專利名稱：一種利用巢氏pcr鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定方法，具體的說是一種利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法。
背景技術(shù)：
小麥銹病俗稱“黃疸病”,是一類由銹菌引致的真菌病害。受害小麥在生長發(fā)育期主要表現(xiàn)在葉子或桿上，出現(xiàn)鮮黃色或紅褐色的粉泡狀病斑。顯微鏡下觀察時(shí)，可見病斑中為很多單細(xì)胞的夏孢子，稱夏孢子堆。它們是由侵入到小麥植株內(nèi)的菌絲體產(chǎn)生的。小麥銹病在整個(gè)生活史中，除了產(chǎn)生夏孢子外，還產(chǎn)生其他類型的孢子，最多的可產(chǎn)生5種孢子，但仍以夏孢子危害嚴(yán)重。夏孢子侵害和蔓延得很快，從侵入新植株到產(chǎn)生出新的夏孢子只需8 12天，造成小麥的嚴(yán)重減產(chǎn)。小麥銹病中度流行年份感病品種減產(chǎn)10 20%，大流行年份一般減產(chǎn)30%左右，特大流行年份減產(chǎn)高達(dá)50 60%，嚴(yán)重田塊甚至絕收。小麥銹病是氣傳病害，必須采取以種植抗病品種為主，藥劑防治和栽培措施為輔的綜合防治策略，才能有效地控制其為害。目前，主要以前兩種方法為主。這兩種防治方法均建立在對(duì)小麥銹病的種類已知的前提下，兩種銹病的防治策略不盡相同，如在對(duì)抗性品種的選擇上，抗條銹的品種不一定抗葉銹，反之亦然；在田間管理上與用藥品種上兩者也不一樣。若對(duì)小麥銹病的種類未知而盲目的采取方法進(jìn)行防治，輕則事倍功半，重則加重病害。因此，加強(qiáng)對(duì)小麥銹病種類的識(shí)別是十分必要的。傳統(tǒng)的小麥銹菌的鑒別方法是通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)病部位和發(fā)病癥狀，然后通過顯微鏡進(jìn)行孢子的觀察。傳統(tǒng)的鑒定方法在小麥銹菌的識(shí)別上有一定的普遍性，但由于小麥銹菌的外部病癥易受外界環(huán)境因素的影響，加上在小麥苗期葉銹與小麥苗期條銹初發(fā)期的癥狀區(qū)別不大，十分容易混淆。在基層較難通過傳統(tǒng)的鑒定方法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，這就給當(dāng)?shù)氐姆乐螏砹死щy。真菌的孢子壁相對(duì)要比真菌的菌絲的細(xì)胞壁厚，在孢子量很少的情況下很難通過直接研磨的方法破壞孢子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這就使得常規(guī)的DNA提取方法無法應(yīng)用到單孢子堆 DNA的提取。目前孢子DNA的提取方法主要是通過機(jī)械物理破壁或化學(xué)溶解破壁。機(jī)械物理破壁往往需要一定的設(shè)備和技術(shù)條件才能達(dá)到破壁的目的，如超聲波破碎儀等，這在當(dāng)前我國基層植保機(jī)構(gòu)尚無法全面配置。而化學(xué)溶解破壁則需要在前期加入化學(xué)物質(zhì)溶解孢子壁，所加的物質(zhì)多為乙酸乙脂等，破壁結(jié)束后需要對(duì)其中的DNA進(jìn)行回收純化，去除可能影響下一步PCR反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，且去除的完成度將會(huì)大大影響下一步的成功率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述問題的不足，提供一種利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，其鑒定方法操作簡單，鑒定結(jié)果迅速準(zhǔn)確，可以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。本發(fā)明涉及的試劑DNA凝膠回收試劑盒購買于碧云天生物技術(shù)研究所，該試劑盒中自配有成品的DNA純化結(jié)合液，洗滌液，洗脫液，DNA純化柱，收集管；本發(fā)明為解決上述問題所采用的技術(shù)方案是一種利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，其方法步驟為
步驟一、單孢子堆DNA模板的制備
1)單孢子堆獲取取干凈、無菌的培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿的皿底墊三層濾紙，加入無菌去離子水，使濾紙濕潤，將含有濾紙的培養(yǎng)皿放置在紫外燈下，消毒20分鐘，備用；
2)用20iiL的移液槍吸取5 ii L無菌去離子水，將去離子水打出在移液槍的槍頭頂端形成一個(gè)水球，然后用水球在染病的小麥葉片上蘸取一個(gè)單孢子堆，將含有單孢子堆的無菌去離子水注入無菌的0. 5mL PCR管I中，將0. 5mL PCR管I開口放入步驟I)中的培養(yǎng)皿中，備用；
3)含有單孢子堆的0.5mLPCR管I置于25°C條件下，培養(yǎng)24小時(shí)，使孢子萌發(fā)，后取出含有孢子的0. 5mL PCR管I，將其置于_20°C條件下，放置24小時(shí)，取出，在含有孢子的
0.5mL PCR管I內(nèi)加入IOii L的滅菌細(xì)石英砂，研磨均勻，得到勻漿液，備用；
步驟二、引物的設(shè)計(jì)及合成
設(shè)計(jì)并合成外引物ITS1-F、外引物ITS4-B及內(nèi)引物ITS1、內(nèi)引物ITS4，其外引物及內(nèi)引物的序列如下
ITSl-F :5’-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3’
ITS4-B :5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3’
ITSl :5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4 :5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
步驟三、利用外引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增
I)取2. Oii L的10倍緩沖液、0. L的dNTP、0. L的外引物ITS1-F.0. 5u L的外引物ITS4_B、0. 5 ii L的Taq聚合酶和16 y L的雙蒸水，混合均勻，形成PCR反應(yīng)液I，備用；
1)在含有勻漿液的0.5mL PCR管I內(nèi)加入20 ii L步驟I)中的PCR反應(yīng)液I，以轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘，渦旋混勻10分鐘，然后將PCR反應(yīng)液I甩至PCR管底部，混合均勻，形成混合液I，備用；
2)將含有混合液I的0.5mLPCR管I放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94 °C變性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共35次循環(huán)，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴(kuò)增產(chǎn)物I，備用；
步驟四、利用內(nèi)引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增
I)取2. 0 ii L的10倍緩沖液、0. 5 ii L的dNTP、0. 5 y L的內(nèi)引物ITSl、0. 5 y L的內(nèi)引物ITS4、0. 5 ii L的Taq聚合酶和16 y L的雙蒸水，混合均勻，形成PCR反應(yīng)液II，備用；
2)取第一次PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物I，將其分別稀釋為I倍PCR擴(kuò)增模板、1/10倍PCR 擴(kuò)增模板和1/100倍PCR擴(kuò)增模板，取3個(gè)0. 5 mLPCR管，在每個(gè)0. 5 mLPCR管內(nèi)分別加入三種不同稀釋倍數(shù)的PCR擴(kuò)增模板，每種PCR擴(kuò)增模板的加入量為I U L，然后分別在每個(gè)
0.5 mLPCR管內(nèi)加入24 ii L步驟I)中得到的PCR反應(yīng)液II，分別將3個(gè)0. 5mLPCR管以轉(zhuǎn)速為700轉(zhuǎn)/分鐘，混勻I分鐘，然后將PCR反應(yīng)液II甩至PCR管底部，混合均勻，分別形成混合液II -a、混合液II -b和混合液II -C，備用；
3)分別將含有混合液II-a、混合液II -b和混合液II -C的3個(gè)0. 5mLPCR管放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共重復(fù)35次，最后72°C再次延伸10分鐘，取出，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物II -a、擴(kuò)增產(chǎn)物II -b和擴(kuò)增產(chǎn)物II -C，備用；
步驟四、擴(kuò)增終產(chǎn)物的分離、鑒定
1)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物II_a、擴(kuò)增產(chǎn)物II -b和擴(kuò)增產(chǎn)物II -C進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)含有623bp目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，將含有623bp目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，取出，備用；
2)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化
取I. 5mLPCR管II并稱其重量，在紫外燈下將含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物放在已稱重的I. 5mLPCR管II中，稱取
I.5mLPCR管II的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物的重量，然后將
I.5mLPCR管II中含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物搗碎，按擴(kuò)增產(chǎn)物的克數(shù)加入相同毫升數(shù)的DNA 純化結(jié)合液，混合均勻，將I. 5mLPCR管II放置在50° C水浴中加熱至含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物完全融解，得到混合液III，將混合液III加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入700 u L的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘，后將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入500 u L的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5mLPCR管III中，后在DNA純化柱上加入40 y L洗脫液， 將I. 5mLPCR管III在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5mLPCR管中III中的液體，備用；
3)將步驟2)中回收、純化后的液體進(jìn)行測(cè)序，并在Genbank進(jìn)行比對(duì)，確定為小麥葉銹病原菌一小麥隱匿柄銹菌iPuccinia recondita)；
所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸,余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水。單孢子堆是由一個(gè)孢子(植物上的種子)萌發(fā)出的一小堆孢子，由真菌單個(gè)孢子萌發(fā)形成的孢子堆，在真菌遺傳育種上應(yīng)用較多。有益效果
本發(fā)明的利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，其制備方法簡單，操作簡便， 便于廣泛應(yīng)用，對(duì)于遺傳育種具有一定的應(yīng)用前景。本發(fā)明的利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，只需利用微量的單孢子堆進(jìn)行萌發(fā)，待伸出芽后采用冷凍加石英砂研磨的方法容易使DNA釋放出來，釋放DNA的方法簡單，避免以往提取DNA的復(fù)雜步驟，減少勞動(dòng)時(shí)間，降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的將巢氏PCR應(yīng)用到痕量葉銹孢子堆上，利用巢氏PCR擴(kuò)增分離葉銹孢子堆的DNA片段。真菌的孢子壁相對(duì)要比真菌的菌絲的細(xì)胞壁厚，在孢子量很少的情況下很難通過直接研磨的方法破壞孢子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這就使得常規(guī)的DNA提取方法無法應(yīng)用到單孢子堆 DNA的提取。目前孢子DNA的提取方法主要是通過機(jī)械物理破壁或化學(xué)溶解破壁。機(jī)械物理破壁往往需要一定的設(shè)備和技術(shù)條件才能達(dá)到破壁的目的，如超聲波破碎儀等，這在當(dāng)前我國基層植保機(jī)構(gòu)尚無法全面配置。而化學(xué)溶解破壁則需要在前期加入化學(xué)物質(zhì)溶解孢子壁，所加的物質(zhì)多為乙酸乙脂等，破壁結(jié)束后需要對(duì)其中的DNA進(jìn)行回收純化，去除可能影響下一步PCR反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，且去除的完成度將會(huì)大大影響下一步的成功率。而本發(fā)明的利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，是采用孢子萌發(fā)破壁，芽管壁的厚度與堅(jiān)韌度比孢子壁大為降低，加入石英砂充分研磨即可達(dá)到破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使DNA流出的目的。待石英砂沉淀后可吸取研磨液直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，縮短操作步驟，且不影響PCR擴(kuò)增。 該方法較目前常用的其他方法如酶解法和超聲波破壁法操作簡便、時(shí)間短、成本低、安全可
O一般的PCR方法擴(kuò)增采用一套PCR弓丨物對(duì)目標(biāo)進(jìn)行一輪擴(kuò)增，所需的目標(biāo)DNA濃度和純度必須達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)后才能使擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳時(shí)顯現(xiàn)出單一、明亮的條帶，且可能會(huì)有拖尾的現(xiàn)象產(chǎn)生。巢式PCR利用兩套PCR引物(巢式引物)對(duì)模板進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)擴(kuò)增。在第一次擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二次擴(kuò)增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性(因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的靶序列很少)增加了檢測(cè)的敏感性；又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)， 增加了檢測(cè)的可靠性。檢測(cè)精度達(dá)到了痕量的標(biāo)準(zhǔn)，且無需進(jìn)行擴(kuò)純，僅利用從田間小麥葉片上的獲得的單孢子堆就能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，省時(shí)省力，時(shí)間約為一周，能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，這大大的便利了田間小麥銹菌種類的快速、準(zhǔn)確的鑒定。


圖I為擴(kuò)增產(chǎn)物II的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
圖2為rDNAITS序列的小麥葉銹菌的系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖中Marker 自上而下分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp，檢測(cè)樣品為擴(kuò)增產(chǎn)物II的目的片段，其檢測(cè)片段為632bp ；
由BLAST pairwise alignments自動(dòng)生成的小麥葉銹菌的系統(tǒng)發(fā)育樹,黑色三角代表小麥葉銹菌的rDNA ITS序列。
具體實(shí)施例方式一種利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，其方法步驟為
步驟一、單孢子堆DNA模板的制備
1)單孢子堆獲取取干凈、無菌的培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿的皿底墊三層濾紙，加入無菌去離子水，使濾紙濕潤，將含有濾紙的培養(yǎng)皿放置在紫外燈下，消毒20分鐘，備用；
2)用20iiL的移液槍吸取5 ii L無菌去離子水，將去離子水打出在移液槍的槍頭頂端形成一個(gè)水球，然后用水球在染病的小麥葉片上蘸取一個(gè)單孢子堆，將含有單孢子堆的無菌去離子水注入無菌的0. 5mL PCR管I中，將0. 5mL PCR管I開口放入步驟I)中的培養(yǎng)皿中，備用；
3)含有單孢子堆的0. 5mLPCR管I置于25°C條件下，培養(yǎng)24小時(shí)，使孢子萌發(fā)，后取出含有孢子的0. 5mL PCR管I，將其置于_20°C條件下，放置24小時(shí)，取出，在含有孢子的
0.5mL PCR管I內(nèi)加入IOii L的滅菌細(xì)石英砂，研磨均勻，得到勻漿液，備用；
步驟二、引物的設(shè)計(jì)及合成
設(shè)計(jì)并合成外引物ITS1-F、外引物ITS4-B及內(nèi)引物ITS1、內(nèi)引物ITS4，其外引物及內(nèi)引物的序列如下
ITSl-F :5’-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3’
ITS4-B :5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3’
ITSl :5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4 :5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
步驟三、利用外引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增
I)取2. Oii L的10倍緩沖液、0. L的dNTP、0. L的外引物ITS1-F.0. 5u L的外引物ITS4_B、0. 5 ii L的Taq聚合酶和16 y L的雙蒸水，混合均勻，形成PCR反應(yīng)液I，備用；
1)在含有勻漿液的0.5mL PCR管I內(nèi)加入20 ii L步驟I)中的PCR反應(yīng)液I，以轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘，渦旋混勻10分鐘，然后將PCR反應(yīng)液I甩至PCR管底部，混合均勻，形成混合液I，備用；
2)將含有混合液I的0.5mLPCR管I放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94 °C變性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共35次循環(huán)，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴(kuò)增產(chǎn)物I，備用；
步驟四、利用內(nèi)引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增
I)取2. 0 ii L的10倍緩沖液、0. 5 ii L的dNTP、0. 5 y L的內(nèi)引物ITSl、0. 5 y L的內(nèi)引物ITS4、0. 5 ii L的Taq聚合酶和16 y L的雙蒸水，混合均勻，形成PCR反應(yīng)液II，備用；
2)取第一次PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物I，將其分別稀釋為I倍PCR擴(kuò)增模板、1/10倍PCR 擴(kuò)增模板和1/100倍PCR擴(kuò)增模板，取3個(gè)0. 5 mLPCR管，在每個(gè)0. 5 mLPCR管內(nèi)分別加入三種不同稀釋倍數(shù)的PCR擴(kuò)增模板，每種PCR擴(kuò)增模板的加入量為I U L，然后分別在每個(gè)
0.5 mLPCR管內(nèi)加入24 ii L步驟I)中得到的PCR反應(yīng)液II，分別將3個(gè)0. 5mLPCR管以轉(zhuǎn)速為700轉(zhuǎn)/分鐘，混勻I分鐘，然后將PCR反應(yīng)液II甩至PCR管底部，混合均勻，分別形成混合液II -a、混合液II -b和混合液II -C，備用；
3)分別將含有混合液II-a、混合液II -b和混合液II -C的3個(gè)0. 5mLPCR管放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性40秒，59°C退火40 秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共重復(fù)35次，最后72°C再次延伸10分鐘，取出，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物II -a、擴(kuò)增產(chǎn)物II -b和擴(kuò)增產(chǎn)物II -C，備用；
步驟四、擴(kuò)增終產(chǎn)物的分離、鑒定
I)稱取0. 25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2 y L的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5 U L的擴(kuò)增產(chǎn)物II -a、擴(kuò)增產(chǎn)物II _b、擴(kuò)增產(chǎn)物II -C和 2 V- LDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker,打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳 30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)在點(diǎn)樣孔內(nèi)出現(xiàn)632bp的目的條帶，將含有 623bp目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，取出，備用；
2)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化
取I. 5mLPCR管II并稱其重量，在紫外燈下將含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物放在已稱重的I. 5mLPCR管II中，稱取
I.5mLPCR管II的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物的重量，然后將
I.5mLPCR管II中含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物搗碎，按擴(kuò)增產(chǎn)物的克數(shù)加入相同毫升數(shù)的DNA 純化結(jié)合液，混合均勻，將I. 5mLPCR管II放置在50° C水浴中加熱至含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物完全融解，得到混合液III，將混合液III加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入700 u L的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘，后將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入500 u L的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5mLPCR管III中，后在DNA純化柱上加入40 y L洗脫液， 將I. 5mLPCR管III在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5mLPCR管中III中的液體，備用；
3)將步驟2)中回收、純化后的液體進(jìn)行測(cè)序，后將測(cè)出的DNA序列在基因庫Genbank 進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，本發(fā)明測(cè)出的三個(gè)液體序列均與DNA序列數(shù)據(jù)庫中登錄編號(hào)為DQ460724. I的序列具有同源性，且同源性為99%，在BLAST系統(tǒng)發(fā)育樹上觀察到小麥銹病單孢子堆菌株為擔(dān)子菌亞門柄銹菌屬小麥隱匿柄銹菌的遺傳分支，根據(jù)rDNA的ITS區(qū)序列的一般分析準(zhǔn)則，本發(fā)明中分離檢測(cè)的孢子堆為小麥葉銹病原菌一小麥隱匿柄銹菌 {Puccinia recondi ta )；
所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸,余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水。在本發(fā)明中圖2為rDNAITS序列的小麥葉銹菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，由BLAST pairwise alignments自動(dòng)生成的小麥葉銹菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，黑色三角代表小麥葉銹菌的rDNA ITS 序列。
權(quán)利要求
1.利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，其特征在于其方法步驟為1)單孢子堆獲取取干凈、無菌的培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿的皿底墊三層濾紙，加入無菌去離子水，使濾紙濕潤，將含有濾紙的培養(yǎng)皿放置在紫外燈下，消毒20分鐘，備用；2)用20μ L的移液槍吸取5μ L無菌去離子水，將去離子水打出在移液槍的槍頭頂端形成一個(gè)水球，然后用水球在染病的小麥葉片上蘸取一個(gè)單孢子堆，將含有單孢子堆的無菌去離子水注入無菌的O. 5mL PCR管I中，將O. 5mL PCR管I開口放入步驟I)中的培養(yǎng)皿中，備用；3)含有單孢子堆的O.5mLPCR管I置于25°C條件下，培養(yǎng)24小時(shí)，使孢子萌發(fā)，后取出含有孢子的O. 5mL PCR管I，將其置于_20°C條件下，放置24小時(shí)，取出，在含有孢子的O.5mL PCR管I內(nèi)加入10 μ L的滅菌細(xì)石英砂，研磨均勻，得到勻漿液，備用；步驟二、引物的設(shè)計(jì)及合成設(shè)計(jì)并合成外引物ITS1-F、外引物ITS4-B及內(nèi)引物ITS1、內(nèi)引物ITS4，其外引物及內(nèi)引物的序列如下ITSl-F :5’-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3’ITS4-B :5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3’ITSl :5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS4 :5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’步驟三、利用外引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增I)取2· 0μ L的10倍緩沖液、O. 5μ L的dNTP、0. 5μ L的外引物ITS1_F、0. 5μ L的外引物ITS4_B、0. 5 μ L的Taq聚合酶和16 μ L的雙蒸水，混合均勻，形成PCR反應(yīng)液I，備用；1)在含有勻漿液的O.5mL PCR管I內(nèi)加入20 μ L步驟I)中的PCR反應(yīng)液I，以轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘，渦旋混勻10分鐘，然后將PCR反應(yīng)液I甩至PCR管底部，混合均勻，形成混合液I，備用；2)將含有混合液I的O.5mLPCR管I放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94 °C變性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共35次循環(huán)，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴(kuò)增產(chǎn)物I，備用；步驟四、利用內(nèi)引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增I)取2· 0μ L的10倍緩沖液、O. 5μ L的dNTP、0. 5μ L的內(nèi)引物ITSU0. 5μ L的內(nèi)引物ITS4、0. 5 μ L的Taq聚合酶和16 μ L的雙蒸水，混合均勻，形成PCR反應(yīng)液II，備用；2)取第一次PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物I，將其分別稀釋為I倍PCR擴(kuò)增模板、1/10倍PCR 擴(kuò)增模板和1/100倍PCR擴(kuò)增模板，取3個(gè)O. 5 mLPCR管，在每個(gè)O. 5 mLPCR管內(nèi)分別加入三種不同稀釋倍數(shù)的PCR擴(kuò)增模板，每種PCR擴(kuò)增模板的加入量為I μ L，然后分別在每個(gè)O.5 mLPCR管內(nèi)加入24 μ L步驟I)中得到的PCR反應(yīng)液II，分別將3個(gè)O. 5mLPCR管以轉(zhuǎn)速為700轉(zhuǎn)/分鐘，混勻I分鐘，然后將PCR反應(yīng)液II甩至PCR管底部，混合均勻，分別形成混合液II -a、混合液II -b和混合液II -c，備用；3)分別將含有混合液II-a、混合液II -b和混合液II -C的3個(gè)O. 5mLPCR管放入基因擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性40秒，59°C退火40 秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環(huán)，共重復(fù)35次，最后72°C再次延伸10分鐘，取出，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物II -a、擴(kuò)增產(chǎn)物II -b和擴(kuò)增產(chǎn)物II -c，備用；步驟四、擴(kuò)增終產(chǎn)物的分離、鑒定1)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物II-a、擴(kuò)增產(chǎn)物II -b和擴(kuò)增產(chǎn)物II -C進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)含有623bp目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，將含有623bp目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，取出，備用；2)用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化取I. 5mLPCR管II并稱其重量，在紫外燈下將含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物放在已稱重的I. 5mLPCR管II中，稱取 I. 5mLPCR管II的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物的重量，然后將I.5mLPCR管II中含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物搗碎，按擴(kuò)增產(chǎn)物的克數(shù)加入相同毫升數(shù)的DNA 純化結(jié)合液，混合均勻，將I. 5mLPCR管II放置在50° C水浴中加熱至含有目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物完全融解，得到混合液III，將混合液III加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入700 μ L的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘，后將收集管放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，向DNA純化柱上加入500 μ L的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內(nèi)的液體，將DNA純化柱置于收集管內(nèi)，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5mLPCR管III中，后在DNA純化柱上加入40 μ L洗脫液， 將I. 5mLPCR管III在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5mLPCR管中III中的液體，備用；3)將步驟2)中回收、純化后的液體進(jìn)行測(cè)序，并在Genbank進(jìn)行比對(duì)，確定為小麥葉銹病原菌一小麥隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)；所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸,余量為水；所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的洗脫液的組成成份二胺四乙酸，余量為水。每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙
全文摘要
一種利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，包括引物設(shè)計(jì)及合成、單孢子堆DNA的提取、目的基因的擴(kuò)增及分離、對(duì)擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，后進(jìn)行測(cè)序，并在Genbank進(jìn)行比對(duì)，確定為小麥銹病單孢子堆。本發(fā)明利用巢氏PCR鑒定小麥葉銹病單孢子堆的方法，其鑒定方法操作簡單，鑒定結(jié)果迅速準(zhǔn)確，可以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102586427SQ20121000962
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者侯軍, 張建祥, 李艷梅, 林曉民, 蔡超 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)