專利名稱：一種疫苗佐劑ccl28及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程、蛋白質工程和免疫學領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑CCL28，同時還涉及一種疫苗佐劑CCL28的制備方法，還涉及一種疫苗佐劑CCL28的用途。
背景技術：
在人類對抗疾病的過程中，疫苗發(fā)揮著至關重要的作用。自從第一個疫苗—— 天花疫苗的發(fā)明以來，許多曾經致死的疾病都因為相應疫苗的研制成功而得以攻克或使其死亡率大大降低。然后，至今仍然存在許多疾病急待有效疫苗的出現，如艾滋病、流感等，以及一些新生的病毒性疾病，如禽流感、SARS、拉沙熱等(Rappuoli，R.，C. W. Mandl, et al. (2011). “ Vaccines for the twenty-first century society. " Nat Rev Immunol·)。 改良或研制出一個有效的疫苗可以從很多方面著手，其中選用合適佐劑是一種有效且易行的方法。合適的佐劑可以增強抗原的抗原性和免疫原性，從而使機體產生足夠強的免疫力 (包括體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫等)，抵抗致病病原體的入侵和/或致病。一個理想的佐劑應具有刺激機體針對抗原產生更強的免疫應答反應，而佐劑本身不具有或具有較弱的抗原性和免疫原性，不對機體產生其它副作用。細胞因子，由于其特殊的性質一方面，它參與免疫系統(tǒng)的調節(jié)，與機體的免疫能力密切相關，另一方面，由于它是機體自身蛋白，從而本身不具有抗原性和免疫原性，近年來，成為疫苗佐劑研究的熱點對象。IFN-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-15、IL-18和IL-21等都已證明具有較好的佐劑效應(Bolesta, Ε. , A. Kowalczyk, et al. (2006). “ Increased level and longevity of protective immune responses induced by DNA vaccine expressing the HIV-I Env glycoprotein when combined with IL-21 and IL-15 gene delivery. " J Immunol 177(1) :177-191.)(專利號200510119721. 5 ；200710306039. 6 ；200610147664.6 ； 200510119720. 0 ；200480036307. 1)。CC趨化因子配體28 (CCL28)，又稱為黏膜相關上皮細胞趨化因子(MEC)，主要表達于氣管、直腸、結腸和陰道等黏膜表皮細胞，以及唾液腺等外分泌性腺體。CCU8通過與其受體CCR3和CCR10的相關互作用而趨化吸引IgA分泌菜細胞至黏膜表面或腺體(Lazarus，N. H.，E. J. Kunkel, et al. (2003). “ A common mucosal chemokine (mucosae-associated epithelial chemokine/CCL28)selectively attracts IgA plasmablasts. " Journal of Immunology 170(7) :3799-3805 ；Hieshima, K. , Y Kawasaki, et al. (2004). " CC Chemokine Ligands 25 and 28Play Essential Roles in Intestinal Extravasationof IgA Antibody-Secreting Cells. " J Immunol 173(6) :3668-3675 ；Eksteen, B. , A. Miles, et al. (2006). “ Epithelial inflammation is associated with CCL28 production and the recruitment of regulatory T cells expressing CCR10. " Journal of Immunology 177(1) :593-603 ；Sundtrom, P., S.B.Lundin, et al. (2009). " Human IgA-secreting cells induced by intestinal, but systemic, immunization respond to CCL25(TECK) and CCL28(MEC) (vol 38, pg3327,
32008). “ European Journal of Immunology 39(11) :3267_3洸7·)。Kutzler等在研究流感疫苗時發(fā)現，以質粒形式的CCL28與質粒形式的抗原混合后，通過肌肉注射的方式免疫小鼠，不但能夠提高血清中抗原特異性的IgG、IgA水平，外周IFN-Y水平，而且能夠增強腸相關淋巴組織和肺部的抗體分泌(Kutzler，M. A.，K. A. Kraynyak，et al. (2009). “ Plasmids encoding the mucosal chemokines CCL27 and CCL28 are effective adjuvants in eliciting antigen-specific immunity in vivo. " Gene Ther.)。另夕卜，在 HIV-1 的石if 究中，Castelletti等發(fā)現HIV-1感染女性的母乳和唾液中HIV-1特異性抗體濃度與CCU8 ^ciSlEffi^ (Castelletti, E. ， S. Lo Caputo, et al. (2007). ‘‘ The Mucosae-Associated Epithelial Chemokine(MEC/CCL28)Modulates Immunity in HIV Infection. “ PLoS ONE 2(10) :e969.)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種疫苗的佐劑CCL28，這種佐劑可以使低應答的疫苗產生強而有效的免疫反應，這種強而有效的免疫反應包括機體針對抗原產生的有效體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫應答反應。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種疫苗的佐劑CCL28的制備方法，該制備方法過程簡單，質量易于控制，適合于大規(guī)模生產，制成的佐劑易于儲存和運輸。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種疫苗的佐劑CCU8在肌肉注射型、滴鼻免疫型(兩類)疫苗藥物中的應用，該佐劑能夠顯著增強機體針對疫苗產生的免疫應答反應， 這些免疫應答反應包括體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫反應。為了實現上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施本發(fā)明所述的佐劑是指包含有CCU8基因(基因型佐劑)、蛋白(蛋白型佐劑)或生物活性片段(多肽型佐劑)的佐劑。一種疫苗佐劑CCL28的制備方法，其步驟是1、從免疫接種受體分離得到脾臟細胞或外周血單核細胞(PBMC)，并抽提其總 mRNA (試劑盒購自invitrogen公司)；2、通過RT-PCR技術(Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第三版)，將所得 mRNA逆轉錄為單鏈cDNA (相關試劑購自invitrogen公司)；3、設計CCU8特異性擴增的PCR引物對，并通過引物對在基因兩端分別引入合適酶切位點，然后通過PCR(Molecular Cloning =A Laboratory Manual，第三版)擴增得到 CCU8基因片段；所述的引物對為(引物所引入酶切位點為下劃線所標示序列，酶切位點名稱標注于引物后的括號內)小鼠正義鏈引物5'-GATGAATTCATGCAGCAAGCAGGGCTCACACTC-3' (EcoRI)反義鏈引物5'-TTACTCGAGCTAACGAGAGGCTTCGTGCCTGTG-3' (XhoI)人正義鏈弓丨物5‘ -ATGAATTCATGCAGCAGAGAGGACTCGC-3 ‘ (EcoRI)反義鏈引物5'-CGCTCGAGCTAATAAGGAGTTTTATGGC-3‘ (XhoI)4、對CCU8基因片段和pcDNA3. 1 (+) (invitrogen公司)，分別進行雙酶切(NEB公司)，酶切得到的粘性末端片段通過T4連接酶(NEB公司)連接，得到重組表達質粒；5、將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α (TaKaRa公司)，然后將大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中大量擴增培養(yǎng)，最后從培養(yǎng)好的大腸桿菌提取重組質粒(質粒提取試劑盒購自Omega公司)；6、重組質粒序列測定(上海桑尼公司)后，序列正確的重組質粒即為本發(fā)明所述的基因型佐劑CCL28-pcDNA3. 1。其中一種分離的基因(小鼠源基因型佐劑CCL28)，其序列為SEQ ID 1所示核苷酸序列，一種分離的基因(人源基因型佐劑CCL28)，其序列為SEQ ID 3所示核苷酸序列。7、序列正確的CCU8全長序列或者部分序列，通過PCR擴增后，亞克隆至原核表達載體pETj8a (Novagen公司)，轉化到大腸桿菌Rosetta菌株(Novagen公司)，通過原核表達和純化后，得到蛋白型或多肽型CCU8佐劑(方法與申請人已申請的專利“重組融合蛋白CLD的多肽、編碼序列及制備方法和應用”相同，具體步驟參見該專利。專利號 201110030466.2)。其中一種表達并純化的蛋白質(小鼠源蛋白型佐劑CCL28)，其序列為 SEQ ID 2所示的氨基酸序列，一種表達并純化的蛋白質(人源蛋白型佐劑CCL28)，其序列為SEQ ID 4所示氨基酸序列。重組融合蛋白CLD的氨基酸序列的制備方法(專利申請?zhí)?01110030466. 2)，其
步驟是重組融合蛋白的表達與純化A、表達載體轉化菌株E. coli Rosetta菌株(市售，Novagen公司)，挑取單菌落至試管培養(yǎng)過夜，按照ι 100比例擴大培養(yǎng)至OD值為0. 6-1. 0，加入IPTG至終濃度為 ImM，誘導4-5小時后離心收集菌體，冰浴條件下超聲破碎，離心收集包含體。包含體用含 IM鹽酸胍的溶液洗滌兩次，然后用含有5mM DTT的鹽酸胍溶液溶解，室溫Q0_25°C，以下相同)IOOrpm震蕩4小時，4°C，12000rpm離心30分鐘，上清過0. 45 μ m濾膜過濾。上清稀釋在含10% (體積，以下相同)甘油，20mM Tris,500mM NaCl復性緩沖液中，ImM還原型谷胱甘肽/0. 2mM氧化型谷胱甘肽作為氧化還原對，4°C條件下，復性M小時。B、復性蛋白經鎳螯合His-蛋白親和層析樹脂純化后，用透析液(5%體積甘油， 20mM Tris,0. 2MNaCl)透析除去咪唑，平衡后，產物用超濾管濃縮。將各個復性融合蛋白濃縮至一定濃度，純度檢測采用SDS-PAGE，表明獲得的蛋白純度可以達到90%以上。—種疫苗佐劑CCU8在肌肉注射型、滴鼻免疫型(兩類)疫苗(藥物)中的應用， 其使用步驟是1.肌肉注射型疫苗將從大腸桿菌中提取的重組質粒CCI^8-pcDNA3. 1和質粒形式的抗原溶于生理鹽水中，混合均勻。然后將混合均勻的抗原佐劑混合物注射至小鼠后腿股四頭肌中，并以100V，50ms的脈沖電壓正反極各電擊三次，促進質粒轉染入肌肉細胞。2.滴鼻免疫型疫苗蛋白形式的抗原與的Chitosan混合均勻，制備成抗原滴鼻樣品；溶于超純水中的重組質粒CCL28-pcDNA3. 1與PEI (in vivo-jet PEI, Polyplus transfection公司)混合，制備成佐劑滴鼻樣品(具體步驟參見產品說明書)。免疫時，先將小鼠麻醉，然后將樣品逐滴滴入小鼠鼻孔。本發(fā)明的佐劑有以下幾個優(yōu)點1.佐劑為免疫受體自身基因，因而佐劑本身不會作為抗原引起機體的免疫應答反應，對機體的副作用??；2.佐劑的制備方法簡單，質量易于控制，易大規(guī)模生產，易保存和運輸，成本低；3.經相關實驗證明，本發(fā)明所述的佐劑CCL28，可以增強機體對抗原的免疫應答反應。與未使用佐劑的對照組小鼠相比，通過CCU8增強的實驗組小鼠，其血清中抗原特異性IgG和IgA水平有顯著上升(其中肌注免疫方式的小鼠血清中抗原特異性IgG和IgA 水平分別由619753. 075和915. 61832上升為2168815. 42和2070. 7016，分別升高3. 5倍和2. 3倍；滴鼻免疫方式的小鼠血清中抗原特異性IgG和IgA水平分別由359839. 26和 2061. 8026上升為1257901. 74和3833. 0124，分別升高3. 5倍和1. 9倍)，同時，反映CTL 水平的分泌IFN-Y抗原特異性脾臟淋巴細胞也有明顯增多(其中肌注免疫方式的小鼠脾臟中分泌IFN-Y抗原特異性脾臟淋巴細胞由每一百萬細胞中觀.9個上升為每一百萬細胞中157. 9個，升高5. 5倍；滴鼻免疫方式的小鼠脾臟中分泌IFN-γ抗原特異性脾臟淋巴細胞由每一百萬細胞中2. 3個上升為每一百萬細胞中12. 4個，升高5. 5倍)。另外，實驗組小鼠陰道分泌的抗原特異性IgG和IgA水平也有顯著提高，說明其黏膜免疫水平也得到增強(其中肌注免疫方式的小鼠陰道分泌的抗原特異性IgG和IgA水平分別由1903. 28406 和243. 08172上升為13270. 1302和2931. 04532，分別升高7. 0倍和12. 1倍；滴鼻免疫方式的小鼠陰道分泌的抗原特異性IgG和IgA水平分別由567. 79924和1967. 86764上升為 4830. 55718 和 5447. 3058，分別升高 8. 5 倍和 2. 8 倍)。


圖1為一種佐劑mCCU8通過肌注免疫方式提高免疫后小鼠血清中抗原特異性抗體的水平示意圖。圖IA為血清中抗原特異性IgA抗體水平；圖IB為血清中抗原特異性IgG抗體水平。pCN140+VECT0R為對照組，pCN140+mCCI^8為實驗組。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗， P值小于0. 05認為組間有顯著差異，ρ值小于0. 01認為組間有極顯著差異。ρ值標示于柱狀圖上方。圖2為一種佐劑mCCU8通過肌注免疫方式提高免疫后小鼠陰道黏膜表面抗原特異性抗體的水平示意圖。圖2A為陰道沖洗樣中抗原特異性IgA抗體水平；圖2B為陰道沖洗樣中抗原特異性IgG抗體水平。pCN140+VECT0R為對照組，pCN140+mCCI^8為實驗組。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，ρ值小于0. 05認為組間有顯著差異，ρ值小于0. 01認為組間有極顯著差異。ρ 值標示于柱狀圖上方。圖3為一種佐劑mCCU8通過肌注免疫方式提高免疫后小鼠脾臟中抗原特異性分泌INF-γ的淋巴細胞數示意圖。pCN140+VECT0R為對照組，pCN140+mCCI^8為實驗組。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，P值小于0. 05認為組間有顯著差異，P值小于0. 01認為組間有極顯著差異。P值標示于柱狀圖上方。圖4為一種佐劑mCCU8通過滴鼻免疫方式提高免疫后小鼠血清中抗原特異性抗體的水平示意圖。圖4A為血清中抗原特異性IgA抗體水平；圖4B為血清中抗原特異性IgG抗體水平。CN140+VECT0R為對照組，CN140+mCCI^8為實驗組。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，ρ 值小于0. 05認為組間有顯著差異，ρ值小于0. 01認為組間有極顯著差異。ρ值標示于柱狀圖上方。圖5為一種佐劑mCCU8通過滴鼻免疫方式提高免疫后小鼠陰道黏膜表面抗原特異性抗體的水平示意圖。圖5A為陰道沖洗樣中抗原特異性IgA抗體水平；圖5B為陰道沖洗樣中抗原特異性IgG抗體水平。CN140+VECT0R為對照組，CN140+mCCI^8為實驗組。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，ρ值小于0. 05認為組間有顯著差異，ρ值小于0. 01認為組間有極顯著差異。ρ 值標示于柱狀圖上方。圖6為一種佐劑mCCU8通過滴鼻免疫方式提高免疫后小鼠脾臟中抗原特異性分泌INF-γ的淋巴細胞數示意圖。CN140+VECT0R為對照組，CN140+mCCL28為實驗組。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，P值小于0. 05認為組間有顯著差異，P值小于0. 01認為組間有極顯著差異。P值標示于柱狀圖上方。
具體實施例方式實施例1 一種疫苗佐劑CCL28的制備方法，其步驟是1、從免疫接種受體分離得到脾臟細胞或外周血單核細胞(PBMC)，并抽提其總 mRNA (試劑盒購自invitrogen公司)；2、通過 RT-PCR 技術(Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第三版)，將所得mRNA逆轉錄為單鏈cDNA (相關試劑購自invitrogen公司)；3、設計CCU8特異性擴增的PCR引物對，并通過引物對在基因兩端分別引入合適酶切位點，然后通過PCR(Molecular Cloning =A Laboratory Manual，第三版)擴增得到 CCU8基因片段；所述的引物對為(引物所引入酶切位點為下劃線所標示序列，酶切位點名稱標注于引物后的括號內)小鼠正義鏈弓丨物5‘ -GATGAATTCATGCAGCAAGCAGGGCTCACACTC-3 ‘ (EcoRI)反義鏈引物5'-TTACTCGAGCTAACGAGAGGCTTCGTGCCTGTG-3' (XhoI)人正義鏈弓丨物5‘ -ATGAATTCATGCAGCAGAGAGGACTCGC-3 ‘ (EcoRI)反義鏈引物5'-CGCTCGAGCTAATAAGGAGTTTTATGGC-3‘ (XhoI)4、對CCU8基因片段和pcDNA3. 1 (+) (invitrogen公司)，分別進行雙酶切(NEB公司)，酶切得到的粘性末端片段通過T4連接酶(NEB公司)連接，得到重組表達質粒；5、將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α (TaKaRa公司)，然后將大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中大量擴增培養(yǎng)，最后從培養(yǎng)好的大腸桿菌提取重組質粒(質粒提取試劑盒購自Omega公司)；6、重組質粒序列測定(上海桑尼公司)后，序列正確的重組質粒即為本發(fā)明所述的基因型佐劑CCL28-pcDNA3. 1。其中一種分離的基因(小鼠源基因型佐劑CCL28)，其序列
7為SEQ ID 1所示核苷酸序列，一種分離的基因(人源基因型佐劑CCL28)，其序列為SEQ ID 3所示核苷酸序列。7、序列正確的CCU8全長序列或者部分序列，通過PCR擴增后，亞克隆至原核表達載體pETj8a (Novagen公司)，轉化到大腸桿菌Rosetta菌株(Novagen公司)，通過原核表達和純化后，得到蛋白型或多肽型CCU8佐劑(方法與申請人已申請的專利“重組融合蛋白CLD的多肽、編碼序列及制備方法和應用”相同，具體步驟參見該專利。專利號 201110030466.2)。其中一種表達并純化的蛋白質(小鼠源蛋白型佐劑CCL28)，其序列為 SEQ ID 2所示的氨基酸序列，一種表達并純化的蛋白質(人源蛋白型佐劑CCL28)，其序列為SEQ ID 4所示氨基酸序列。重組融合蛋白CLD的氨基酸序列的制備方法(專利申請?zhí)?01110030466. 2)，其
步驟是重組融合蛋白的表達與純化A、表達載體轉化菌株E. coli Rosetta菌株(市售，Novagen公司)，挑取單菌落至試管培養(yǎng)過夜，按照ι 100比例擴大培養(yǎng)至OD值為0. 6-1. 0，加入IPTG至終濃度為 ImM，誘導4-5小時后離心收集菌體，冰浴條件下超聲破碎，離心收集包含體。包含體用含 IM鹽酸胍的溶液洗滌兩次，然后用含有5mM DTT的鹽酸胍溶液溶解，室溫Q0_25°C，以下相同)IOOrpm震蕩4小時，4°C，12000rpm離心30分鐘，上清過0. 45 μ m濾膜過濾。上清稀釋在含10% (體積，以下相同)甘油，20mM Tris,500mM NaCl復性緩沖液中，ImM還原型谷胱甘肽/0. 2mM氧化型谷胱甘肽作為氧化還原對，4°C條件下，復性M小時。B、復性蛋白經鎳螯合His-蛋白親和層析樹脂純化后，用透析液(5%體積甘油， 20mM Tris,0. 2MNaCl)透析除去咪唑，平衡后，產物用超濾管濃縮。將各個復性融合蛋白濃縮至一定濃度，純度檢測采用SDS-PAGE，表明獲得的蛋白純度可以達到90%以上。實施例2 —種疫苗佐劑CCU8在肌肉注射型疫苗中的應用，其步驟是小鼠源CCU8 (mCCL28)與質?？乖璸CNM_gpl40共免疫BALB/c小鼠增強小鼠針對CNM-gpl40的體液免疫、細胞免疫及黏膜免疫水平1.疫苗組成抗原經密碼子優(yōu)化的pCNM-gpl40質粒(簡稱pCN140，CNM為HIV-107B，/C亞型)(Cranage, Fraser et al. 2011)佐劑mCCI^8-pcDNA3·1 (簡稱 mCCL28)對照:pcDNA3.1 (+)空載體(簡稱 VECTOR, invitrogen 公司)每只小鼠每次免疫劑量為抗原50μ g、佐劑或者對照100μ g，用生理鹽水稀釋至總體積80 μ 1，蝸旋混勻。2.實驗設計1)實驗分組實驗組pCm40(50 μ g) +mCCL28 (100 μ g)對照組pCm40(50 μ g) +VECTOR (100 μ g)2)免疫策略SPF級6至8周齡、雌性BALB/c小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)隨機分成兩組，每組5只，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房。小鼠免疫以3周為一免疫周期，分別在0、3、6周對小鼠進行免疫。免疫采用肌肉注射加電擊加強的方式。混合均勻的疫苗與佐劑注射于小鼠左右兩只后腿股四頭肌(40 μ 1/腿)，并以100V，50ms的脈沖電壓正反極各電擊三次，促進質粒形式的抗原和佐劑成分轉染入肌肉細胞。3)樣品采集血樣和陰道沖洗樣分別于免疫前和三免一周采集。血樣通過眼眶后靜脈叢采集， 采集后置于4°C，4-6小時，離心取血清，-80°C保存，備用。陰道沖洗樣用ΙΟΟμΙ含蛋白酶抵制劑(Roche公司)的PBS沖洗陰道得到。采集后，離心取上清，-80°C保存，備用。脾臟細胞和腸系膜淋巴結細胞采集于三免一周。小鼠經斷頸處死后，取其脾臟和腸系膜淋巴結，通過70 μ m尼龍網濾器(BD Falcon公司)研磨過濾，得到單細胞懸液，再經淋巴細胞分離液分選后，得到淋巴細胞懸液。得到的淋巴細胞便可用于后續(xù)實驗。3.結果和結論1)血清和陰道沖洗樣中CN140特異性IgG、IgA滴度樣品中CN140抗原特異性IgG、IgA滴度均采用終點滴度ELISA進行測定，具體方法如下96 孔 ELISA 板(NUNC MaxiSorp, Thermo Scientific 公司)用 5 μ g/ml 的 CN140 蛋白50 μ 1/孔于室溫Q0-25°C，上下相同)包被過夜。包被好的板子經PBS+0. 05% Tween 洗滌和BSA于37°C封閉一小時后，將小鼠樣品按適合稀釋度加入ELISA板，并以1 3 做梯度稀釋，然后置于37°C孵育一小時。經PBS+0. 05% Tween洗滌后，加入HRP標記的檢測二抗。測定IgG滴度時，加入山羊抗小鼠IgG-HRP(l 5000稀釋，Abcam公司)，37°C孵育一小時；測定IgA滴定時，先后加入山羊抗小鼠IgA-Biotind 5000稀釋，Southern Biotechnology 公司)，37°C孵育一小時和 Mi^ptavidin-HRP (1 5000，R&D 公司)，37°C孵育30分鐘。孵育好的ELISA板經TMB (Sigma公司)顯色5分鐘，加入IM H2SO4終止反應， 分別讀取450nm和570nm(參照波長)的OD值。最后，以陰性樣品OD450的平均值+3倍標準差為截斷值，計算各樣品抗體終點滴度。實驗結果見說明附圖1和圖2。圖IA為血清中抗原特異性IgA滴度；圖IB為血清中抗原特異性IgG滴度；圖2A為陰道沖洗樣中抗原特異性IgA滴度；圖2B為陰道沖洗樣中抗原特異性IgG滴度。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗， P值小于0. 05認為組間有顯著差異，ρ值小于0. 01認為組間有極顯著差異。從實驗結果可以看出，與對照組相比，經mCCI^S和pCN140共免疫的小鼠，其血清和陰道沖洗樣中CN140特異性的IgG和IgA滴度都有顯著升高，說明mCCU8能夠增強小鼠針對抗原的體液免疫應答和黏膜免疫應答。2)脾臟細胞 INF- y ELISP0T該實驗使用的小鼠INF- y ELISP0T試劑盒購自達科為生物科技有限公司，實驗步驟按照產品說明書進行。簡述如下小鼠脾臟淋巴細胞經活細胞計數后，加入ELISP0T板中，IXlO6/孔，每個小鼠樣品設三個重復(實驗孔)，并設陰性和陽性平行對照。實驗孔加入刺激物CN140蛋白至20 μ g/ml,陽性對照孔加入concanavalinA(Sigma公司)，陰性對照加入培養(yǎng)基。將各孔體積用培養(yǎng)基調至100 μ 1，混勻，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。然后低滲破碎細胞并清洗ELISP0T板，分別加入生物素檢測抗體和Mi^ptavidin-HRP 并于37°C孵育1小時。AEC顯色于37°C進行，約25分鐘，然后用自來水清洗終止反應，室溫晾干后，讀板，計數，分析數據(Biosys公司)。實驗結果見說明附圖3。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，ρ值小于0. 05認為組間有顯著差異，ρ值小于0. 01認為組間有極顯著差異。從實驗結果可以看出，與對照組相比，經mCCI^S和pCN140共免疫的小鼠，其脾臟中CN140特異性、分泌INF- γ的T淋巴細胞有顯著增多，說明mCCU8能夠增強小鼠針對抗原的細胞免疫應答反應。實施例3 一種疫苗佐劑CCU8在滴鼻免疫型疫苗中的應用，其步驟是 小鼠源CCU8 (mCCL28)與蛋白抗原CNM_gpl40共免疫BALB/c小鼠增強小鼠針對 CN54-gpl40的體液免疫、細胞免疫及黏膜免疫水平1.疫苗組成抗原:CN54-gpl40蛋白(簡稱CN140,由Polymun Scientific公司表達并純化， CN54 為 HIV-107B，/C 亞型)佐劑mCCI^8-pcDNA3·1 (簡稱 mCCL28)對照:pcDNA3.1 (+)空載體(簡稱 VECTOR, invitrogen 公司)每只小鼠每次免疫劑量為抗原5 μ g、佐劑或者對照15 μ g。抗原配制5μ g CN54-gpl40蛋白溶于含Chitosan的生理鹽水中，蝸旋混勻。佐劑配制使用商用的佐劑PEI (in vivo-jet PEI, Polyplus transfection 公司)，15 μ g佐劑或對照載體與PEI混合(N/P = 7，總體積為30 μ 1)，詳細步驟參見產品說明書。2.實驗設計1)實驗分組實驗組:CN140(5yg)+mCCL28(15y g)對照組:CN140(5 μ g) +VECTOR (15 μ g)2)免疫策略SPF級6至8周齡、雌性BALB/c小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司) 隨機分成兩組，每組5只，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房。小鼠免疫以3周為一免疫周期，分別在0、3、6周對小鼠進行免疫，蛋白免疫先于質粒免疫三天進行。蛋白免疫和質粒免疫均采用滴鼻方式小鼠經麻醉后，將樣品逐滴滴入小鼠鼻孔。3)樣品采集樣品采集方法同應用實例1。3.結果和結論1)血清和陰道沖洗樣中CN140特異性IgG、IgA滴度樣品中CN140抗原特異性IgG、IgA滴度均采用終點滴度ELISA進行測定，方法與應用實例2相同。實驗結果見說明附圖4和圖5。圖4A為血清中抗原特異性IgA滴度；圖 4B為血清中抗原特異性IgG滴度；圖5A為陰道沖洗樣中抗原特異性IgA滴度；圖5B為陰道沖洗樣中抗原特異性IgG滴度。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，ρ值小于0. 05認為組間有顯著差異，P值小于0. 01認為組間有極顯著差異。從實驗結果可以看出，與對照組相比，經mCCI^S和CN140共免疫的小鼠，其血清和陰道沖洗樣中CN140特異性的IgG和IgA滴度都有顯著升高，說明mCCU8能夠增強小鼠針對抗原的體液免疫應答和黏膜免疫應答。
幻脾臟細胞INF-γ ELISP0T該實驗使用的小鼠INF-γ ELISP0T試劑盒購自達科為生物科技有限公司，實驗步驟按照產品說明書進行。方法與應用實例2相同。實驗結果見說明附圖6。數據統(tǒng)計分析采用雙尾t檢驗，ρ值小于0. 05認為組間有顯著差異，ρ值小于0. 01認為組間有極顯著差
已從實驗結果可以看出，與對照組相比，經mCCI^S和CN140共免疫的小鼠，其脾臟中 CN140特異性、分泌INF- γ的T淋巴細胞有顯著增多，說明mCCU8能夠增強小鼠針對抗原的細胞免疫應答反應。4.總結論CCU8做為免疫佐劑，能夠顯著提高機體針對抗原的體液免疫、細胞免疫以及黏膜免疫水平。
權利要求
1.一種分離的基因，其序列為SEQ ID 1所示的核苷酸序列。
2.一種表達并純化的蛋白質，其序列為SEQ ID 2所示的氨基酸序列。
3.一種分離的基因，其序列為SEQ ID 3所示的核苷酸序列。
4.一種表達并純化的蛋白質，其序列為SEQ ID 4所示的氨基酸序列。
5.權利要求1至4所述的一種疫苗佐劑CCL28的制備方法，其步驟是A、從免疫接種受體分離得到脾臟細胞或外周血單核細胞，并抽提其總mRNA；B、通過RT-PCR技術，將所得mRNA逆轉錄為單鏈cDNA；C、設計CCU8特異性擴增的PCR引物對，并通過引物對在基因兩端分別引入合適酶切位點，然后通過PCR擴增得到CCU8基因片段；所述的引物對為小鼠正義鏈引物5' -GATGAATTCATGCAGCAAGCAGGGCTCACACTC-3' 反義鏈引物5' -TTACTCGAGCTAACGAGAGGCTTCGTGCCTGTG-3' 人正義鏈引物5' -ATGAATTCATGCAGCAGAGAGGACTCGC-3‘ 反義鏈引物5' -CGCTCGAGCTAATAAGGAGTTTTATGGC-3‘D、對CCU8基因片段和pcDNA3.1⑴，分別進行雙酶切，酶切得到的粘性末端片段通過 T4連接酶連接，得到重組表達質粒；E、將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，然后將大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中大量擴增培養(yǎng)，最后從培養(yǎng)好的大腸桿菌提取重組質粒；F、重組質粒序列測定后，序列正確的重組質粒即為本發(fā)明所述的基因型佐劑 CCL28-pcDNA3. 1。
6.權利要求1至5中所述的一種疫苗佐劑CCU8在肌肉注射型疫苗中的應用。
7.權利要求1至5中所述的一種疫苗佐劑CCU8在滴鼻免疫型疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種疫苗佐劑CCL28及其制備方法和應用。該佐劑制備方法簡單，質量易于控制，易大規(guī)模生產，易保存和運輸，成本低。實驗結果表明該佐劑能夠同時顯著提高機體細胞免疫和體液免疫的水平，并能增強黏膜表面抗原特異性的抗體水平。
文檔編號C12N15/12GK102559693SQ20121000957
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權日2012年1月13日
發(fā)明者羅素坤, 胡凱, 胡勤學 申請人:中國科學院武漢病毒研究所