專利名稱：檢測點(diǎn)突變基因的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測點(diǎn)突變基因的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)顯示惡性腫瘤、遺傳性疾病等困擾人類的重大疾病與基因突變存在密切聯(lián)系，而在基因突變類型中又以點(diǎn)突變最為常見，相關(guān)的點(diǎn)突變基因檢測技術(shù)得到了較快發(fā)展。目前，基因測序技術(shù)是檢測基因突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于檢測突變基因時(shí)往往存在野生型基因背景的干擾，測序技術(shù)受限于靈敏度，難以檢測出豐度低于10%的突變基因。同樣由于野生型基因的干擾作用，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)也無法對低豐度的突變基因進(jìn)行擴(kuò)增和富集，難以提高突變基因在檢測樣本中的比例。為了提高點(diǎn)突變基因的檢測靈敏度，發(fā)展出了基于連接反應(yīng)的點(diǎn)突變檢測技術(shù)，包括連接酶檢測反應(yīng)(LDR)和連接酶聚合反應(yīng)(LCR)。兩種方法均采用熒光染料作為信號報(bào)告分子，通過檢測報(bào)告分子的熒光信號獲得突變基因的信號，提高了突變基因檢測的靈敏度。但是在連接反應(yīng)中無法分離出突變基因，野生型基因的干擾作用仍無法忽視，限制了檢測靈敏度的提高。而且在熒光信號檢測過程中，每一條突變基因僅標(biāo)記一個(gè)熒光分子，難以獲得足夠高的檢測信號，容易造成假陰性的結(jié)果。此外，由于熒光染料分子往往易于淬滅，也影響了熒光信號檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(ECL)是一種高靈敏檢測技術(shù)，具有檢測結(jié)果重復(fù)性好，易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已被用于進(jìn)行免疫方面的檢測，但在基因檢測方面的應(yīng)用很少，主要原因是用電化學(xué)發(fā)光分子標(biāo)記基因后難以從反應(yīng)中分離出來，未標(biāo)記的基因以及游離的電化學(xué)發(fā)光分子對檢測存在較大干擾，這些因素限制了電化學(xué)發(fā)光技術(shù)在突變檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前基因 點(diǎn)突變檢測靈敏度不高、檢測過程易受樣本中野生型基因干擾的技術(shù)問題，提供一種檢測點(diǎn)突變基因的方法，避免了野生型基因的干擾，提高了點(diǎn)突變基因檢測的靈敏度。此外，還需要提供一種檢測點(diǎn)突變基因的試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種檢測點(diǎn)突變基因的方法，包括以下步驟:設(shè)計(jì)兩條與點(diǎn)突變基因序列互補(bǔ)且相鄰的寡核苷酸探針，即探針I(yè)和探針I(yè)I，其中探針I(yè)的5’端標(biāo)記有識(shí)別分子，其3’端的最后一個(gè)堿基與點(diǎn)突變的堿基互補(bǔ)配對；探針I(yè)I的5’端的第一個(gè)堿基與點(diǎn)突變堿基相鄰的堿基互補(bǔ)配對，其3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子;將所述寡核苷酸探針與待檢測基因混合，該兩條寡核苷酸探針以點(diǎn)突變基因?yàn)槟０澹谶B接酶的作用下通過連接反應(yīng)連接成一條完整的寡核苷酸鏈探針，其5’端標(biāo)記有識(shí)別分子，3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子；
將表面標(biāo)記有捕獲分子的磁性微球與連接反應(yīng)產(chǎn)物混合，通過捕獲分子與識(shí)別分子的特異性結(jié)合，將連接后完整的寡核苷酸鏈探針固定在磁性微球的表面；通過外加磁場分離出磁性微球；將分離出的磁性微球加入電化學(xué)發(fā)光檢測池中，用電化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測連接后完整寡核苷酸鏈探針上的電化學(xué)發(fā)光分子信號，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的差異檢測出點(diǎn)突變基因。所述寡核苷酸探針的長度為15 30bp。所述電化學(xué)發(fā)光分子包括:金屬配合物、魯米諾、吖啶酯、或光澤精。優(yōu)選的，所述金屬配合物為元素Ru、Os、Cr、Cd、Pd、Pt、Re、Ir、Mo、Tb、Eu、Cu、或Al的金屬配合物。優(yōu)選的，所述金屬配合物為三聯(lián)卩比唳釕(Ru(bpy)3)。所述識(shí)別分子包括:生物素、地高辛、與突變基因序列無關(guān)的寡核苷酸。所述捕獲分子包括:鏈霉親和素、抗地高辛抗體、或與寡核苷酸識(shí)別分子互補(bǔ)配對的寡核苷酸序列。所述磁性微球的平均直徑為0.1-1Oum0優(yōu)選的，所述磁性微球?yàn)槌槾判晕⑶颉Ｋ鲭娀瘜W(xué)發(fā)光檢測池由樣品池、三電極工作系統(tǒng)(參比電極、對電極、工作電極)、電子供體三丙胺(Tripropylamine, TPA)組成。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測點(diǎn)突變基因的試劑盒，包含:兩條與點(diǎn)突變基因序列互補(bǔ)且相鄰的寡核苷酸探針，即探針I(yè)和探針I(yè)I，其中探針I(yè)的5’端標(biāo)記有識(shí)別分 子，其3’端的最后一個(gè)堿基與點(diǎn)突變的堿基互補(bǔ)配對；探針I(yè)I的5’端的第一個(gè)堿基與點(diǎn)突變堿基相鄰的堿基互補(bǔ)配對，其3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子；連接酶；表面標(biāo)記有捕獲分子的磁性微球，所述捕獲分子與寡核苷酸探針上的識(shí)別分子特異性結(jié)合。本發(fā)明檢測點(diǎn)突變基因的方法，對點(diǎn)突變基因具有極高的檢測靈敏度，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，在腫瘤分子診斷、遺傳分子診斷等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明基于電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的點(diǎn)突變基因檢測方法示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1對空白對照、野生型基因、突變型基因的連續(xù)5次電化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了提高大量野生型基因背景下低豐度點(diǎn)突變基因的檢測靈敏度，本發(fā)明研發(fā)出了一種檢測點(diǎn)突變基因的方法，該方法將對點(diǎn)突變基因具有高度識(shí)別性的特異性連接反應(yīng)與高靈敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，以點(diǎn)突變基因?yàn)槟０澹ㄟ^連接反應(yīng)將兩條相鄰的寡核苷酸探針連接在一起，形成一條包括識(shí)別分子和電化學(xué)發(fā)光分子的完整寡核苷酸鏈，從而把對點(diǎn)突變基因的檢測轉(zhuǎn)化為對連接后完整寡核苷酸鏈的檢測。然后用磁性微球捕獲、分離完整寡核苷酸鏈，最后采用電化學(xué)發(fā)光方法檢測完整寡核苷酸鏈上的電化學(xué)發(fā)光分子信號，從而檢測出點(diǎn)突變基因。如圖1所示，本發(fā)明基于電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的檢測點(diǎn)突變基因的方法，包括以下步驟:(I)設(shè)計(jì)兩條與點(diǎn)突變基因完全互補(bǔ)的寡核苷酸探針(探針I(yè)和探針I(yè)I )，長度均為10 30bp。其中探針I(yè)的3’端最后一個(gè)堿基與點(diǎn)突變的堿基互補(bǔ)配對，在這條探針的5’端標(biāo)記有識(shí)別分子，用于后續(xù)反應(yīng)中與磁性微球結(jié)合。識(shí)別分子包括生物素、地高辛、或與突變基因序列無關(guān)的寡核苷酸。探針I(yè)I與突變基因互補(bǔ)配對后，與探針I(yè)相鄰，且其5’端處于與發(fā)生點(diǎn)突變的堿基相鄰的位置，其3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子，該電化學(xué)發(fā)光分子包括:元素Ru, Os, Cr, Cd, Pd, Pt, Re, Ir, Mo, Tb, Eu, Cu, Al的金屬配合物、魯米諾、B丫唆酷、或光澤精。(2)將寡核苷酸探針與待檢測基因混合，在連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，以點(diǎn)突變基因?yàn)槟０澹瑑蓷l寡核苷酸探針連接成一條完整的寡核苷酸鏈探針，其3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子，5’端標(biāo)記有識(shí)別分子；而野生型基因則由于錯(cuò)配的存在，無法進(jìn)行連接反應(yīng)。經(jīng)過連接反應(yīng)后，對突變基因的檢測被轉(zhuǎn)化為對連接后完整寡核苷酸鏈探針的檢測。(3)將表面標(biāo)記了捕獲分子的磁性微球與連接反應(yīng)產(chǎn)物混合，磁性微球表面的捕獲分子可以與連接在寡核苷酸探針上的識(shí)別分子發(fā)生特異性結(jié)合，從而將連接后完整的寡核苷酸鏈探針固定在磁性微球的表面。捕獲分子包括:鏈霉親和素、抗地高辛抗體、或與寡核苷酸識(shí)別分子互補(bǔ)配對的寡核苷酸序列。(4)在外加磁場的作用下，連接后的完整寡核苷酸鏈探針結(jié)合在磁性微球的表面，被磁場吸附，從液相中分尚出來。(5)將分離出來的磁性微球加入到電化學(xué)發(fā)光檢測池中，用電化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測連接后完整寡核苷酸鏈探針上標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光分子信號，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的差異檢測出樣品中微量的點(diǎn)突變基因。實(shí)施例1本發(fā)明方法對點(diǎn)突變基因的檢測1.設(shè)計(jì)兩條特異性探針針對P53基因的常見突變位點(diǎn)Y220C，設(shè)計(jì)兩條針對突變堿基的特異性探針，其結(jié)
構(gòu)如下:
權(quán)利要求
1.一種檢測點(diǎn)突變基因的方法，其特征在于，包括以下步驟: 設(shè)計(jì)兩條與點(diǎn)突變基因序列互補(bǔ)且相鄰的寡核苷酸探針，即探針I(yè)和探針I(yè)I，其中探針I(yè)的5’端標(biāo)記有識(shí)別分子，其3’端的最后一個(gè)堿基與點(diǎn)突變的堿基互補(bǔ)配對；探針I(yè)I的5’端的第一個(gè)堿基與點(diǎn)突變堿基相鄰的堿基互補(bǔ)配對，其3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子；將所述寡核苷酸探針與待檢測基因混合，該兩條寡核苷酸探針以點(diǎn)突變基因?yàn)槟０澹谶B接酶的作用下通過連接反應(yīng)連接成一條完整的寡核苷酸鏈探針，其5’端標(biāo)記有識(shí)別分子，3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子； 將表面標(biāo)記有捕獲分子的磁性微球與連接反應(yīng)產(chǎn)物混合，通過捕獲分子與識(shí)別分子的特異性結(jié)合，將連接后完整的寡核苷酸鏈探針固定在磁性微球的表面； 通過外加磁場分離出磁性微球； 將分離出的磁性微球加入電化學(xué)發(fā)光檢測池中，用電化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測連接后完整寡核苷酸鏈探針上的電化學(xué)發(fā)光分子信號，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的差異檢測出點(diǎn)突變基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探針的長度為15 30bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述電化學(xué)發(fā)光分子包括:金屬配合物、魯米諾、吖唳酯、或光澤精。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述 的方法，其特征在于，所述金屬配合物為元素Ru、Os、Cr、Cd、Pd、Pt、Re、Ir、Mo、Tb、Eu、Cu、或 Al 的金屬配合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述識(shí)別分子包括:生物素、地高辛、核酸適配體、或與突變基因序列無關(guān)的寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕獲分子包括:鏈霉親和素、抗地高辛抗體、或與寡核苷酸識(shí)別分子互補(bǔ)配對的寡核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性微球的平均直徑為0.1-10 μ m。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述電化學(xué)發(fā)光檢測池由樣品池、三電極工作系統(tǒng)、電子供體三丙胺組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述三電極為參比電極、對電極、工作電極。
10.一種檢測點(diǎn)突變基因的試劑盒，其特征在于，包含: 兩條與點(diǎn)突變基因序列互補(bǔ)且相鄰的寡核苷酸探針，即探針I(yè)和探針I(yè)I，其中探針I(yè)的5’端標(biāo)記有識(shí)別分子，其3’端的最后一個(gè)堿基與點(diǎn)突變的堿基互補(bǔ)配對；探針I(yè)I的5’端的第一個(gè)堿基與點(diǎn)突變堿基相鄰的堿基互補(bǔ)配對，其3’端標(biāo)記有電化學(xué)發(fā)光分子；連接酶； 表面標(biāo)記有捕獲分子的磁性微球，所述捕獲分子與寡核苷酸探針上的識(shí)別分子特異性彡口口
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測點(diǎn)突變基因的方法，以突變基因?yàn)槟０澹ㄟ^連接反應(yīng)將兩條與點(diǎn)突變基因互補(bǔ)且相鄰的寡核苷酸探針連接成一條完整寡核苷酸鏈，并在寡核苷酸鏈上標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光分子。然后通過磁性微球捕獲并分離出完整寡核苷酸鏈，最后用電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測完整寡核苷酸鏈上標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光分子，通過比較待檢測基因樣品與空白溶液的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的差異檢測出點(diǎn)突變基因。本發(fā)明還公開了檢測點(diǎn)突變基因的試劑盒，包含兩條與點(diǎn)突變基因序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針、連接酶、以及表面標(biāo)記有捕獲分子的磁性微球。本發(fā)明檢測點(diǎn)突變基因的方法，檢測靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，在腫瘤分子診斷、遺傳分子診斷等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK103194534SQ201210005098
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者程昌明, 汪杰, 楊超 申請人:上海生物芯片有限公司