專利名稱：一種以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵高產(chǎn)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明采用的發(fā)酵菌株是2010年9月15日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株，本發(fā)明的特點是以成本價格低廉的馬鈴薯為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)制備高活性的漆酶，用DMP法測酶活其發(fā)酵粗酶液的最高酶活可達(dá)60U/ml以上，且簡便易行，所產(chǎn)漆酶可廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、 食品、廢水處理等領(lǐng)域，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漆酶具有廣泛的底物，不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質(zhì)素、去除許多有毒酚類物質(zhì)的毒性，還可以使多種染料脫色及去除石油工業(yè)廢水的毒性等，因此在紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價值而受到廣泛的關(guān)注。現(xiàn)有漆酶的研究表明，漆酶的制備多數(shù)局限在實驗室制備，所制備的酶活力偏低且制備成本偏高，高活力的漆酶完全依賴進(jìn)口且價格昂貴，這促使我們?nèi)ヌ剿餮芯康统杀局苽涓呋钚云崦傅姆椒ā?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用2010年9月15日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為=CCTCCM 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3產(chǎn)漆酶的密孔菌屬的野生菌株為生產(chǎn)出發(fā)菌株，研究出以價格低廉的馬鈴薯為主要原料發(fā)酵制備出高活性漆酶的方法，并可連續(xù)發(fā)酵，簡便易行且降低了成本，所制備的漆酶可廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等方面，來替代價格昂貴的進(jìn)口漆酶。本發(fā)明的技術(shù)方案用2010年9月15日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3產(chǎn)漆酶的密孔菌屬的野生菌株為生產(chǎn)出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵制備出高活性漆酶的方法；工藝和配方為I)種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基以質(zhì)量體積濃度計5%葡萄糖，1%酵母汁，O. 5%蛋白胨。接種工藝取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無菌水沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液.取Iml孢子懸液接入250ml規(guī)格的三角瓶，裝液量為50ml。培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30°C，恒溫培養(yǎng)2天，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。(2)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基馬鈴薯10-30%，葡萄糖2%，初始pH:自然。馬鈴薯需切成片或塊，加水煮20-30分鐘，過濾取其汁。發(fā)酵罐規(guī)格為7L容量.實際發(fā)酵裝液量為5L。
發(fā)酵參數(shù)接種量6-10%，轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30度.通氣量每升發(fā)酵液
I.0-1. 4L/min,培養(yǎng)時間5天-7天。根據(jù)上述條件，在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液的漆酶活力最高達(dá)60U/ml以上。(3)酶活的測定方法3mL 反應(yīng)體系中包括0. 5ml 10mmol/L 的 2,6_ 二甲氧基酹；2. 4ml pH = 3· O 的
O.lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬素緩沖液；0. Iml粗酶液——發(fā)酵液經(jīng)冷凍高速離心機(jī)IOOOOg離心10分鐘得到上清液并視酶活力稀釋，以去離子水替代粗酶液溶液作為空白對照，在469nm處測吸光值每隔5s讀取一次吸光度值，一般持續(xù)進(jìn)行Imin后停止測定，以反應(yīng)的線性范圍計算酶活。酶活力定義1分鐘催化一微摩爾底物所需酶量，酶活性以U · L—1表示。本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)酶方法與其它制備漆酶的方法相比較，具有如下特點I、發(fā)酵性能穩(wěn)定，菌體易于培養(yǎng).2、產(chǎn)酶周期短，在第6天左右即可停止發(fā)酵.3、生產(chǎn)成本低，產(chǎn)酶活力高，最高可達(dá)60U/ml以上.4、粗酶性質(zhì)穩(wěn)定，以DMP為底物時，在酸性環(huán)境下能發(fā)揮最大催化功效，最適溫度為55度，較耐熱。5、所制備酶作用底物廣泛，有廣闊的應(yīng)用前景.6、可連續(xù)發(fā)酵一即發(fā)酵第一罐產(chǎn)漆酶完成后，發(fā)酵罐中留下10-15%的發(fā)酵液，補(bǔ)加85-90%的發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)漆酶，此時第2罐發(fā)酵參數(shù)同2，但培養(yǎng)時間只需3
天左右。因此本發(fā)明所生產(chǎn)制備出來的漆酶可廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等方面，來替代價格昂貴的進(jìn)口漆酶。因此本發(fā)明有廣泛的工業(yè)使用價值和顯著的經(jīng)濟(jì)效益前景。
具體實施例方式實施例I取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無菌水沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液.每Iml孢子懸液接入250ml規(guī)格的三角瓶中裝50ml種子培養(yǎng)基，準(zhǔn)備若干份。培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30度，恒溫培養(yǎng)2天，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。在7L發(fā)酵罐中裝入5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按10%接種量，加入上述發(fā)酵產(chǎn)酶種子，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30°C .通氣量每升發(fā)酵液I. 4L/min，培養(yǎng)時間120小時，，發(fā)酵液酶活力達(dá)41U/ml。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯30 %，葡萄糖2 %，初始pH :自然。實施例2發(fā)酵產(chǎn)酶種子的培養(yǎng)同例I。在7L發(fā)酵罐中裝入5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按6%接種量，加入上述發(fā)酵產(chǎn)酶種子，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30°C .通氣量每升發(fā)酵液I. OL/min.培養(yǎng)時間168小時，發(fā)酵液酶活力達(dá)52U/ml。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯10%，葡萄糖2%，初始pH:自然。實施例3發(fā)酵產(chǎn)酶種子的培養(yǎng)同例I在7L發(fā)酵罐中裝入5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按8%接種量，加入上述發(fā)酵產(chǎn)酶種子，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30°C .通氣量每升發(fā)酵液I. 2L/min.培養(yǎng)時間144小時，發(fā)酵液酶活力達(dá)61U/ml。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯20 %，葡萄糖2 %，初始pH :自然。
實施例4實施例3的發(fā)酵產(chǎn)漆酶完成后，7升發(fā)酵罐中留下O. 7升發(fā)酵液補(bǔ)加經(jīng)過滅菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基4. 5升,繼續(xù)發(fā)酵,培養(yǎng)條件同實施例3，培養(yǎng)時間78小時,發(fā)酵液酶活力達(dá)61U/ml ο 產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯20 %，葡萄糖2 %，初始pH :自然。
權(quán)利要求
1.一種以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵高產(chǎn)漆酶的方法，采用的發(fā)酵菌株是2010年9月15日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 2010235的Pycnoporussp. SYBC-L3高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株。
2.一種以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵高產(chǎn)漆酶的方法，其特點是以價格低廉的馬鈴薯為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)制備高活性的漆酶，エ藝及配方為 (1)種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基以質(zhì)量體積濃度計5%葡萄糖，I %酵母汁，O. 5%蛋白胨。
接種エ藝取斜面菌種ー環(huán)在PDA平板上點接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無菌水沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液.取Iml孢子懸液分別接入若干個滅過菌的裝有種子培養(yǎng)基50ml的250ml規(guī)格的三角瓶中。
培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30°C，恒溫培養(yǎng)2天，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。
(2)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基馬鈴薯10-30%，葡萄糖2%，初始pH:自然。
馬鈴薯需切成片或塊，加水煮20-30分鐘，過濾取其汁。
發(fā)酵參數(shù)接種量6-10%，轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30度·通氣量每升發(fā)酵液I. 0-1. 4L/min,培養(yǎng)時間5天-7天。
3.一種以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵高產(chǎn)漆酶的方法，可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵并進(jìn)ー步縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本，即 第一罐發(fā)酵產(chǎn)漆酶完成后，發(fā)酵罐中留下10-15%的發(fā)酵液，補(bǔ)加85-90%的發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)漆酶，此時第2罐發(fā)酵參數(shù)同2，但培養(yǎng)時間只需3-4天，且可循環(huán)發(fā)酵下去。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵高產(chǎn)漆酶的方法，采用的發(fā)酵菌株是2010年9月15日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株，該發(fā)明的特點是以成本價格低廉的馬鈴薯為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)制備高活性的漆酶，用DMP法測酶活其發(fā)酵粗酶液的最高酶活可達(dá)60U/ml以上，且可連續(xù)發(fā)酵，所產(chǎn)漆酶可廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等領(lǐng)域，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/02GK102851261SQ20121000789
公開日2013年1月2日 申請日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者張峰, 廖祥儒, 張明 申請人:江南大學(xué)