專利名稱：基于微小rna的宮頸癌診斷和治療方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用微小RNA(HIiciX)RNA)進行宮頸癌的診斷和治療的方法。通過檢測微小RNA的表達，對宮頸癌進行診斷；通過給病人抑癌作用的微小RNA，或者抑制致癌微小RNA的活性，達到治療宮頸癌的目的。
背景技術：
眾所周知，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因。E6和E7是在HPV感染的早期出現(xiàn)的兩種主要癌蛋白，在宮頸癌組織和宮頸癌誘導的細胞系中均表達升高。盡管微小RNA的生物學功能還不十分清楚，ー些研究發(fā)現(xiàn)微小RNA可導致各種癌癥的發(fā)生發(fā)展，而且它有可能參與細胞自然抵抗病毒感染的過程。微小RNA用于診斷有些微小RNA的降低導致了靶向的致瘤基因的調控紊亂， 進而加速了致瘤基因的轉化。例如，在慢性粒細胞性白血病和前列腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-15a，miR-16-l的表達缺失，在3'端的UTR區(qū)Bcl_2轉錄子與miR_15a，miR-16-l結合，從而降調抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達。同時miR-15a，miR-16-l促進白血病細胞系的凋亡。所以miR-15a，miR-16-l被認為是誘導原癌基因Bcl-2mRNA失活的腫瘤抑制劑。微小RNA與宮頸癌發(fā)病機制的關系之間的研究并不多見。我們用基因芯片的方法對1145種微小RNA在宮頸癌腫瘤組織和癌旁組織的表達進行了比較，發(fā)現(xiàn)了與宮頸癌的發(fā)病相關聯(lián)的微小RNA.我們通過研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織，宮頸癌細胞系的微小RNA表達譜，確定ー個精確的宮頸癌診斷和分類系統(tǒng)，也為發(fā)現(xiàn)新型治療靶點提供了理論依據(jù)。微小RNA用于癌癥的治療一些微小RNA是癌基因，一些是抑癌基因,還有一些參與腫瘤的轉移。因此模擬天然的Pri-微小RNA和Pre-微小RNA的人工微小RNA正應用于基因的研究和治療領域。ー些研究表明微小RNAs可以作為很多疾病有用的治療靶點。對于那些致癌性微小RNAs，它的潛在的治療方法包括微小RNAs沉默，反義阻抑和微小RNA修正。而對于抑癌性微小RNAs，過表達它們可能是抑制腫瘤細胞生長的最有效的策略。微小RNA沉默是在它的生成過程中阻止其成熟的ー種方法。這可以通過干擾微小RNAs生成過程中的ー些成分如Drosha等的活性來實現(xiàn),寡核苷酸導入不同的pri-微小RNAs中也可能干擾發(fā)卡結構的形成。Pre-微小RNA的siRNA也可抑制微小RNA的合成,但是它的效率卻不高。化學修飾的寡核苷酸反義阻抑是最常用的ー種抑制微小RNA功能的方法，這些寡核苷酸叫做微小RNA“拮抗劑”，它們能夠特異性的有效沉默微小RNA的表達。這種拮抗作用是特異的、有效的和長久的，它們可用于抗癌治療中沉默癌性微小RNAs有力的工具。LNA (Locked nucleic acid)變更常常導致溶解溫度的提高并且增加了雙鏈的穩(wěn)定性。LNA可以按照不同的模式合成，它的優(yōu)點在于高的親和力，好的甚至可以提高錯配的識別能力，低毒性并且可以增加代謝的穩(wěn)定性。它最吸引人的地方在于它在體內發(fā)揮抑制癌性微小RNAs的作用是RNAi永遠也達不到的，也就是說LNA可以作為一個最有希望的抗癌的的反義治療方法。
微小RNA激動劑可用模擬微小RNA結構的微小RNA模擬物(Mimics)，也可以通過表觀遺傳學的作用來提高細胞內源性抑癌性微小RNA的表達。近十年來，隨著微小RNAs發(fā)現(xiàn)和研究的快速進展，微小RNA表達譜對闡明疾病發(fā)生機制和提供新的治療策略將發(fā)揮重要作用。而且，微小RNAs的突變或異常表達以及他們所控制的通路可能將成為有用的治療靶點。因此，微小RNA是腫瘤分類、早期檢測、疾病預后、制定治療方案和治療靶點等方面的重要工具。

發(fā)明內容
本發(fā)明主要針對臨床上宮頸癌的診斷和治療效果不佳的問題，提供了基于微小RNA的診斷、治療的解決方法。我們首先應用芯片技術對宮頸癌及癌周組織微小RNAs的表達情況進行了研究。我們應用的芯片中包含了 miRBase數(shù)據(jù)庫中幾乎所有的微小RNAs，這就為我們發(fā)現(xiàn)與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的微小RNAs提供了重要的技術支持和保障。本實驗通過篩查用7個微小RNAs (4個上調，3個下調)將上述兩組組織準確的區(qū)分開來，并且發(fā)現(xiàn)了miR-886-5p (也叫VaultRNA2)在宮頸癌組織中表達最高。miR-886_5p、miR-610、miR-10a*、miR_30a*在宮頸癌組織中表達明顯高于癌周組織，是致癌性微小RNA ；而宮頸癌組織中表達下調的包括miR-302d、miR-346、和miR_518b是抑癌性微小RNA ;測定這些微小RNA可幫助宮頸癌的診斷；miR-886-5p、miR-610, miR-10a*、miR_30a*的抑制劑可用于腫瘤的治療；激活抑癌性微小RNAmiR-302d、miR-346、和miR_518b或者直接用這些抑癌性微小RNA的模擬物(mimics)也可以用于治療宮頸癌。微小RNA可以調控細胞內重要的細胞凋亡通路，比如，miR-886-5p(VaultRNA2)降低細胞凋亡或細胞周期抑制蛋白Bax、p53和pl4的含量。提示這些微小RNA的作用物可以用干與化療藥的合并用藥，提高化療效果。本方法具有如下的優(yōu)點和效果本發(fā)明用微小RNA進行宮頸癌的診斷。在以往的研究中，mRNA在臨床主要應用于腫瘤診斷，預后分析和腫瘤的治療。研究發(fā)現(xiàn)基于微小RNA的分類方法比基于mRNA的分類方法更為準確。因為相較需要分析成千上萬的mRNA的方法，現(xiàn)在只需分析幾百種微小RNAs即能有效的進行診斷。不同腫瘤特異的微小RNA表達譜可以成為癌癥診斷和預后評判的有用的指標。另外，微小RNA特別穩(wěn)定，不像mRNA —樣容易分解。利用微小RNA進行治療，可以同時進行靶向多個蛋白質，因為微小RNA常控制一系列功能蛋白的表達。以腫瘤特異性微小RNA作為靶點，可以減少對正常細胞的毒性作用。


圖I為在宮頸癌腫瘤組織升高和降低的微小RNA圖2為各個微小RNA的序列圖3為過表達miR-886后細胞的生長增加
圖4為用miR-886_5p的拮抗劑后細胞凋亡的變化圖5為用miR-886_5p的激動劑(模擬物)后細胞凋亡蛋白質Bax的表達增加。
具體實施例方式實施實例I用Real-time PCR(實時定量PCR)的方法對宮頸組織或細胞的miR-886_5p進行定量分析。I.用Trizol等方法提取細胞總RNA，并進行定量；2.用 Stem-Loop 引物進行 microRNA 逆轉錄。MiR_886_5p Stem-Ioop RT引物序列5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCGCTT-3'；上游引物序列為5'-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3'；下游引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；內參U6SnRNA:Stem-Ioop 引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；上游引物序列為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'；下游引物序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。3.逆轉錄(Reverse-transcriptase, RT)體系的配制每個10 μ I的RT體系，其中加入O. 5-1 μ g的總RNA作為模板(另6對宮頸癌及癌周組織提取的總RNA，提取步驟同前)。體系如下(具體體系需要根據(jù)RT酶的說明而定)，在O. 5ml的薄壁管(或200 μ I PCR小管)中依次加入下列組分
總 RNA 模板O. 5-1 Ug
dNTP混合物(IOmM )0.5u I
IOOmM DTTO. 5 μ I
RNase 抑制劑 40U/ μ IO. 25 μ I
Stem-loop RT 引物(IwM)O. 5u I
M-MuLv反轉錄酶O. 5 U I
5X First-strand Buffer2 μ I
1%DEPC 水補足 10 μ IStem-Loop引物的microRNA逆轉錄,運行RT程序16 0C X30min42 °C X45min85 °C X5min4°C Hold Stem-Loop引物的microRNA逆轉錄，RT產物的保存短期使用，于4°C保存；長期保存，分裝后置于-70°C。3. Real-time PCR 檢測Real-time PCR 體系配制(25 μ I)
反應體系
Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix12. 5μ I
上游引物(ΙΟμΜ)1μ I
下游引物(IOuM)1μ I
cDNA 模板2 μ I 加無菌水至25 μ IPCR 程序為
95°C (I)6min
95O (2)30s
60°C (3)Imin
重復2—340次 根據(jù)(2_Λετ)計算每對樣本的相對表達量。序列表〈110〉首都醫(yī)科大學〈120〉基于微小RNA的宮頸癌診斷和治療方法〈140>201210005318· X<141>2005-01-10<160>13<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>50<212>DNA〈213〉人工的〈220〉 <223>Stem-loop RT 引物〈400〉Igtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccgctt 50<210>2<211>18<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物
<400>2cgggtcggagttagctca18
<210>3<211>16<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>3gtgcagggtccgaggt16<210>4<211>19<212>DNA〈213〉人工的〈220〉<223>Stem-loop RT 引物<400>4ggaacgcttcacgaatttg19<210>5<211>23<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>5attggaacgatacagagaagatt23<210>6<211>19<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>6ggaacgcttcacgaatttg23<210>7<211>23<212>RNA〈213〉人屬(Homo Sapiens)〈220〉〈223>miR-886_5p<400>權利要求
1.我們對宮頸癌組織和癌旁組織的微小RNA(HiiciX)RNA)進行了比較，發(fā)現(xiàn)了一組在癌癥表達升高的微小RNA，一組在癌癥組織降低的微小RNA。我們的研究結果提示微小RNA可用于宮頸癌的診斷和治療。
2.miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*在宮頸癌組織中表達明顯高于癌周組織；而宮頸癌組織中表達下調的包括miR-302d、miR-346、和miR_518b ;測定這些微小RNA可幫助宮頸癌的診斷。
3.miR-886_5p、miR-610、miR-10a*、miR_30a* 的抑制物(inhibitor)用于宮頸癌的治療；miR-302d、miR-346 和 miR-518b 模擬物(mimics)可以用于治療。
4.上述微小RNA用于診斷時，可用原位雜交、PCR、測序等方法測定組織或/和血中的微小RNA濃度。
5.用于治療時，抑制物和模擬物可用DNA、RNA或者肽結構的衍生物；可以局部和全身用藥。
全文摘要
微小RNA用于宮頸癌的診斷和治療。miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*在宮頸癌組織中表達明顯高于癌周組織，是癌基因；而宮頸癌組織中表達下調的包括miR-302d、miR-346、和miR-518b，是抑癌基因。這些微小RNA可用于宮頸癌的診斷；miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*的抑制物(inhibitor)用于宮頸癌的治療；miR-302d、miR-346和miR-518b模擬物(mimics)或表達激動劑也可以用于宮頸癌的治療。
文檔編號C12N15/113GK102660542SQ201210005318
公開日2012年9月12日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權日2012年1月10日
發(fā)明者張玉祥, 李晶華, 賈弘褆, 郝啟 申請人:首都醫(yī)科大學