專利名稱：一種賴氨酸的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種賴氨酸的生產方法。
背景技術：
賴氨酸多是通過微生物發酵來制備的，采用每罐按照一定的比例投入發酵培養基并接入一定的賴氨酸發酵菌種，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養。隨著發酵的進行，且隨著碳源和氮源的流加以及發酵過程中的放料，賴氨酸發酵菌種的濃度逐漸被稀釋且賴氨酸發酵菌種的量逐漸減少，發酵產酸速率呈下降趨勢，最終因發酵產酸速率緩慢而放罐，致使限制了賴氨酸的產能，成本較高，經濟效益較低。

發明內容
本發明的目的是為了提高賴氨酸的產能，降低生產成本，提高經濟效益，提供一種新的賴氨酸的生產方法。本發明的發明人在研究中意外發現，在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內， 向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種，可極大提高賴氨酸的產能，降低生產成本，提高經濟效益。因此，為了實現上述目的，本發明提供了一種賴氨酸的生產方法，所述方法包括將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其特征在于，在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種。優選地，在發酵培養35小時后至發酵培養45小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種。以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，以補加的賴氨酸發酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發酵菌種的加入量優選為0. 5-5g/L，進一步優選為2-4g/L。優選地，補加的賴氨酸發酵菌種為發酵培養15小時后至發酵培養40小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種，進一步優選地，補加的賴氨酸發酵菌種為發酵培養15 小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種。本發明提供的賴氨酸發酵方法，可延長發酵時間，提高終點賴氨酸含量、單罐供酸量和轉化率，從而降低生產成本，提高經濟效益，采用本發明優選的實施方式，即補加發酵培養15小時后至發酵培養40小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種，可充分利用放料的發酵液中的賴氨酸發酵菌種，進一步降低生產成本，進一步提高經濟效益。本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
具體實施例方式以下對本發明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。本發明提供了一種賴氨酸的生產方法，該方法包括將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其特征在于，在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種。
本發明中，發酵培養基為本領域技術人員公知的概念，指微生物發酵所需的供微生物生長和維持用的人工配制的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。發酵液也為本領域技術人員公知的概念，指接入微生物菌株的液體培養基(該液體培養基也即本發明中所稱發酵培養基)，經過一段時間的培養后所得產物。
根據本發明，盡管在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種，即可實現本發明的目的，即提高賴氨酸的產能，降低生產成本，提高經濟效益，但優選情況下，在發酵培養35小時后至發酵培養45小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種，可進一步提高賴氨酸的產能，降低生產成本，提高經濟效益。
本發明中，只要在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內，優選在發酵培養35 小時后至發酵培養45小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種，即可提高賴氨酸的產能， 降低生產成本，提高經濟效益。為了更進一步提高賴氨酸的產能，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，以補加的賴氨酸發酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發酵菌種的加入量優選為0. 5-5g/L，進一步優選為2-4g/L。
本發明中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，賴氨酸發酵菌種的接種量為12-18體積％。本領域技術人員應該理解的是，賴氨酸發酵菌種在被接種至發酵培養基中之前，采用常規方法將賴氨酸發酵菌種經過種子罐培養，在種子罐培養的培養程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、( (optical density)值測定對產賴氨酸微生物的生長進行觀察，當通過上述方法觀察菌體形態正常、測定OD值達到0. 75以上時停止培養， 將此時種子罐中的種子液稱為成熟種子液。然后再將成熟種子液接入發酵培養基中。因此，本發明中，賴氨酸發酵菌種的接種量為12-18體積％，指的是接入發酵培養基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發酵培養基體積的12-18%。
種子罐培養可以采用一級種子罐培養也可以采用二級種子罐培養，一級種子罐培養即將賴氨酸發酵菌種在一個種子罐中一直培養到所需的培養程度；二級種子罐培養即先將賴氨酸發酵菌種在一個種子罐中培養一段時間后再轉入另一個種子罐繼續培養，培養到所需的培養程度。二級種子罐培養在各個種子罐的培養時間沒有具體限定，只要最終能培養到所需的培養程度即可。為了操作方便，本發明的種子罐培養優選采用一級種子罐培養。
本發明中，對于種子罐培養基的成分無特殊要求，可以采用本領域常用的種子罐培養基，例如，可以用淀粉質原料糖化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸和蛋氨酸等配制種子罐培養基。根據本發明，每升種子罐培養基中各原料的用量可以在很大范圍內改變，優選情況下，每升種子罐培養基中，淀粉質原料糖化清液的用量可以為30-40 克，玉米漿(干重為20-50重量％ )的用量可以為70-90克，磷酸氫二鉀的用量可以為 0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-1. 1克，硫酸銨的用量可以為5-15克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 6克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克。
本發明中，流加碳源的量使發酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使發酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升。此處“流加碳源的量使發酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使發酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/ 升”是指通過控制流加碳源和流加氮源的速度來使在整個發酵培養過程中發酵液中還原性糖的濃度維持在5-10克/升，使發酵液中氮的濃度維持在0. 35-0. 8克/升。
本發明的發明人在實驗中發現，對于碳源和氮源的流加，連續流加比間歇流加的發酵效果好，因此，本發明中的流加優選為連續流加。
本發明中，發酵培養在發酵罐中進行，為了有效利用發酵罐的產能，接種后且流加碳源和流加氮源之前發酵罐中的培養基的體積優選為發酵罐體積的40-60%，隨著流加碳源和流加氮源，發酵罐中的培養基的體積逐漸增大，為了保證發酵罐中的空氣量，優選為流加碳源和流加氮源至發酵罐體積的70-80%時放料，為了不影響放料后發酵罐中的發酵培養，放料體積優選為放料前發酵罐中培養基體積的5-10%。
本領域技術人員應該理解的是，補加的賴氨酸發酵菌種應該具有產酸代謝活力。 本發明中，對于補加的賴氨酸發酵菌種無特殊要求，例如可以是經種子罐培養的成熟種子液，也可以是經過發酵培養的仍具產酸代謝活力的賴氨酸發酵菌種。本發明的發明人在研究中發現，發酵培養15小時后至發酵培養40小時內的賴氨酸發酵菌種仍具有較強的產酸代謝活力，因此，為了進一步降低成本，優選情況下，補加的賴氨酸發酵菌種為發酵培養15 小時后至發酵培養40小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種，為了進一步提高賴氨酸產能，更優選情況下，補加的賴氨酸發酵菌種為發酵培養15小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種。
本發明中，對于從放料的發酵液中提取賴氨酸發酵菌種的方法無特殊要求，可以采用本領域常用的各種方法，例如可以采用金屬膜過濾的方法，將發酵培養15小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液混合均勻(其中賴氨酸含量通常為12g/100mL左右)后采用膜孔徑0. 2 μ m、膜面積0. 25m2的金屬膜，在操作條件為進口壓力0. 35MPa、出口壓力0. 2MPa 下過濾，濾出液濁度控制在30NTU以下，得到賴氨酸膜濾液和膜濃縮液，然后濾液進入賴氨酸提取工序，制成賴氨酸鹽酸鹽成品。膜濃縮液中固形物大部分為菌體(菌體干重含量通常為10g/100mL左右)，將該膜濃縮液直接加入發酵培養30小時后至發酵培養48小時內的發酵罐中即可，即該膜濃縮液作為從放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種。
對于過濾采用的金屬膜，可清洗后再利用，清洗程序為向膜貯罐內加滿40-50°C 水，對膜管進行循環沖洗，重復2-3遍。采用65°C、濃度5-8% (w/v)的NaOH溶液循環清洗膜40分鐘。加水將膜系統沖洗至近中性，并且膜通量達到初始通量的95%，即可備用下一批次發酵液的金屬膜過濾。
現有技術中，將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，隨著發酵的進行，且隨著碳源和氮源的流加以及發酵過程中的放料，賴氨酸發酵菌種的濃度逐漸被稀釋且賴氨酸發酵菌種的量逐漸減少，發酵產酸速率呈下降趨勢，當發酵產酸速率降低到一定程度即判斷為發酵終點，達到發酵終點即放罐，放罐是指將發酵罐中的培養基全部從發酵罐中放出，即停止發酵。現有技術中一般發酵培養 40-50小時后放罐。本發明由于在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內，優選在發酵培養35小時后至發酵培養45小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種，因此，延長了發酵培養的時間，本發明優選發酵培養52-64小時后放罐。
本領域技術人員應該理解的是，為了得到純度較高的賴氨酸產品，本發明方法還包括從放料或放罐的溶液中提取賴氨酸。對于提取賴氨酸的方法無特殊要求，可以采用本領域常用的各種方法，例如，采用連續離子交換分離提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的濃硫酸調PH至2. 0-3. 0進行酸化，酸化后經過金屬膜或陶瓷膜過濾除去菌體，得到賴氨酸膜濾液即賴氨酸清液，或將酸化后的賴氨酸發酵液經絮凝過濾除菌體后得到賴氨酸清液，除菌體后的賴氨酸清液采用強酸型陽離子交換樹脂進行吸附交換，樹脂吸附飽和后用稀氨水進行洗脫，洗脫下來的賴氨酸經濃縮、鹽酸調節PH值、結晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使賴氨酸發酵液酸化，經過濾或離心等方法除去菌體。在除去菌體后的賴氨酸清液中加入氫氧化鈣調節PH值至8. 0-11. 5，使賴氨酸清液中的鹽、膠體等雜質生成不溶物，經固液分離后得到賴氨酸溶液，將賴氨酸溶液濃縮至每毫升賴氨酸溶液中賴氨酸的含量為0. 6-0. 8g，再經過過濾可以得到高純度的賴氨酸溶液，然后經濃縮、鹽酸調節PH值、結晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品。本發明中，對發酵培養的條件無特殊要求，可以采用本領域常用的條件，例如，溫度為35_38°C，壓力為0. 05-0. lMPa，pH值為6. 7-7. 0，通氣量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養基/分鐘，通氣量優選為0. 7-0. 9立方米空氣/立方米的培養基/分鐘。本發明中，對賴氨酸發酵菌種的種類無特殊要求，可以采用本領域常用的菌種，優選為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。本發明中，碳源優選為淀粉質原料糖化清液。本發明中，淀粉質原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法制糖工藝制備。從工藝簡單、設備投資少，生產成本較低的方面考慮，優選通過干法制糖工藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質原料不經浸泡直接進行破碎和酶解。干法制糖工藝可以包括將淀粉質原料粉碎，將淀粉質原料粉碎后的產物調漿，并加入淀粉酶對淀粉進行第一次水解；對第一次水解產物進行固液分離，并在得到的液相組分中加入糖化酶進行第二次水解，得到淀粉質原料糖化清液。優選地，粉碎使淀粉質原料過 30目篩的通過率大于75%，更優選過30目篩的通過率為100%。調漿的方法為本領域技術人員所熟知，但優選地，調漿的方法可以包括將淀粉質原料粉碎后的產物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17Β °。術語“波美度”是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計檢測溶液得到的度數。根據本發明，在第一次水解中，以每克粉碎后的產物的干重計，淀粉酶的用量可以為10-30酶活力單位，酶解的溫度可以為88-92°C，酶解的時間可以為90-120分鐘，酶解的 PH值可以為5. 5-6. 0。固液分離的條件沒有特別的限定，優選地，固液分離的條件使得到的液相組分中的固含量為19-22重量％，更優選為20-21重量％。根據本發明，在第二次水解中，以每克液相組分計，糖化酶的用量可以為110-130 酶活力單位，酶解的溫度可以為^_65°C，酶解的時間可以為420-600分鐘，酶解的pH值可以為 4. 0-4. 5。本發明酶活力單位的定義為在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫
克淀粉轉化為還原性糖所需的酶量為一個酶活力單位。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶又稱淀粉1，4_糊精酶，它能夠任意地、不規則地切開淀粉鏈內部的 α-1,4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4_糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和內孢霉產生。
根據本發明，優選使用α -淀粉酶。
根據本發明，糖化酶優選為α -1,4-葡萄糖水解酶。
按照本發明，淀粉質原料可以為本領域公知的各種可以用于酶解、發酵制備賴氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種。
本發明中，氮源的種類為本領域技術人員所公知，例如，可以為銨鹽。當氮源為銨鹽時，培養基中氮的濃度以銨根離子的濃度表示，氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升，則銨根離子的濃度控制在0. 5-1. 0克/升。
本發明中，發酵培養基的成分無特殊要求，可以采用本領域常用的賴氨酸發酵培養基，例如，可以用淀粉質原料糖化清液、糖蜜、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制發酵培養基。根據本發明，每升發酵培養基中各原料的用量可以在很大范圍內改變，優選情況下，每升發酵培養基中，淀粉質原料糖化清液的用量可以為 40-60克，糖蜜的用量可以為30-50克，玉米漿(干重為20-50重量％ )的用量可以為20-40 克，硫酸銨的用量可以為20-40克，磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-0. 6克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克，谷氨酸的用量可以為0. 2-0. 4克。
另外，本領域技術人員應該理解的是，接入種子罐進行培養的菌種為經過活化后進行增殖培養后的菌種。活化和增殖培養為本領域的公知常識，在此不再贅述。
以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
實施例
以下的實施例將對本發明作進一步的說明，但并不因此限制本發明。
在下述實施例和對比例中
OD值測定將取樣的發酵液進行沈倍稀釋，采用722Ν可見光分光光度計，在波長 562納米可見光下測定吸光值，即為OD值，將得到的OD值X稀釋倍數+發酵液的總體積， 計算得到的數值反映單位體積發酵液中產賴氨酸微生物的數量。
按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發酵液中還原性糖的濃度。
按照GB3595-83的方法測定發酵液中銨根離子的濃度。
按照GB10794-89標準檢測發酵液中的賴氨酸濃度(以賴氨酸鹽酸鹽計)。
單罐供酸量=(放罐的賴氨酸濃度X放罐體積+中間放料賴氨酸濃度X中間放料體積)。
轉化率(％ )=單罐供酸量/總糖的重量X100%，其中總糖的重量包括種子罐用糖重量和發酵罐用糖重量。發酵液中賴氨酸發酵菌種的提取方法將發酵培養15小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液混合均勻，其中賴氨酸含量為12g/100mL左右，然后采用膜孔徑0. 2 μ m、膜面積0. 25m2的金屬膜，在操作條件為進口壓力0. 35MPa、出口壓力0. 2MPa下過濾，濾出液濁度控制在30NTU以下，得到賴氨酸膜濾液和膜濃縮液，然后濾液進入賴氨酸提取工序，制成賴氨酸鹽酸鹽成品。膜濃縮液中固形物大部分為菌體，菌體干重含量為10g/100mL左右，將該膜濃縮液直接加入發酵培養30小時后至發酵培養48小時內的發酵罐中即可，即該膜濃縮液作為從放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種。實施例1本實施例用于說明本發明提供的賴氨酸的生產方法。(1)將收獲的100重量份玉米通過機械加工將玉米顆粒粉碎，使玉米粉過30目篩的通過率為80%。(2)將粉碎后的產物加水調漿至12Β °，相對于每克粉碎產物的干重，加入20個酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，α -淀粉酶)，在90°C、ρΗ為5. 5的條件下酶解100分鐘，得到酶解產物。其中，將酶解產物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出酶解清液 (固含量為20重量％ )；之后加入115個酶活力單位的糖化酶(α -1，4-葡萄糖水解酶，諾維信公司)，在60°C、pH為4. 5的條件下酶解420分鐘，得到淀粉質原料糖化清液。(3)使用步驟( 得到的淀粉質原料糖化清液配制種子罐培養基，具體組成為相對于每升種子罐培養基，淀粉質原料糖化清液的用量為35克，玉米漿(干重為35重量％ ) 的用量為80克，磷酸氫二鉀的用量為1. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，硫酸銨的用量為10 克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克。將培養基加熱到121°C消毒，維持20分鐘后降溫至37°C并保持恒定。開啟攪拌，調節罐壓為0. IMPa，按照通風量與培養基1 0.5 體積比通入無菌空氣，用氨水調節PH至6.8并保持恒定。然后將黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購自江南大學)活化和增殖后接入種子罐中進行培養，培養過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測定OD值，當鏡檢菌體形態正常且OD值達到0. 8時停止培養，得到成熟種子液。(4)使用步驟( 得到的淀粉質原料糖化清液配制發酵培養基，具體組成為相對于每升發酵培養基，淀粉質原料糖化清液的用量為50克，糖蜜(產地新疆)的用量為40克， 玉米漿(干重為35重量％ )的用量為30克，硫酸銨的用量為30克，磷酸氫二鉀的用量為 1. O克，硫酸鎂的用量為0. 5克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克，谷氨酸的用量為0. 3克。培養基加熱到121°C消毒30分鐘后降溫至37°C并保持恒定，用氨水調節pH 至 6. 9。(5)在發酵罐中裝入步驟(4)配制好的發酵培養基，發酵培養基體積為發酵罐體積的50%。使用步驟C3)所得的成熟種子液，接入發酵罐的培養基中進行發酵培養，以接種后的發酵培養基為基準，步驟C3)所得的成熟種子液的接種量為15體積％。接種后連續流加步驟( 得到的淀粉質原料糖化清液和硫酸銨，流加步驟( 得到的淀粉質原料糖化清液的量使發酵液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使發酵液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa,發酵溫度控制為37°C，通氣量為 0. 7立方米空氣/立方米的培養基/分鐘，并用液氨調節PH維持在6. 9進行發酵培養，流加
8步驟( 得到的淀粉質原料糖化清液和硫酸銨至發酵罐體積的75%時放料，放料體積為放料前發酵罐中發酵液體積的8%。
將發酵培養15小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液混合，從混合后的發酵液中提取賴氨酸發酵菌種，在發酵培養40小時時，向發酵罐中補加提取的賴氨酸發酵菌種，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，以補加的賴氨酸發酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發酵菌種的加入量為3g/L。發酵培養58小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度(即終點賴氨酸含量，下同)和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。
實施例2
本實施例用于說明本發明提供的賴氨酸的生產方法。
淀粉質原料糖化清液的制備方法、種子罐培養基配方、種子罐成熟種子液培養方法、發酵罐培養基配方均與實施例1相同。
發酵罐中的培養基體積為發酵罐體積的40%。將成熟種子液接入發酵罐的培養基中進行發酵培養，以接種后的發酵培養基為基準，種子液的接種量為12體積％。接種后連續流加制得的淀粉質原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質原料糖化清液的量使發酵液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使發酵液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. 08MPa,發酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 8立方米空氣/立方米的培養基/分鐘，并用液氨調節PH維持在6. 7進行發酵培養，流加制得的淀粉質原料糖化清液和硫酸銨至發酵罐體積的70%時放料，放料體積為放料前發酵罐中培養基體積的5%。
將發酵培養15小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液混合，從混合后的發酵液中提取賴氨酸發酵菌種，在發酵培養35小時時，向發酵罐中補加提取的賴氨酸發酵菌種，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，以補加的賴氨酸發酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發酵菌種的加入量為2g/L。發酵培養52小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。
實施例3
本實施例用于說明本發明提供的賴氨酸的生產方法。
淀粉質原料糖化清液的制備方法、種子罐培養基配方、種子罐成熟種子液培養方法、發酵罐培養基配方均與實施例1相同。
發酵罐中的培養基體積為發酵罐體積的60%。將成熟種子液接入發酵罐的培養基中進行發酵培養，以接種后的發酵培養基為基準，種子液的接種量為18體積％。接種后連續流加制得的淀粉質原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質原料糖化清液的量使發酵液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使發酵液中銨根離子的濃度控制在0. 8-1.0克/升，將罐壓控制為0. 05MPa，發酵溫度控制為38°C，通氣量為0. 9立方米空氣/立方米的培養基/分鐘，并用液氨調節PH維持在7. 0進行發酵培養，流加制得的淀粉質原料糖化清液和硫酸銨至發酵罐體積的80%時放料，放料體積為放料前發酵罐中培養基體積的10%。
將發酵培養15小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液混合，從混合后的發酵液中提取賴氨酸發酵菌種，在發酵培養45小時時，向發酵罐中補加提取的賴氨酸發酵菌種，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，以補加的賴氨酸發酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發酵菌種的加入量為4g/L。發酵培養64小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。對比例1按照實施例1的方法生產賴氨酸，不同的是，在發酵培養過程中不向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種，發酵培養48小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。表 權利要求
1.一種賴氨酸的生產方法，所述方法包括將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其特征在于，在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，在發酵培養35小時后至發酵培養45小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，以補加的賴氨酸發酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發酵菌種的加入量為 0. 5-5g/L。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，以補加的賴氨酸發酵菌種的干重計，補加的賴氨酸發酵菌種的加入量為2-4g/ L0
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，所述賴氨酸發酵菌種的接種量為12-18體積％。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述流加碳源的量使發酵液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，所述流加氮源的量使發酵液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述流加為連續流加。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的方法，其中，所述發酵培養在發酵罐中進行， 接種后且流加碳源和流加氮源之前發酵罐中的培養基的體積為發酵罐體積的40-60%，流加碳源和氮源至發酵罐體積的70-80%時放料，放料體積為放料前發酵罐中培養基體積的 5-10%。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，補加的賴氨酸發酵菌種為發酵培養15小時后至發酵培養40小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種。
10.根據權利要求9所述的方法，其中，補加的賴氨酸發酵菌種為發酵培養15小時后至發酵培養30小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種。
11.根據權利要求8-10中任意一項所述的方法，其中，發酵培養52-64小時后放罐。
12.根據權利要求1-11中任意一項所述的方法，其中，所述發酵培養的條件為溫度為 35_38°C，壓力為0. 05-0. lMPa，pH值為6. 7-7. 0，通氣量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養基/分鐘。
13.根據權利要求1-12中任意一項所述的方法，其中，所述賴氨酸發酵菌種為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。
14.根據權利要求1-13中任意一項所述的方法，其中，所述碳源為淀粉質原料糖化清液。
15.根據權利要求1-14中任意一項所述的方法，其中，所述氮源為銨鹽。
全文摘要
本發明公開了一種賴氨酸的生產方法，所述方法包括將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其特征在于，在發酵培養30小時后至發酵培養48小時內，向發酵液中補加賴氨酸發酵菌種。本發明提供的賴氨酸發酵方法，可延長發酵時間，提高終點賴氨酸含量、單罐供酸量和轉化率，從而降低生產成本，提高經濟效益，采用本發明優選的實施方式，即補加發酵培養15小時后至發酵培養40小時內放料的發酵液中提取的賴氨酸發酵菌種，可充分利用放料的發酵液中的賴氨酸發酵菌種，進一步降低生產成本，進一步提高經濟效益。
文檔編號C12P13/08GK102533890SQ20121000944
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者盧宗梅, 張繼學, 朱繼成, 熊結青, 章輝平 申請人:中糧生物化學(安徽)股份有限公司