專利名稱：一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
牛角瓜(Calotropis gigantea)屬于蘿蘑科,直立灌木,可高達3米,全株有乳汁， 幼枝被灰白色絨毛。零星分布于我國廣東、廣西、云南、海南等地。其乳汁可提煉樹膠原料， 還可制鞣料及黃色染料。莖皮纖維堅韌，可制人造棉、造紙、制繩索、織麻布和麻袋等。種毛可作絲絨原料及填充物。牛角瓜為傳統藥用植物，在其分布的熱帶和亞熱帶地區有悠久的藥用歷史。到19 世紀80年代科學家在牛角瓜中發現含有烴類成分，由此牛角瓜作為能源植物逐漸得到重視。在早期對能源植物的篩查過程中發現牛角瓜可以生產生物原油，其主要成分為碳氫化合物。如果在10000株每公頃的種植密度下，其產量可以達到6. 6桶/公頃。這些生物原油經過分析已經證明是和石油主要成分相同的碳氫化合物，而且，這些物質的成分及含量并不隨季節和土壤條件不同而產生明顯變化。但是牛角瓜中烴類成分含量較低，無法滿足工業利用的要求，因此提高牛角瓜中烷烴含量成為迫切需求。分子育種由于具有周期短、目標明確等特點，適用于高烷烴含量牛角瓜品種的培育。目前，生物合成烷烴的代謝途徑的闡明主要來自對蠟質合成的研究結果。蠟質合成的代謝途徑主要包括兩個不同的代謝途徑乙酰還原途徑和脫羰基途徑(Kunst L et al. Progress in Lipid Research, 2003,42, 51-80),其中燒烴就是脫羰基途徑的一個重要的中間代謝產物。經過研究已經發現一些烷烴合成的關鍵酶，這些酶負責脂肪酸到烷烴的轉化，具體的代謝途徑為脂肪酸在酰基CoA還原酶的作用下生成脂肪醛，再進一步由脂肪醛脫羰基酶催化形成烷烴。Aarts 等(Aarts et al. The Plant Cell 1995，7，2115-2127)克隆了擬南芥的CERl基因，CERl主要在莖、花和果實中表達，在葉中表達水平較低。CERl蛋白與膜內在蛋白有相似性，是高度疏水性分子。因為CERl突變體中醛大量積累，而烴的含量卻降低，所以推測CERl蛋白為脫羧酶，催化長鏈醛到烴的轉化。Chen等(Chen X et al. The Plant Cell，2003，15，1170-1185)從擬南芥中克隆并鑒定了第一個能同時影響上表皮蠟質層和角質膜層組成和結構的基因WAX2，WAX2突變體與野生型相比具有以下變異角質層較野生型輕20%但厚36% ;蠟質組分總量降低78%以上；葉面水分蒸發顯著增強；對除草劑的耐受力降低。通過對WAX2基因突變體的研究發現WAX2基因的突變封閉了醛類物質及其代謝物的合成，因此WAX2可能通過影響長鏈乙酰CoA的還原發揮作用，另外，WAX2突變體的表皮膜的瓦解現象說明WAX2可能在角質合成過程也是必須的基因。Kurata等(Kurata T et al. The Plant Journal，2003，36，55-66)隨后也報道了 WAX2基因(另命名為 Y0RE-Y0RE)的克隆與基因表達部位的研究，WAX2 (Y0RE-Y0RE)只在莖表皮分生組織和嫩葉、莖、果實和根的形成初期的細胞中有特定表達，在生長的表面毛上有高表達，WAX2 (Y0RE-Y0RE)可能控制從酰基CoA向醒類和角質層組分的轉化。Sturaro等(Sturaro M et al. Plant physiology,2005，138,478-489)在玉米中克隆了 WAX2的同源基因命名為GL0SSY1，該基因與玉米表皮的發育及蠟質的積累有關。另外，Pierre 等(Broun P et al. PNAS，2004，101，4706-4711) 在擬南芥中克隆了 WINl基因，研究發現該基因為一個乙烯誘導的轉錄因子，一些蠟質合成過程中的關鍵基因例如CERl，KCSl和CER2等均受到該基因的控制，利用轉基因技術使該基因在擬南芥中過量表達發現植物葉表皮蠟質的含量達到對照組的4. 5倍，并且烷烴占到其中的85 %高于對照組的65 %。本發明利用發根農桿菌的介導將烷烴合成過程中涉及的一些關鍵基因轉入牛角瓜中，獲得牛角瓜轉基因毛狀根，經過在芽誘導培養基和生根培養基中的培養，最終獲得了轉基因牛角瓜，檢測結果表明，本發明中獲得的轉基因牛角瓜的烷烴含量得到了明顯提高。 目前尚未見到有關利用轉基因技術提高牛角瓜烷烴含量的報道。發明目的及內容為了解決野生牛角瓜植株中烷烴含量較低的問題，本發明提供了一種通過轉基因技術提高牛角瓜中烷烴含量的方法。該方法通過發根農桿菌的介導將烷烴合成過程中涉及的一些關鍵基因轉入牛角瓜中，獲得牛角瓜轉基因毛狀根，經過在芽誘導培養基和生根培養基中的培養，最終獲得了轉基因牛角瓜。本發明主要包括以下步驟I.提取擬南芥總RNA并反轉錄產生cDNA，以cDNA為模板，利用表I中的三對引物分別擴增WAX2、CERl和WINl基因，并將PCR產物插入T載體，然后進行DNA序列分析；2.將測序正確的WAX2、CER1和WINl基因用BamH I和Sac I從T載體上切下，分別插入植物表達載體PCAMBIA-1301，構建含外源基因的植物表達載體(圖I)。為了使外源基因能夠順利表達在該載體的多克隆位點的Xba I和Sal I之間插入了 35S CAMV啟動子， Sac I和EcoR I間插入了 NOS終止子。3.采用凍融法將構建的含外源基因的植物表達載體導入發根農桿菌ATCC15834 中，涂布含卡那霉素50mg/L的YEB平板后，在28°C恒溫培養箱，培養2天后，挑取單菌落， 用PCR方法進行檢測，檢測為陽性的克隆用于感染牛角瓜無菌苗的葉片；感染后的外植體在黑暗條件下共培養2天，然后轉至含有300mg/L頭孢霉素的MS培養基，25± 1°C，16h/8h 光/暗培養，每隔2周轉接一次，共轉接3-5次，感染后約3-4周后產生毛狀根，待毛狀根長至2-3cm，用PCR方法分別對烷烴合成基因進行檢測。4.將檢測為陽性的發根切下轉至芽誘導培養基上進行篩選，待獲得的芽長至
l-2cm高時，轉入MS培養基，經過2-3周培養，轉化植株生根并長成完整再生植株；5.提取轉基因牛角瓜的基因組DNA，利用表I中的引物，以獲得的基因組DNA為模板進行PCR擴增，檢測轉基因植株中是否有外源基因的轉入；6.提取轉基因牛角瓜植株的總RNA并反轉錄產生cDNA，利用表I中的引物，以 cDNA為模板進行PCR擴增，檢測外源基因是否在轉基因植株中表達；7.對獲得的轉基因牛角瓜進行烷烴含量的分析，篩選烷烴含量高的轉基因牛角瓜植株。表I烷烴合成過程關鍵基因的克隆引物
權利要求
1.一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，其特征在于包括以下步驟(1)烷烴合成過程關鍵基因的克隆；提取擬南芥總RNA并反轉錄產生CDNA，以CDNA為模板，根據烷烴合成過程關鍵基因的序列設計引物，對其進行PCR擴增，將獲得的目的片段插入T載體，然后進行DNA序列分析；(2)植物表達載體的構建；將測序正確的基因用BamH I和Sac I從T載體上切下，插入植物表達載體，構建成含外源基因的植物表達載體；(3)通過發根農桿菌的介導進行植物轉化；采用凍融法將含外源基因的植物表達載體導入發根農桿菌，涂布在含卡那霉素50mg/L 的YEB平板上，在28°C恒溫培養箱中培養2天后，挑取單菌落，用PCR方法進行檢測，檢測為陽性的克隆用于感染牛角瓜無菌苗的葉片；感染后的牛角瓜葉片在黑暗條件下共培養2 天，然后轉至含有300mg/L頭孢霉素的MS培養基，25 ± I °C，16h/8h光/暗培養，每隔2周轉接一次，共轉接3-5次，感染后約3-4周產生毛狀根，待毛狀根長至2-3cm，用PCR方法進行檢測；(4)轉基因植株再生；將檢測為陽性的毛狀根切下后轉至芽誘導培養基上進行生芽培養，待獲得的芽長至 l-2cm高時，將獲得的再生芽轉入生根培養基，經過2-3周培養，再生芽生根長成完整再生植株；(5)轉基因植株的檢測和篩選；對轉基因植株采取三步法篩選，第一步，采用PCR方法擴增轉基因植株的目的基因，檢測外源基因是否轉入；第二步，對PCR檢測為陽性的轉基因株系進行RT-PCR分析，判斷外源基因是否在轉基因植株中表達；第三步，對獲得的陽性轉基因植株進行烷烴含量的分析，篩選高產烷烴的轉基因牛角瓜。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟I)所述的烷烴合成過程關鍵基因為 WAX2、CERl 和 WINl 中的一種。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的烷烴合成過程關鍵基因的克隆引物是根據Genbank中擬南芥WAX2、CER1和WINl的mRNA序列進行設計,其序列如表I所示。表I烷烴合成過程關鍵基因的克隆引物基因引物CERlcerR cerF 5 ’-CGGGATCCATGGCCACAAAACCAGGAGTCCT-3 ’ 5 ’-GCGAGCTCTCACAGGAGTGGACATCCACCAGA-3 ’WAX2waxR 5 ^cgggatccatggttgcttttttatcag-s ’ WaxF 5 ’-GCGAGCTCTCAATTTGTGAGTGAAGAAACA-3 ’WINlwinR: winF:5 ^cgggatccatggtacagacgaagaagttc-s ’ 5 ’-GCGAGCTCTTAGTTTGTATTGAGAAGC-3 ’
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟2)所述的植物表達載體為pCAMBIA-1301，該載體多克隆位點的Xba I和Sal I之間插入了 35S CAMV啟動子，Sac I和 EcoR I間插入了 NOS終止子。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)所述的發根農桿菌為ATCC15834。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)所述的檢測轉基因發根所用的 PCR引物如表I所示。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征是步驟4)所述的芽誘導培養基是MS+0.Img/ L NAA+0. lmg/L 6-BA 或 MS+0. 5mg/L NAA+4. Omg/L 6-BA，生根培養基為 MS。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟5)所述的轉基因植株PCR和RT-PCR 所用的引物如表I所示。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟5)所述的牛角瓜轉基因植株中烷烴的提取及檢測方法如下牛角瓜轉基因植株在50°C下干燥至恒重，粉碎后過40目篩，按液固比20 I向粉碎的樣品中加入正己燒，劇烈混合IOmin后，5000rpm離心IOmin進行液固分離,取上層液相到一新容器中；按上述方法重復提取兩次，合并三次正己烷相，50°C減壓蒸餾回收正己烷，膏狀物即為烷烴物質粗提物；得到的烷烴提取物用正己烷溶解后用氣相色譜進行檢測；檢測條件如下進樣口 250°C，分流比40 I檢測器350°C柱溫升溫速率。C /分溫度。C保持時間(分)-50O. 5103505.0根據樣品中各烷烴色譜峰的保留時間與C8-C4tl alkane window標準品中各烷烴的保留時間進行比較，確定牛角瓜轉基因植株中烷烴種類；分別利用烷烴標準品建立牛角瓜轉基因植株中含有的各種烷烴的標準曲線，并計算牛角瓜轉基因植株中各種烷烴的含量；牛角瓜轉基因植株中含有的各種烷烴的含量總和即為牛角瓜轉基因植株的烷烴含量。
全文摘要
本發明提供一種利用轉基因技術獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，屬于生物技術領域。該方法通過將植物烷烴合成過程中涉及的一些關鍵基因構建到植物表達載體pCAMBIA1301中，得到的嵌合體DNA通過發根農桿菌的介導轉化牛角瓜無菌苗的葉片，得到的毛狀根經誘導分化后得到轉基因牛角瓜植株。通過對獲得的轉基因植株進行PCR及RT-PCR分析，結合氣相色譜對烷烴含量的檢測，篩選出高烷烴含量的牛角瓜轉基因植株，規模化繁育后進行人工種植。本發明獲得的轉基因牛角瓜植株烷烴含量較野生植株提高30％以上，且具有耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄等特性，在生物能源等領域具有巨大應用潛力。
文檔編號C12Q1/68GK102586271SQ20121000726
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者孫健, 王曉東, 趙兵 申請人:中國科學院過程工程研究所