專利名稱：一種間充質干細胞及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞工程領域，具體提供了一種間充質干細胞及其制備方法和應用。
背景技術：
間充質干細胞最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。近年來有文獻報道人臍帶Wharton' s(音譯華頓氏)膠質也富含間充質干細胞。臍帶間充質干細胞和骨髓來源的間充質干細胞類似，表達一些共有的表面標志物，具有較高自我再生能力，能分化成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞、心肌細胞及內皮細胞。Baksh D等實驗結果表明臍帶間充質干細胞增殖能力高于骨髓間充質干細胞。由于骨髓穿刺手術對于供者是有創性手術，而且自采集骨髓液至培養臨床治療數量級的間充質干細胞需要4-6周時間。健康剖宮產臍帶以往屬于醫療廢物，采集臍帶對產婦及新生兒無任何影響，而且制備的合格臍帶間充質干細胞可建立間充質干細胞庫液氮保存，可短期內擴增獲得臨床治療數量級細胞。人臍帶Wharton' s膠質來源的基質細胞在再生治療方面有廣闊的應用前景。目前國內外文獻報道的培養臍帶來源間充質干細胞方法為低糖DMEM或α MEM培養基添加5-20%胎牛血清，同時可加入人間充質干細胞相關生長因子，如成纖維細胞生長因子FGF或血小板源生長因子PDGF。臍帶間充質干細胞傳代培養至Ρ2代或Ρ3代純度可達到應用于再生治療的要求，現有制備方法在傳代時用豬胰腺提取的胰酶及EDTA.妝2消化上一代細胞后傳代培養。但是應用現有方法制備的間充質干細胞制品中混雜少量牛血清白蛋白、豬胰酶，二者均是明確的高致敏原，患者接受本方法制備的間充質干細胞懸液會產生對應抗體，降低間充質干細胞治療療效及增加過敏性反應發生，而且有感染包括牛腦海綿狀病在內的牛病毒的潛在風險。此外，Furlani D等研究表明利用胎牛血清培養的間充質干細胞有10%以上的細胞直徑大于45 μ m,細胞直徑越大對于微循環毛細血管床的阻塞作用越明顯，大劑量靜脈輸注試驗條件下嚴重時可導致小鼠死亡，這為患者利用間充質干細胞進行再生治療帶來了潛在的威脅。同時，在傳代時，豬胰酶消化靶點較多，對間充質干細胞的毒性大，進而影響細胞的活力。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種間充質干細胞及其制備方法和應用，使得該制備方法制備的間充質干細胞直徑較小，降低引發過敏性反應的幾率，提高傳代細胞活力。
為實現以上發明目的，本發明提供如下技術方案一種間充質干細胞的制備方法，將臍帶去除臍動脈和臍靜脈后切成小塊，用含有 0. 1% IV型膠原酶的α MEM培養基以及完全培養基消化，然后將臍帶小塊和消化后得到的細胞懸液離心，去上清后洗滌除去膠原酶和膠原，接著用完全培養基重懸，重懸后的懸液轉移至由貼壁基質包被過的培養瓶中培養，至出現梭形貼壁細胞時洗滌除去未貼壁細胞，并更換新的完全培養基繼續培養，以后每2天更換一次完全培養基，至梭形貼壁細胞的匯聚度達到80-85%即得；所述完全培養基為含有15-25ng/ml FGF、15_25ng/ml PDGF、15_25ng/ml 人白蛋白、15-25ng/ml胰島素、15_25ng/ml硒酸鈉和15_25ng/ml鐵蛋白的α MEM培養基；本發明采用的臍帶由蘇州大學第一附屬醫院婦產科提供，采集前經產婦同意并簽署知情同意書。現有制備臍帶間充質干細胞的方法，由于采用胎牛血清，使得間充質干細胞帶有異種動物蛋白，增加其在患者體內引發過敏性反應的幾率，同時現有制備的間充質干細胞直徑較大，在用于再生治療時，會對微循環毛細血管床起阻塞作用，給患者造成威脅。為此，本發明優化培養基成分，選用新的無血清無動物異種蛋白的完全培養基進行制備，大大減小了間充質干細胞引發過敏性反應的幾率，并且最終制備的間充質干細胞直徑經倒置顯微鏡檢測，平均為沈μ m，而利用現有方法制備的細胞直徑平均為35 μ m。同時，經小鼠注射試驗檢測，本發明間充質干細胞注射后小鼠死亡率僅為10 %，而現有方法制備的間充質干細胞小鼠死亡率為100%。其中，本發明所述完全培養基優選采用MesenCult-ACF無血清培養基，購自于加拿大Memcell公司，產品目錄號為05420。所述貼壁基質可采用本領域常規貼壁基質，本發明優選采用含有纖連蛋白的貼壁基質，更優選采用MesenCult貼壁基質，購自于加拿大 Memcell公司。含有0. 1 % IV型膠原酶的α MEM培養基購自于Worthington公司。α MEM 培養基為本領域經常使用的培養基，是alpha改良的Earle培養基，購自于美國Gibco公司ο本發明所述消化優選為在37°C、250rpm下消化2小時，所述培養優選為在37°C、 5% CO2濃度、95%相對濕度下培養。在實際的消化過程中，臍帶小塊并不能完全消化成細胞懸液，仍有部分較小的小塊殘留，其上含有許多間充質干細胞，可隨細胞懸液一并進入下個制備環節，避免浪費原材料。本發明在消化后的洗滌是為了去除膠原酶和膠原，而在梭形貼壁細胞出現后的洗滌是為了去除未貼壁細胞，兩次洗滌可采用本領域常規的不影響細胞生長的試劑，如PBS，本發明優選采用α MEM培養基。在本發明繼續培養過程中，按照本領域公知常識需要定期更換培養基，本發明優選每隔2天更換一次完全培養基，為了保證一定的細胞數量，本發明優選在梭形貼壁細胞匯聚度達到80-85%時收集。現有技術在傳代時采用豬胰酶來消化貼壁細胞，但是豬胰酶是一種含有多種蛋白的混合物，間充質干細胞會帶有一些豬胰酶，豬胰酶中的多種異種動物蛋白無疑會增加引發過敏性反應的幾率。并且，豬胰酶對于間充質干細胞的毒性較大，在傳代時影響細胞的活力。為此，作為優選方案，本發明還包括傳代培養步驟，將上述培養的梭形貼壁細胞(即上一代間充質干細胞)洗滌，然后用TrypLE細胞分散酶消化至梭形貼壁細胞從貼壁基質上分離，將消化后得到的細胞懸液加入完全培養基離心去上清，與洗滌貼壁基質后的溶液混合離心去上清，再次洗滌去上清后用完全培養基重懸，將所得懸液接種于由貼壁基質包被過的培養瓶中，加入完全培養基培養，培養后的梭形貼壁細胞即為下一代間充質干細胞；所述完全培養基、貼壁基質、培養方法同上述制備方法。在本發明傳代培養中，第一次洗滌是為了除去上一代間充質干細胞中殘留的完全培養基中的蛋白，第二次洗滌是為了最大化收集用于傳代培養的間充質干細胞，而第三次洗滌的目的與第一次洗滌相同，這三次洗滌均可采用本領域常規的不影響細胞生長的試劑，如PBS。本發明將用完全培養基重懸后的懸液以一定的細胞密度接種于由貼壁基質包被過的培養瓶中，經過培養即可得到下一代間充質干細胞。其中，作為優選，接種的細胞密度優選為3X IO3個/cm2 ；為了保證細胞充分的營養物質以及收集到一定量的細胞，本發明在傳代培養中優選每隔2天更換一次完全培養基，并在下一代梭形貼壁細胞匯聚度達到 80-85%時收集。本發明采用TrypLE klect重組酶進行細胞的消化分離，它是一種不含動物來源蛋白的重組細胞消化酶，不含牛及豬來源異種蛋白，可用來消化貼壁細胞如CHO、HEK 293,
等貼壁細胞、是一種能降解細胞表面蛋白的酶，對細胞表面突起蛋白的降解損傷較常用的胰酶弱，購自于美國Gibco公司，目錄號為12563-001。本發明的傳代方法和現有的傳代方法相比，其傳代后的細胞活力較后者的細胞活力提高了 5%左右。由于本發明所述制備方法制備的間充質干細胞具有上述優點，故本發明還提供一種由本發明所述制備方法制備的間充質干細胞，其可以應用于再生治療制品的制備過程中。由以上技術方案可知，本發明所述制備方法優化培養基成分，采用無血清無動物異種蛋白的培養基制備，所制備的間充質干細胞直徑較小且能夠降低過敏性反應的發生幾率，增加了患者再生治療的安全性；傳代培養采用細胞毒性小、成分單一的重組酶，提高了細胞的活力。


圖1所示為間充質干細胞CM9、CD73免疫表型檢測的流式細胞結果圖；圖2所示為間充質干細胞⑶105、⑶44免疫表型檢測的流式細胞結果圖；圖3所示為間充質干細胞HLA-ABC、CD45免疫表型檢測的流式細胞結果圖；圖4所示為間充質干細胞HLA-DR、CD31免疫表型檢測的流式細胞結果圖；圖5所示為間充質干細胞CD34免疫表型檢測的流式細胞結果圖。
具體實施例方式本發明公開了一種間充質干細胞及其制備方法和應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明。實施例1 利用本發明所述制備方法制備間充質干細胞臍帶運送選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產科并發癥的剖宮產臍帶，術前經得產婦知情同意并簽署知情同意書。術前準備250ml無菌聚苯乙烯儲液瓶作為臍帶運送瓶，內裝IOOml α MEM培養基(Gibco公司產品)添加1000U肝素鈉及100U青霉素/鏈霉素。10-30cm長臍帶裝入瓶內，4°C條件下2小時內送到實驗室。臍帶消化臍帶運送到實驗室后，使用磷酸鹽緩沖液PBS (Gibco公司產品)洗滌2 遍去除血液及羊水。在2級生物安全柜內進行臍帶處理。準備一個無菌包內含1把中號手術直剪、1把中號手術直鑷、1個直徑為IOcm的玻璃培養皿、1個IOOml燒杯。將臍帶剪為 2_3cm的臍帶段，分別取出臍動脈和臍靜脈棄去。臍帶段剪成3mmX3mmX5mm小塊，轉移至 50ml錐形底聚丙乙烯離心管內，以含0. 1 % IV型膠原酶α MEM培養基(Worthington公司) 和MesenCuk -ACF (目錄號05420)無血清無動物成分的完全培養基(Stemcell公司) 為消化液，加入25ml置于恒溫搖床以37°C、250rpm消化2小時，消化后用3倍與消化液體積的α MEM培養基洗滌3遍去除膠原酶和膠原。細胞培養瓶包板提前1天進行包板。以1 觀比例用PBS稀釋貼壁基質成分 (Stemcell公司)，T-75cm2培養瓶加入5ml貼壁基質，擰緊瓶蓋水平放置室溫過夜。次日使用前用IOml移液管吸盡液體成分避免接觸細胞貼壁面。無菌滅菌水洗滌1遍，洗凈滅菌水，室溫靜置15min。臍帶間充質干細胞原代培養將消化后臍帶小塊及細胞懸液用 75-150ml MesenCult -ACF (Catalog#05420)無血清無動物成分的完全培養基重懸。懸液轉移至貼壁基質成分包被過的T-75cm2培養瓶，置于37°C及5% C02、95%濕度培養箱內培養48小時。培養48小時候可見梭形貼壁細胞，吸盡培養液并用α MEM培養基洗滌1遍， 加入新鮮MesenCult -ACF無血清培養基，此后每2天換液一次。直至梭形貼壁細胞匯聚度達到80% -85%，一般時間為8-12天，即得PO代間充質干細胞。實施例2 間充質干細胞免疫表型檢測制備PO代間充質干細胞懸液，調整細胞密度為4X IO5個/ml，每管加入0. 5ml細胞懸液，每管分別加入 PE 標記抗 CD29、CD105、CD73、CD44、HLA-DR、HLA-ABC, CD34、CD45、 CD31單克隆抗體，FC500流式細胞儀檢測，結果見圖1。由圖1可知，本發明制備的間充質干細胞細胞免疫表型完全符合公認的間充質干細胞表型。實施例3 間充質干細胞分化潛能檢測1、脂肪細胞分化PO代間充質干細胞按5 X IO3個/cm2細胞密度接種6孔板，誘導分化完全培養基為添加1 μ M地塞米松、500 μ M異丁基甲基黃嘌呤、60 μ M吲哚美辛、5mg/L胰島素及10%胎牛血清的低糖DMEM培養基。每3天換新誘導分化液一次。誘導培養21天，吸盡培養液，10% 中性甲醛固定1小時，取ImlO. 16%油紅0染色20min。吸盡染液，70%乙醇快速洗滌1遍， 加入ImlPBS鏡下觀察。鏡檢結果顯示，所制備的間充質干細胞能夠分化為脂肪細胞。2、成骨細胞分化PO代間充質干細胞按5X IO3個/cm2胞密度接種6孔板，誘導分化完全培養基為添加IOnM地塞米松、5mM β -glycerophosphate、IOnM維生素D3、50mg/L抗壞血酸及10%胎牛血清的低糖DMEM培養基。每3天換新誘導分化液一次。誘導培養21天，進行von Kossa 染色。吸盡培養液，10%中性甲醛固定1小時，取Iml 5%硝酸銀室溫避光靜置20min。吸盡硝酸銀，蒸餾水洗滌1遍，紫外燈下照射20min，5 %硫代硫酸鈉溶液洗滌1遍，蒸餾水洗滌 1遍鏡下觀察。鏡檢結果顯示，所制備的間充質干細胞能夠分化為骨細胞。
3、軟骨細胞分化
PO代間充質干細胞調整為1.6X107個/ml細胞密度，用移液器接無菌黃槍頭 10-20 μ 1多點接種6孔板，飽和濕度下37°C培養箱靜置孵育20min。靜置后緩慢加入誘導分化完全培養基為含添加IOOnM地塞米松、10 μ g/L TGF- β 3及10%胎牛血清的低糖DMEM 培養基。每3天換新誘導分化液一次。誘導培養21天，進行Alcian Blue染色。吸盡誘導分化液，10%中性甲醛固定1小時，取Imll %酸性Alcian Blue室溫孵育20min。吸盡染液， 蒸餾水洗滌1遍，鏡下觀察。鏡檢結果顯示，所制備的間充質干細胞能夠分化為軟骨細胞。
實施例4 間充質干細胞的細胞直徑檢測
采用相同來源、質量的臍帶，分別利用本發明所述方法和傳統方法(加胎牛血清培養)制備間充質干細胞，其他培養條件一致，將各自制備的間充質干細胞制成細胞懸液靜置于培養瓶內，采用LEICA或NIKON帶相機的高端倒置顯微鏡下測量，以微米為單位。
結果顯示，本發明所述制備方法制備的間充質干細胞的細胞直徑介于18-39 μ m， 平均^ym ；利用傳統方法制備的間充質干細胞的細胞直徑介于20-61 μ m,平均35 μ m。
實施例5 間充質干細胞的小鼠注射試驗
將實施例4制備的兩種間充質干細胞分別靜脈注射到10只20-23克正常雌性 BALB/c小鼠中，注射量為1.5X106個細胞。注射本發明所制備的間充質干細胞的10只小鼠中僅有1只出現呼吸循環衰竭而死亡，而注射傳統方法制備的間充質干細胞的10只小鼠中全部出現呼吸循環衰竭而死亡。表明注射本發明所制備的間充質干細胞可減輕靜脈注射時微血管阻塞程度，減少注射不良反應，降低再生治療時的危險。
實施例6 利用PO代傳代培養制備間充質干細胞
吸盡培養基，將實施例1制備的PO代間充質干細胞用PBS洗滌1遍并吸盡棄去。培養瓶中加入anl TrypLE klect重組酶(Gibco公司，目錄號12563-011)覆蓋細胞生長面， 置于37°C培養箱內消化7-lOmin直至貼壁細胞自表面分離。將細胞懸液吸出置于50ml錐形底離心管，加入等體積MesenCult -ACF無血清培養基混勻，300 X g離心Smin去上清， 并與用:3ml PBS洗滌培養瓶1遍后的溶液混合，離心去上清，再次用PBS洗滌去上清后，用 MesenCult -ACF無血清培養基洗滌細胞懸液1遍。T-75cm2培養瓶提前1天包被貼壁基質，按3XIO3個/cm2細胞密度接種間充質干細胞，加入預溫至37°C的MesenCult -ACF 無血清培養基，此后每2天換液一次，直至梭形貼壁細胞匯聚度達到80%-85%,即得Pl代間充質干細胞。從Pl代傳至P2代可參照此方法。
實施例7 間充質干細胞活力檢測
采用實施例1的PO代間充質干細胞，分別采用本發明所述傳代培養方法和傳統傳代培養方法(采用豬胰酶消化分離細胞)，其他培養條件一致，將制備的下一代細胞采用0. 4%臺盼藍染色后鏡檢，即細胞懸液與等體積0. 4%臺盼藍混合后2分鐘后計數， 活細胞有折光性且不染色，死細胞染藍色，細胞活力=活細胞數+ (活細胞數+死細胞數)X100%。
結果顯示，利用本發明傳代培養方法制備的下一代間充質干細胞活力介于 94-96%，平均95% ；利用傳統傳代培養方法制備的下一代間充質干細胞活力介于88-94%， 平均90 %，本發明的細胞活力較傳統傳代方法高5 %左右。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種間充質干細胞的制備方法，其特征在于，將臍帶去除臍動脈和臍靜脈后切成小塊，用含有0. 1% IV型膠原酶的α MEM培養基以及完全培養基消化，然后將消化后得到的細胞懸液離心，去上清后洗滌，接著用完全培養基重懸，重懸后的懸液轉移至由貼壁基質包被過的培養瓶中培養，至出現梭形貼壁細胞時洗滌，并更換新的完全培養基繼續培養，培養后的梭形貼壁細胞即為間充質干細胞；所述完全培養基為含有15_25ng/ml FGF、15_25ng/ml PDGF、15_25ng/ml人白蛋白、 15-25ng/ml胰島素、15_25ng/ml硒酸鈉和15_25ng/ml鐵蛋白的α MEM培養基；所述含有 0.1% IV型膠原酶的α MEM培養基和完全培養基的體積比為4 1。
2.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，所述完全培養基為MesenCult-ACF無血清培養基。
3.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，所述貼壁基質為含有纖連蛋白的貼壁基質。
4.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述貼壁基質為MesenCult貼壁基質。
5.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，所述消化為在37°C、250rpm下消化2小時。
6.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，所述培養為在37°C、5%CO2濃度、95% 相對濕度下培養。
7.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，還包括傳代培養步驟，將權利要求1所述梭形貼壁細胞洗滌，然后用TrypLE Select重組酶消化至梭形貼壁細胞從貼壁基質上分離，將消化后得到的細胞懸液加入完全培養基離心去上清，與洗滌貼壁基質后的溶液混合離心去上清，再次洗滌去上清后用完全培養基重懸，將所得懸液接種于由貼壁基質包被過的培養瓶中，加入完全培養基培養，培養后的梭形貼壁細胞即為下一代間充質干細胞；所述完全培養基、貼壁基質、培養方法同權利要求1。
8.根據權利要求7所述制備方法，其特征在于，所述接種的細胞密度為3X IO3個/cm2。
9.權利要求1至8任意一項所述制備方法制備的間充質干細胞。
10.權利要求9所述間充質干細胞在制備再生治療制品中的應用。
全文摘要
本發明涉及細胞工程領域，公開了一種間充質干細胞及其制備方法和應用。該方法將臍帶去除臍動脈和臍靜脈后切成小塊，用含有0.1％IV型膠原酶的αMEM培養基以及完全培養基消化，然后將消化后得到的細胞懸液離心，去上清后洗滌，接著用完全培養基重懸，重懸后的懸液轉移至由貼壁基質包被過的培養瓶中培養，至出現梭形貼壁細胞時洗滌，并更換新的完全培養基繼續培養，培養后的梭形貼壁細胞即為間充質干細胞。本發明所述制備方法采用無血清無異種蛋白的培養基制備和用成分單一的重組酶傳代，所制備的間充質干細胞直徑較小且無致敏原，提高了細胞的活力，增加了患者再生治療的安全性。
文檔編號C12N5/0775GK102517251SQ20121000890
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者吳德沛, 孫愛寧, 陳廣華 申請人:蘇州大學附屬第一醫院