專利名稱：一種將液態漆酶制備成高濃度高純度固態漆酶的方法
技術領域：
本發明提供了一種將微生物發酵生產的液態漆酶制備成高濃度高純度固態漆酶的方法，該發明的特點是以2010年9月15日保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3高產漆酶的密孔菌屬菌株為生產出發菌株，將各種不同成分的培養基和各種不同方法發酵生產的液態漆酶粗酶液制備成高濃度高純度的固態漆酶，所制備的產品既便于運輸、保藏，又便于出口創匯競爭國際市場，還可廣泛應用于紡織印染、造紙、草坪修復、能源再生、飼料、食品、廢水處理等領域，該發明的方法和原則也將為生物技術類產品的純化、濃縮、制備所借鑒使用，屬于生物技術領域。
背景技術：
漆酶具有廣泛的底物，不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質素、去除許多有毒酚類物質的毒性，還可以使多種染料脫色及去除石油工業廢水的毒性等，因此在紡織印染、造紙、草坪修復、能源再生、飼料、食品、廢水處理等領域具有較大的應用價值而受到廣泛的關注。現有漆酶的研究表明，漆酶的制備多數局限在實驗室制備，所制備的漆酶活力偏低且制備成本偏高，我國市場上雖有固態漆酶，但酶活力很低且純度也很低，高活力高純度的固態漆酶完全依賴進口且價格昂貴，每克10萬單位的進口固態漆酶，售價竟高達1600 元-4000元人民幣，甚至這樣的高價有時進口貨還缺貨，從而極大地影響了漆酶在各領域中具有較大的應用價值的推廣實施，其原因可能是國外在進行液態漆酶純化和濃縮時，采用了傳統實驗室的方法，即將液態漆酶采用硫酸銨分級沉淀——DEAE-纖維素離子交換柱層析——冷凍干燥等方法，從而使液態漆酶的純化和濃縮成本費用較高且效率較低，難以大批量制備，這促使我們去探索研究尋求怎樣將液態漆酶既要能低成本的純化和濃縮，又要能高效率且大批量的制備成高活性高純度的固態漆酶的方法，“一種將液態漆酶制備成高濃度高純度固態漆酶的方法”就是在這樣的探索研究中發明的。

發明內容
1、本發明發現和提供了一種既可將液態漆酶低成本的純化和濃縮，又可將液態漆酶高效率且大批量制備成高活性高純度固態漆酶的方法，率先將工廠常見的超濾設備和噴霧干燥設備應用于高活性高純度固態漆酶的制備。2、本發明發現和提供了在使用超濾設備進行漆酶粗酶液純化和濃縮時需根據液態漆酶的分子量大小和對純度的要求來選擇超濾膜的規格、分子量的原則、思路和方法。3、本發明發現和提供了在使用噴霧干燥機設備具體選用進風溫度和出風溫度時， 需根據液態酶液所含物質的濃度和酶對溫度的耐熱性來決定，一般來說酶耐熱性好，進風溫度可高些；進風溫度與出風溫度溫差越大、液態酶液所含物質的濃度越大，則干燥成固態酶的速度越快的特點和方法。4、本發明發現和提供了使用噴霧干燥設備——進風溫度150°C至200°C、出風溫度70°C至90°C將液態漆酶噴霧干燥制備成固態漆酶的使用條件。5、本發明發現和提供了使用超濾設備——分子量為1萬-10萬規格的超濾膜可將液態漆酶純化濃縮5-20倍的條件和規律。6、本發明發現和提供了將發酵液——漆酶粗酶液直接用噴霧干燥設備按進風溫度150°C至200°C、出風溫度70°C至90°C的條件可噴霧干燥成固態漆酶，固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的50倍以上，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶體積和重量的100倍以上的規律。7、本發明發現和提供了將發酵液——漆酶粗酶液先用超濾設備一選用分子量為1萬-10萬規格的超濾膜將液態漆酶粗酶液超濾純化濃縮5-20倍，再用噴霧干燥設備按進風溫度150°C至200°C、出風溫度70°C至90°C的條件噴霧干燥制備成高濃度高純度固態漆酶，固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的250倍以上，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的800倍以上的規律。本發明的技術方案本發明是以2010年9月15日保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為 CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. STOC-L3高產漆酶的密孔菌屬菌株為生產出發菌株，將各種不同成分的培養基和各種方法生產的液態漆酶粗酶液為起始酶液分成3個步驟并運用超濾設備和噴霧干燥設備來實現制備成高濃度高純度固態漆酶的，并運用相同的DMP酶活力測定方法測定固態漆酶和液態漆酶的活力并進行比較，同時對固態漆酶和液態漆酶的重量和體積液進行比較，具體如下1、起始液態漆酶液的來源包括(1)以豆粕或硝酸鈉為氮源，以麥芽糖或葡萄糖或果糖或纖維二糖或蔗糖等為碳源發酵生產制備的液態漆酶。(2)以馬鈴薯為主要原料發酵制備的液態漆酶。(3)以水稻秸稈為原料固態發酵制備的液態漆酶。2、純化濃縮干燥的3個步驟包括(1)先將發酵生產制備出的漆酶粗酶液，用抽濾或壓濾或離心的方法，除去菌體、 較大的懸浮物和顆粒。(2)再將上述除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液，用超濾設備，先選用1萬分子量的超濾膜，超濾除去分子量在1萬以下的小分子物質，然后用10萬分子量的超濾膜， 收集分子量在1-10萬的液體，得到純化且濃縮了 5-20倍的酶液，因為我們制備的漆酶的分子量約為5. 8萬左右。(3)最后將經超濾濃縮純化后的漆酶液，用噴霧干燥機設備，選用進風口溫度 150-200°C、出風溫度70-90°C的條件，進行噴霧干燥，得到高濃度高純度的固態漆酶。將高濃度高純度固態漆酶和液態漆酶粗酶液的活力進行比較，將高濃度高純度固態漆酶和液態漆酶酶粗酶液的體積或重量進行比較。(4)直接將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液用噴霧干燥設備按進風溫度 150°C至200°C、出風溫度70°C至90°C的條件噴霧干燥成固態漆酶，將固態漆酶和液態漆酶粗酶液的活力進行比較，將固態漆酶和液態漆酶酶粗酶液的體積或重量進行比較。3、酶活的測定方法
3mL 反應體系中包括0. 5ml 10mmol/L 的 2，6_ 二甲氧基酚；2. 4ml pH = 3. 0 的 0. lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬素緩沖液；0. Iml粗酶液——發酵液經冷凍高速離心機IOOOOg 離心10分鐘得到上清液并視酶活力稀釋，以去離子水替代粗酶液溶液作為空白對照，在 469nm處測吸光值每隔k讀取一次吸光度值，一般持續進行Imin后停止測定，以反應的線性范圍計算酶活。酶活力定義1分鐘催化一微摩爾底物所需酶量，酶活性以U · L—1表示。本發明的有益效果本發明打破了將液態漆酶用實驗室傳統方法純化和濃縮制備成高活性高純度固態漆酶的做法，使得既可將液態漆酶低成本的純化和濃縮，又可將液態漆酶高效率且大批量的制備成高活性高純度固態漆酶的想法變為現實，且方便易行。由于大大降低了純化和濃縮的成本，所制備的產品既便于運輸、保藏，又便于出口創匯競爭國際市場，從而將極大的促進漆酶在各個領域中的運用。同時，這一發明的方法和思路，也將為生物技術類產品的純化和濃縮方法的研究和生產提供借鑒和幫助。由于漆酶可廣泛應用于紡織印染、造紙、草坪修復、能源再生、飼料、食品、廢水處理等方面，因此本發明將有力的促進漆酶的工業化生產和應用，結合我們的等待審批的專利——高產漆酶的菌株和產漆酶的方法將實施于企業生產，必將生產制備出價廉質優的漆酶產品來替代價格昂貴的進口漆酶并出口競爭國際市場。因此本發明具有廣泛的工業使用價值和顯著的經濟效益和社會效應前景。
具體實施例方式實施例1取以豆粕或硝酸鈉為氮源，以麥芽糖或葡萄糖或果糖或纖維二糖等為碳源發酵生產制備的液態漆酶粗酶液體積為40升，重量約40000克，粗酶液的活力為120U/ml。1、用先將發酵生產制備出的粗酶液，用大容量離心機離心或用定性濾紙抽濾或8 層紗布抽濾等方法，除去菌體、較大的懸浮物和顆粒。2、將上述除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液，用超濾設備，先選用1萬分子量的超濾膜，超濾除去分子量在1萬以下的小分子物質，然后用10萬分子量的超濾膜，超濾收集分子量在1-10萬的液體，得到純化且濃縮了 10倍的液態漆酶。3、將經超濾濃縮純化后的漆酶液，用噴霧干燥機設備，選用進風口溫度200°C，出風溫度70°C的條件，進行噴霧干燥，得到高純度高活力固態漆酶25. 4克，用DMP法測固態漆酶活力為8. 5萬U/g(相當于ABTS法測漆酶活力的二倍即17萬U/g)。固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的708倍，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的1575倍。4、如果將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液直接用噴霧干燥機設備——選用進風口溫度200°C，出風溫度90°C的條件進行噴霧干燥，得到固態漆酶250克，用DMP法測固態漆酶活力為13640U/g(相當于ABTS法測漆酶活力的二倍即27^0U/g)。固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的114倍，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的160倍。實施例2取以馬鈴薯為主要原料發酵高產制備的液態漆酶粗酶液體積為40升，重量40000克，粗酶液的活力為80U/ml。1、與實施例1中的(1)相同。2、與實施例1中的⑵相同，得到超濾后純化和濃縮了 5倍的酶液。3、用噴霧干燥機設備-選用進風口溫度150°C，出風溫度70°C的條件，進行噴霧干燥，得到高純度高活力固態漆酶27. 29克，用DMP法測固態漆酶活力為5. 1萬U/g(相當于 ABTS法測漆酶活力的二倍即10. 4萬U/g)。固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的638倍，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的1466倍。4、將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液直接用噴霧干燥機設備——選用進風口溫度150°C，出風溫度70°C的條件進行噴霧干燥，得到固態漆酶249克，用DMP法測固態漆酶活力為9120U/g(相當于ABTS法測漆酶活力的二倍即1.8 萬U/g)。固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的114倍，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的161倍。實施例3取以水稻秸稈為原料固態發酵制備的液態漆酶酶粗酶液體積為30升，重量30000 克，液態粗酶液的活力為9. 2U/ml。1、與實施例1中的(1)相同。2、與實施例1中的⑵相同，得到超濾后純化和濃縮了 20倍的酶液。3、用噴霧干燥機設備-選用進風口溫度180°C，出風溫度80°C的條件，進行噴霧干燥，得到高純度高活力固態漆酶13. 25克，用DMP法測固態漆酶活力為8280U/g(相當于 ABTS法測漆酶活力的二倍即1. 656萬U/g)。固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的900倍，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的2264倍。4、將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液直接用噴霧干燥機設備——選用進風口溫度180°C，出風溫度80°C的條件進行噴霧干燥，得到固態漆酶151克，用DMP法測固態漆酶活力為1145U/g(相當于ABTS法測漆酶活力的二倍即2290U/g)。固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的125倍，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的199倍。
權利要求
1.一種將液態漆酶制備成高濃度高純度固態漆酶的方法，其特點是以2010年9月 15日保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3高產漆酶的密孔菌屬菌株為生產出發菌株，將各種不同成分的培養基和各種方法生產的液態漆酶粗酶液制備成高濃度固態漆酶，其中包括(1)以豆粕或硝酸鈉為氮源，以麥芽糖或葡萄糖或果糖或纖維二糖等為碳源發酵生產制備的液態漆酶。(2)以馬鈴薯為主要原料發酵高產制備的液態漆酶。(3)以水稻秸稈為原料固態發酵制備的液態漆酶。
2.一種將液態漆酶制備成高濃度高純度固態漆酶的方法，使用的主要設備是超濾機——選用分子量為1萬-10萬規格的超濾膜和噴霧干燥機——進風溫度150°C至200°C、 出風溫度70°C至90°C，將液態漆酶制備成高濃度高純度固態漆酶，其工藝、條件和作用為(1)先將發酵生產制備出的漆酶發酵液，用抽濾或壓濾或離心的方法，除去菌體、較大的懸浮物和顆粒，得到漆酶粗酶液，由于菌體是藥用真菌，蛋白質含量高且產漆酶，故收集的菌體起碼可作飼料或生物肥料。(2)將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液，直接用噴霧干燥設備按進風溫度 150°C至200°C、出風溫度70°C至90°C的條件噴霧干燥成固態漆酶，固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的50倍以上，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶體積和重量的100倍以上。(3)用超濾設備——選用分子量為1萬-10萬規格的超濾膜將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液超濾純化并濃縮5-20倍，具體為先選用1萬分子量的超濾膜，超濾除去分子量在1萬以下的小分子物質，然后用10萬分子量的超濾膜，超濾收集分子量在1-10萬的液體，因為我們制備的漆酶的分子量約為5. 8萬，得到純化并濃縮了 5-20酶液。(4)用噴霧干燥機設備，選用進風溫度150°C-200°C、出風溫度70°C _90°C的條件將經超濾純化濃縮了 5-20倍的漆酶液噴霧干燥制備成高濃度高純度固態漆酶，固態漆酶的每克酶活是發酵粗酶液每毫升酶活的250倍以上，液態發酵粗酶液體積和重量是固態漆酶的體積和重量的800倍以上。
3.在選擇超濾設備和噴霧干燥機設備的使用條件時，要按下列原則(1)超濾設備具體選用何種規格和分子量的超濾膜對粗酶液進行濃縮和純化，需根據發酵制備的漆酶的分子量大小和對純度的要求來決定，因為漆酶的分子量從幾萬到幾十萬不等。(2)噴霧干燥機設備具體選用進風溫度和出風溫度時，需根據液態酶液所含物質的濃度和酶對溫度的耐熱性來決定，一般來說酶耐熱性好，進風溫度可高些；進風溫度與出風溫度溫差越大、液態酶液所含物質的濃度越大，則干燥成固態酶的速度越快。
全文摘要
一種將液態漆酶制備成高濃度高純度固態漆酶的方法，提供了一種將微生物發酵生產的液態漆酶粗酶液制備成高濃度高純度固態漆酶的方法，該發明的特點是以2010年9月15日保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3高產漆酶的密孔菌屬菌株為生產出發菌株，將各種不同成分培養基發酵生產的粗酶液用超濾設備——分子量為1萬-10萬規格的超濾膜純化濃縮和用噴霧干燥設備——進風溫度150℃至200℃、出風溫度70℃至90℃將液態酶噴霧干燥制備成高濃度高純度的固態漆酶，用DMP法測酶活并比較固態漆酶與液態粗酶液的酶活和體積，該發明將為生物技術類產品的純化濃縮制備所借鑒使用，屬于生物技術領域。
文檔編號C12R1/645GK102559621SQ20121000791
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者廖祥儒, 張峰, 張明 申請人:江南大學