法對附植前胚胎進行轉染。所述的質粒DNA在轉染前還進行去內毒素處理，將去內毒素處理的質粒DNA用電轉緩沖液Opti-MEM I進行稀釋。所述的將附植前胚胎在進行酸性臺氏液處理之前，還對胚胎用H-KSOM溶液清洗。所述的終止消化是將胚胎從酸性臺氏液轉移到H-KSOM溶液中清洗，然后再用 Opti-MEM I溶液清洗。所述的轉染的質粒DNA為帶有熒光基因的質粒DNA ；所述的反義寡核苷酸在轉染前還進行lissamine標記，將lissamine標記的反義寡核苷酸用電轉緩沖液Opti-MEM I進行稀釋。所述的轉染的質粒DNA包括一種或多種以上序列不同的質粒DNA。所述的附植前胚胎包括處于不同發育時期的附植前胚胎。所述的電穿孔法進行質粒DNA轉染的參數控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數3 4次。所述的附植前胚胎為小鼠附植前胚胎，電轉參數控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數3 4次。所述的電穿孔完成后，將轉染后的胚胎清洗并轉移入KSOMaa培養液中培養。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的質粒DNA或反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法，首先對胚胎透明帶結構使用臺氏液進行弱化處理，然后再將處理后的胚胎置于脈沖電場作用下，細胞膜脂雙層上形成瞬時微孔，導致其通透性和膜電導瞬時增大，可以使在正常生理情況下細胞膜難以通透的質粒DNA或反義寡核苷酸進入細胞。由于采用了電穿孔轉染的方法，本發明還能同時將兩種或多種質粒DNA —起轉入附植前胚胎，如果構建的質粒DNA所攜帶的外源片段是某個關鍵基因或靶向某個關鍵基因的干擾片段，則可具體研究某個關鍵基因在小鼠附植前胚胎的發育過程中所起的具體作用。由于采用了電穿孔轉染的方法，本發明能將所設計的、與不同靶基因的mRNA結合的反義寡核苷酸轉染到胚胎內，可用于研究目的基因在小鼠附植前胚胎的發育過程中所起的具體作用。為了進一步觀察或跟蹤轉染效果，待轉染的質粒DNA帶有熒光基因，而待轉染的反義寡核苷酸進行Iissamine(麗絲胺，可以發紅色熒光)標記，這樣在電穿孔轉染后通過熒光顯微鏡可以直觀的觀察。本發明將質粒DNA或反義寡核苷酸轉入附植前胚胎省時、省力、花費少、操作簡單、對操作者以及操作的胚胎沒有毒性、效率高、速度快。一次可操作50 100枚胚胎，電轉時間在Imin以內。電轉后體外培養Mh，通過熒光顯微鏡對胚胎進行觀察并進行統計學分析表明，本發明的電轉效率約為97%。為采用質粒DNA或反義寡核苷酸所針對的基因或基因轉錄物研究其在胚胎中的功能提供了有效的轉染方法。


圖1為質粒DNA轉入不同發育時期附植前胚胎的顯微照片；圖2為反義寡核苷酸轉入不同發育時期附植前胚胎的顯微照片。
具體實施例方式附植前胚胎的發育主要經歷三次轉變(分別為合子基因組激活、致密化和囊胚形成)和兩次譜系分化(滋養外胚層和內細胞團的分化、內細胞團分化為原始內胚層和外胚層)。每次轉變或譜系分化都伴隨著胚胎基因表達的巨大變化，因此，研究胚胎在轉變或譜系分化過程中表達變化比較大的基因能進一步的揭示早期胚胎發育所蘊藏的分子調控機制。然而，目前常用的技術在研究基因功能方面都存在一定的缺陷。本發明提供的轉染附植前胚胎的方法，采用電穿孔的方法轉染質粒DNA，利用了電穿孔低毒性、效率高、速度快的優勢。下面結合具體的電穿孔過程和轉染結果對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。所述的轉染附植前胚胎的方法，通過胚胎透明帶和細胞膜在脈沖電場下形成的瞬時微孔進入胚胎，是一種生物物理的轉染方法，所以待轉染的胚胎并無特殊的種屬要求。由于形態結構差異較大的胚胎進行電穿孔時的透明帶弱化時間和電穿孔參數可能會有一些差別，然而本領域技術人員能夠通過所提供的方法進行很少次數的實驗從而對于這些具體的參數進行篩選和優化，即可確定相應胚胎的最優參數，完成胚胎轉染。質粒DNA和反義核苷酸分別是研究基因功能的兩種不同的分子工具。利用質粒 DNA轉染可以對關鍵基因進行過表達和抑制表達的研究，還可以同時轉染幾種不同的質粒， 而反義核苷酸只能抑制基因的表達。相對反義核苷酸而言，質粒DNA的分子較大。下面具體以哺乳類動物特別是小鼠附植前胚胎作為實施對象，詳細說明質粒DNA 轉染附植前胚胎的方法，此類胚胎形態差異小，透明帶結構成分相似，因此轉染條件和電穿孔參數設置變化不大。實施例1質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，包括以下步驟1、首先對對質粒DNA進行預處理a、具體采用的質粒DNA為pIRES2-AcGFPl_Nuc (Clontech)例進行說明，質粒DNA 根據需要可以采用不同的質粒載體攜帶不同的目的基因，待轉染的質粒載體一般要求帶有熒光標記基因或其它標記基因，以便于后續的觀察及篩選；將質粒DNA進行去內毒素處理，去內毒素處理是為了消除質粒中的內毒素對胚胎的生長發育造成影響；b、將去內毒素的質粒DNA稀釋在Opti-MEM I溶液中，質粒DNA不同，電轉時稀釋的濃度也不同，pIRES2-AcGFPl-Nuc質粒DNA稀釋后的濃度控制為40μ g/ml ；雖然每種質粒DNA的表達情況都不盡相同，通過多次實驗之后可適當調整。2、小鼠胚胎進行透明帶弱化的預處理a、將收集得到的不同時期的小鼠附植前胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去組織碎片和顆粒細胞；100ml H-KS0M 工作液配方為=NaCl, 0. 5552g ；KC1，0. 0186g ；KH2PO4,0. 0047 ；D-葡萄糖，0. 0036 ；NaHCO3,0. 0336g ；丙酮酸鈉，0. 0022g ；L-谷氨酰胺，0. 0146g ；EDTA-Na2, 0. 0014g ；CaCl ‘ 2H20,0. 0250g ；MgSO4,0. 0024g ；HEPES,0. 2384g ；必需氨基酸(EAA， invitrogen,50X) ,2ml ；非必需氨基酸(NEAA, invitrogen, 100 X , Iml ；60 % 乳酸鈉， 350 μ 1;牛血清白蛋白(BSA), 0. 6g ；b、將收集好的胚胎置入酸性臺氏液(sigma，美國，T1788)中15s，進行透明帶弱化處理；不同胚胎的具體的弱化時間可通過多次實驗進行篩選而獲得；C、將弱化處理過的小鼠胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去酸性臺氏液；d、將胚胎在Opti-MEM I溶液中洗3次，之后置入稀釋有質粒DNA的 Opti-MEM I溶液中；完成對胚胎的預處理之后，對胚胎進行電穿孔，具體操作包括以下步驟1)使用電穿孔儀(ECM 2001Electro Cell Manipulator，BTX，美國)進行電穿孔， 質粒DNA溶液加入電轉皿取30 μ 1質粒DNA溶液加入電轉皿兩根電極之間的凹槽；2)小鼠附植前胚胎置入電轉皿兩根電極之間將小鼠不同時期的附植前胚胎線性排列在電轉皿的兩根電極之間；3)質粒DNA的電轉電轉參數是電壓30V，脈沖長度1ms，脈沖次數2次，重復次數1次；4)電轉后胚胎的培養將胚胎吸出并在操作液H-KSOM中洗3次，之后培養在 KSOMaa培養液中；100ml KSOMaa 培養液配方如下NaCl，0. 5552g ；KCl，0. 0186g ；KH2PO4,0. 0047g ； D-葡萄糖，0. 0036g ；NaHCO3,0. 2Ig ；丙酮酸鈉，0. 0022g ；L-谷氨酰胺，0. 0146g ；EDTA-Na2, 0. 0014g ；CaCl · 2H20,0. 0250g ；MgSO4,0. 0024g ；必需氨基酸(EAA, Invitrogen, 50 X)，2ml ； 非必需氨基酸(NEAA，Invitrogen, 100 X, Iml ；60%乳酸鈉，350 μ 1 ；牛血清白蛋白(BSA)， 0. 6 0. 8g。5)在熒光顯微鏡下觀察胚胎發綠色熒光的情況電轉24h后，將不同時期的胚胎置于熒光顯微鏡下觀察照相并計算電轉效率。熒光顯微鏡觀察結果如圖1所示，其中圖A、圖B、C、圖D、圖E和圖F分別在1_細胞胚胎、2-細胞胚胎、4-細胞胚胎、8-細胞胚胎和桑椹胚時進行的質粒DNA轉染結果，對熒光亮度的定性的觀察結果顯示，在不同時期的胚胎轉染都達到了良好的轉染效果。實施例2反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法，包括以下步驟
1、首先對反義寡核苷酸進行預處理a、具體采用標準對照反義寡核苷酸為例進行說明，反義寡核苷酸根據需要可以針對不同的目的基因來設計，待轉染的反義寡核苷酸一般帶有熒光基團標記，以便于后續的觀察及篩選；具體采用lissamine標記的標準對照反義寡核苷酸(商品化的)，不會影響任何基因的功能，在正常的實驗中僅僅是一個對照組。由于反義寡核苷酸的序列非常短，僅僅25bp 左右，由人工合成。只要標準對照反義寡核苷酸能夠轉染成功，其它針對任何基因的反義寡核苷酸都能轉進去。b、將lissamine標記的反義寡核苷酸稀釋在Opti-MEM I溶液中，反義寡核苷酸不同，電轉時稀釋的濃度也不同，標準對照反義寡核苷酸稀釋后的濃度控制為0. 2mM ；雖然每種反義寡核苷酸所針對的靶基因轉錄物都不盡相同，通過多次實驗之后可適當調整其轉染濃度。2、小鼠胚胎進行透明帶弱化的預處理a、將收集得到的不同時期的小鼠附植前胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去組織碎片和顆粒細胞；100ml H-KS0M工作液配方同實施例1 ；b、將收集好的胚胎置入酸性臺氏液(sigma，美國)中15s，進行透明帶弱化處理； 不同胚胎的具體的弱化時間可通過多次實驗進行篩選而獲得；C、將弱化處理過的小鼠胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去酸性臺氏液；d、將胚胎在Opti-MEM I溶液中洗3次，之后置入反義寡核苷酸稀釋液中；完成對胚胎的預處理之后，對胚胎進行電穿孔，具體操作包括以下步驟1)使用電穿孔儀(ECM 2001Electro Cell Manipulator，BTX，美國)進行電穿孔， 反義寡核苷酸溶液加入電轉皿取30 μ 1反義寡核苷酸溶液加入電轉皿兩根電極之間的凹槽；2)小鼠附植前胚胎置入電轉皿兩根電極之間將小鼠不同時期的附植前胚胎線性排列在電轉皿的兩根電極之間；3)反義寡核苷酸的電轉電轉參數是電壓30V，脈沖長度1ms，脈沖次數2次，重復次數1次；4)電轉后胚胎的培養將胚胎吸出并在操作液H-KSOM中洗3次，之后培養在KSOM 培養液中；100ml KSOM培養液配方同實施例1 ；5)在熒光顯微鏡下觀察胚胎發綠色熒光的情況電轉24h后，將不同時期的胚胎置于熒光顯微鏡下觀察照相并計算電轉效率。熒光顯微鏡觀察結果如圖2所示，圖A、圖B、圖C、圖D、圖E和圖F分別在1_細胞胚胎、2-細胞胚胎、4-細胞胚胎、8-細胞胚胎和桑椹胚時進行的反義寡核苷酸電轉結果，對熒光亮度的定性的觀察結果顯示，在不同時期的胚胎轉染都達到了良好的轉染效果。
權利要求
1.一種質粒DNA或反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將待轉染的質粒DNA用電轉緩沖液稀釋至濃度為10 80μ g/ml，得到質粒DNA電穿孔溶液；或者將待轉染的反義寡核苷酸用電轉緩沖液稀釋至濃度為0. 2mM，得到反義寡核苷酸電穿孔溶液；2)將待轉染的附植前胚胎置于酸性臺氏液中，室溫孵育10 20s，然后終止消化并清洗；3)將質粒DNA電穿孔溶液或反義寡核苷酸電穿孔溶液加入電轉皿兩根電極之間的凹槽中，將附植前胚胎線性排列在電轉皿的兩根電極之間，在脈沖電場下，利用電穿孔法對附植前胚胎進行轉染。
2.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的質粒DNA 在轉染前還進行去內毒素處理，將去內毒素處理的質粒DNA用電轉緩沖液Opti-MEM I進行稀釋。
3.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的將附植前胚胎在進行酸性臺氏液處理之前，還對胚胎用H-KSOM溶液清洗。
4.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的終止消化是將胚胎從酸性臺氏液轉移到H-KSOM溶液中清洗，然后再用Opti-MEM I溶液清洗。
5.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的轉染的質粒DNA為帶有熒光基因的質粒DNA ；所述的反義寡核苷酸在轉染前還進行lissamine標記，將lissamine標記的反義寡核苷酸用電轉緩沖液Opti-MEM I進行稀釋。
6.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的轉染的質粒DNA包括一種或多種以上序列不同的質粒DNA。
7.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的附植前胚胎包括處于不同發育時期的附植前胚胎。
8.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的電穿孔法進行質粒DNA轉染的參數控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數3 4次。
9.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的附植前胚胎為小鼠附植前胚胎，電轉參數控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數3 4次。
10.如權利要求1所述的質粒DNA轉染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的電穿孔完成后，將轉染后的胚胎清洗并轉移入KSOMaa培養液中培養。
全文摘要
本發明公開了一種質粒DNA或反義寡核苷酸轉染附植前胚胎的方法，包括以下步驟1)配制待轉染的電穿孔溶液；2)對胚胎透明帶進行弱化處理；3)將胚胎移入配制好的含電穿孔溶液，室溫靜置，然后再將胚胎連同電穿孔溶液移入電轉槽中進行電穿孔。由于采用了電穿孔轉染的方法，本發明還能同時將兩種或多種質粒DNA，或者反義寡核苷酸一起轉入附植前胚胎，如果構建的質粒DNA所攜帶的外源片段是某個關鍵基因或靶向某個關鍵基因的干擾片段，則可具體研究某個關鍵基因在小鼠附植前胚胎的發育過程中所起的具體作用。
文檔編號C12N15/87GK102559752SQ20111040379
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者常博皞, 張涌, 彭輝 申請人:楊凌科元克隆股份有限公司, 西北農林科技大學