專利名稱：一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，具體的說是一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法。
背景技術：
玉米是全世界總產量最高的糧食作物。玉米青枯病又稱玉米莖基腐病、基腐病，是世界玉米的主要病害之一。其危害非常大，相關資料報道，有些國家，由于玉米青枯病造成玉米產量的損失可達25— 33%，有的甚至高達50%以上。玉米青枯病是一種土傳病害。由于土壤環境比較復雜，在研究土傳病害，分離其病原菌時經常會受到多種因素的干擾，導致病原菌分離和鑒定的困難。在莖部的維管束病害中，當病害可為肉眼所見時，往往己到病害發展的中后期，不同的寄生菌和腐生菌己在發病部位大量繁殖，同樣很難通過分離的方法來確定病原菌。通過致病性測定雖然可以鑒別分離物的致病屬性，但由于根病和維管束病害所需發病周期長，環境條件不易控制，其它真菌的污染很難排除，因此也不易獲得準確的結論。以往在對玉米青枯病病原菌苗期致病性的報道，多集中在研究玉米根部的發病情況，使用土埋法進行檢測。由于復雜的土壤環境，再加上清洗根時容易對根部造成損傷，易導致統計上的誤差，造成結果不準確，而郭-麥二氏法檢測復雜，同時測定結果易不準確。

發明內容
本發明針對上述問題的不足，提供一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其制備方法簡單，操作簡便，檢測結果準確。本發明涉及的試劑DNA凝膠回收試劑盒購買于碧云天生物技術研究所，該試劑盒中自配有成品的DNA純化結合液，洗滌液，洗脫液，DNA純化柱，收集管；
本發明中所涉及的玉米青枯病原鐮刀菌為一般市售產品，均可由保藏中心或生物公司購買得到；
本發明為解決上述問題所采用的技術方案是一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，所述的檢測方法為
步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備
1)在IOOOmL水中加入17g瓊脂,加熱使瓊脂溶解,后加入I.5g的硝酸鈣、I. 5g的硝酸鉀、Ig的磷酸二氫銨和0. 5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶 IOOmL,丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內， 在壓強為0. 14MPa，溫度為121°C，滅菌30分鐘，制得營養瓊脂培養基，備用；
2)在無菌條件下，將步驟I)中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入IOOmL的去離子水，然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為0. 5-0. 8cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養基，備用；
步驟二、玉米苗培養按重量分數比取I份粒徑為0. 8mm的玉米和2份濃度為0. 1%的汞，將玉米在汞中浸泡 10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中，后在培養容器內加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養容器送入25°C的培養箱內，培養3-4天待玉米發芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中， 250C _30°C條件下，見光培養，備用；
步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種
1)在IOOmL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮20-30分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至IOOmL止，制得馬鈴薯液體培養基，備用；
2)在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25°C條件下，發酵培養培養4-6天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌160-200分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態，后繼續培養24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；
3)玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至4-5片葉子時止，在無菌條件下，向培養玉米的三角瓶內加入5-6mL步驟2)中得到的鐮刀菌接種菌液，25-30°C條件下，見光培養10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；
步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測
1)取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內加入取Ig感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0. 5mL的TE溶液、0. 5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；
2)將步驟I)中得到的物料全部轉入5mL離心管內，在65°C條件下放置10分鐘，后加入 600 ii L濃度為7. 5mol/L的乙酸銨溶液，置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，將含有物料的 5mL離心管送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液I，在I. 5mL 離心管a內加入500 u L的上清液I、50 ii L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的1.5mL離心管a置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，后將含有混合液I的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為13000轉/分鐘，離心10 分鐘，得到I. 5mL離心管a底部的沉淀，備用；
3)在含有沉淀的I.5mL離心管a內加入200 y L的TE溶液，將沉淀溶解，后加入5 y L 的RNase酶，混合均勻，后置于65°C條件下，放置10分鐘，再加入200 u L的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液II，將含有形成混合液II的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，在I. 5mL離心管b中加入500 u L的上清液 IK50 u L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇,混合均勻，形成混合液III,將含有混合液III的I. 5mL離心管b送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀， 備用;
4)用濃度為70%的乙醇對步驟3)中I.5mL離心管b內的沉淀洗滌I次，待乙醇揮發完畢后，在I. 5mL離心管b內加入25 ii L的TE溶液，混合均勻，形成DNA模板，備用；
5)真菌ITS通用引物
上游引物5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '下游引物5 z -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
6)在0.5ml離心管I內加入2 ii L步驟一中得到的DNA模板、4. 0 y L的10倍緩沖液、 I U L的dNTP、I u L的上游引物、I U L的下游引物、I U L的Taq聚合酶和40. 0 ii L的去離子水，混合均勻，得到混合液IV，備用；
7)將含有混合液IV的0.5ml離心管I放入基因擴增儀中，進行PCR擴增，PCR擴增程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環，共35次循環，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴增產物，備用；
8)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在凝膠成像系統中確認擴增產物中含有551bp 的目的條帶，備用；
9)用DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化
取I. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將擴增產物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的擴增產物放在已稱重的I. 5ml離心管c中，稱取I. 5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的擴增產物的重量，然后將I. 5ml離心管c中的擴增產物搗碎，按擴增產物的克數加入相同毫升數的DNA純化結合液，混合均勻，將I. 5ml離心管c放置在50°C水浴中加熱至擴增產物完全融解，得到混合液V，將混合液V加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘,離心I分鐘后,取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加 A 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘， 后將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA 純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，將DNA純化柱置于收集管內，然后將收集管放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將I. 5ml離心管d在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5ml離心管中d中的液體，備用；
10)將步驟9)中回收、純化后的液體進行測序，并在Genbank進行比對，確定為玉米青枯病原鐮刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原鐮刀菌；
所述的DNA純化結合液的組成成份每升DNA純化結合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸,余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的SDS裂解液的組成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羥甲基氨基甲烷和 IOg的十_■燒基硫酸納，余量為水；
所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有24份的氯仿和I份的戊醇；
所述的TE溶液的組成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水。有益效果
本發明的一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，舍棄了傳統的從土壤中檢測玉米青枯病病原菌致病性的方法，而制備水-瓊脂混合培養基，避免因土壤環境的變化，從而影響檢測結果，同時縮短病原菌致病性檢測的時間。本發明的檢測方法簡單， 便于操作，節約生產成本，結果準確。


圖I為擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
圖2為rDNAITS序列的玉米青枯病原鐮刀菌的系統發育樹；
圖中Marker 自上而下分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp，檢測樣品為擴增產物的目的片段，其檢測片段為551bp ；
由BLAST pairwise alignments自動生成的玉米青枯病原鐮刀菌的系統發育樹,紅色三角代表玉米青枯病原鐮刀菌的rDNA ITS序列。
具體實施例方式一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其檢測方法為
步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備
1)在IOOOmL水中加入17g瓊脂,加熱使瓊脂溶解,后加入I.5g的硝酸鈣、I. 5g的硝酸鉀、Ig的磷酸二氫銨和0. 5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶 IOOmL,丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內， 在壓強為0. 14MPa，溫度為121°C，滅菌30分鐘，制得營養瓊脂培養基，備用；
2)在無菌條件下，將步驟I)中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入IOOmL的去離子水，然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為0. 5-0. 8cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養基，備用；
步驟二、玉米苗培養
按重量分數比取I份粒徑為0. 8mm的玉米和2份濃度為0. 1%的汞，將玉米在汞中浸泡 10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中，后在培養容器內加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養容器送入25°C的培養箱內，培養3-4天待玉米發芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中， 250C _30°C條件下，見光培養，備用；
步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種
1)在IOOmL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮20-30分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至IOOmL止，制得馬鈴薯液體培養基，備用；
2)在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25°C條件下，發酵培養培養4-6天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌160-200分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態，后繼續培養24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；
3)玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至4-5片葉子時止，在無菌條件下，向培養玉米的三角瓶內加入5-6mL步驟2)中得到的鐮刀菌接種菌液，25-30°C條件下，見光培養10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；
步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測
1)取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內加入取Ig感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0. 5mL的TE溶液、0. 5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；
2)將步驟I)中得到的物料全部轉入5mL離心管內，在65°C條件下放置10分鐘，后加入 600 ii L濃度為7. 5mol/L的乙酸銨溶液，置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，將含有物料的 5mL離心管送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液I，在I. 5mL 離心管a內加入500 u L的上清液I、50 ii L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的I. 5mL離心管a置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，后將含有混合液I的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為13000轉/分鐘，離心10 分鐘，得到I. 5mL離心管a底部的沉淀，備用；
3)在含有沉淀的I.5mL離心管a內加入200 y L的TE溶液，將沉淀溶解，后加入5 u L 的RNase酶，混合均勻，后置于65°C條件下，放置10分鐘，再加入200 u L的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液II，將含有形成混合液II的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，在I. 5mL離心管b中加入500 u L的上清液 IK50 u L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇,混合均勻，形成混合液III,將含有混合液III的I. 5mL離心管b送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀， 備用;
4)用濃度為70%的乙醇對步驟3)中I.5mL離心管b內的沉淀洗滌I次，待乙醇揮發完畢后，在I. 5mL離心管b內加入25 ii L的TE溶液，混合均勻，形成DNA模板，備用；
5)真菌ITS通用引物
上游引物5 z -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ^
下游引物5 z -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ^
6)在0.5ml離心管I內加入2 ii L步驟一中得到的DNA模板、4. 0 y L的10倍緩沖液、 I U L的dNTP、I u L的上游引物、I U L的下游引物、I U L的Taq聚合酶和40. 0 ii L的去離子水，混合均勻，得到混合液IV，備用；
7)將含有混合液IV的0.5ml離心管I放入基因擴增儀中，進行PCR擴增，PCR擴增程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環，共35次循環，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴增產物，備用；
8)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在凝膠成像系統中確認擴增產物中含有551bp 的目的條帶，備用；
9)用DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化
取I. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將擴增產物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的擴增產物放在已稱重的I. 5ml離心管c中，稱取I. 5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的擴增產物的重量，然后將I. 5ml離心管c中的擴增產物搗碎，按擴增產物的克數加入相同毫升數的DNA純化結合液，混合均勻，將I. 5ml離心管c放置在50°C水浴中加熱至擴增產物完全融解，得到混合液V，將混合液V加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘,離心I分鐘后,取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加 A 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘， 后將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA 純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，將DNA純化柱置于收集管內，然后將收集管放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將I. 5ml離心管d在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5ml離心管中d中的液體，備用;
10)將步驟9)中回收、純化后的液體進行測序，并在Genbank進行比對，確定為玉米青枯病原鐮刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原鐮刀菌；
所述的DNA純化結合液的組成成份每升DNA純化結合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸,余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的SDS裂解液的組成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羥甲基氨基甲烷和 IOg的十_■燒基硫酸納，余量為水；
所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有24份的氯仿和I份的戊醇；
所述的TE溶液的組成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、 Immol的乙二胺四乙酸，余量為水。 實施例I
一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其檢測方法為
步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備
1)在IOOOmL水中加入17g瓊脂,加熱使瓊脂溶解,后加入I.5g的硝酸鈣、I. 5g的硝酸鉀、Ig的磷酸二氫銨和0. 5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶 IOOmL,丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內， 在壓強為0. 14MPa，溫度為121°C，滅菌30分鐘，制得營養瓊脂培養基，備用；
2)在無菌條件下，將步驟I)中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入IOOmL的去離子水，然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為0. 5cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養基，備用；
步驟二、玉米苗培養
按重量分數比取I份粒徑為0. 8mm的玉米和2份濃度為0. 1%的汞，將玉米在汞中浸泡10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中，后在培養容器內加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養容器送入25°C的培養箱內，培養3天待玉米發芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中， 25 °C條件下,見光培養,備用；
步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種
1)在IOOmL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮20分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至IOOmL止，制得馬鈴薯液體培養基， 備用;
2)在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25°C條件下，發酵培養培養4天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌160分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態，后繼續培養24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；
3)玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至4片葉子時止，在無菌條件下，向培養玉米的三角瓶內加入5mL步驟2)中得到的鐮刀菌接種菌液， 25°C條件下，見光培養10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；
步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測
1)取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內加入取Ig感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0. 5mL的TE溶液、0. 5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；
2)將步驟I)中得到的物料全部轉入5mL離心管內，在65°C條件下放置10分鐘，后加入 600 u L濃度為7. 5mol/L的乙酸銨溶液，置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，將含有物料的 5mL離心管送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液I，在I. 5mL 離心管a內加入500 u L的上清液I、50 ii L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的I. 5mL離心管a置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，后將含有混合液I的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為13000轉/分鐘，離心10 分鐘，得到I. 5mL離心管a底部的沉淀，備用；
3)在含有沉淀的I.5mL離心管a內加入200 y L的TE溶液，將沉淀溶解，后加入5 u L 的RNase酶，混合均勻，后置于65°C條件下，放置10分鐘，再加入200 u L的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液II，將含有形成混合液II的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，在I. 5mL離心管b中加入500 u L的上清液 IK50 u L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇,混合均勻，形成混合液III,將含有混合液III的I. 5mL離心管b送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀， 備用;
4)用濃度為70%的乙醇對步驟3)中I.5mL離心管b內的沉淀洗滌I次，待乙醇揮發完畢后，在I. 5mL離心管b內加入25 ii L的TE溶液，混合均勻，形成DNA模板，備用；
5)真菌ITS通用
上游引物5 z -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ^
下游引物5 z -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ^
6)在0.5ml離心管I內加入2 ii L步驟一中得到的DNA模板、4. 0 y L的10倍緩沖液、I U L的dNTP、I u L的上游引物、I U L的下游引物、I U L的Taq聚合酶和40. 0 ii L的去離子水，混合均勻，得到混合液IV，備用；
7)將含有混合液IV的0.5ml離心管I放入基因擴增儀中，進行PCR擴增，PCR擴增程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環，共35次循環，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴增產物，備用；
8)稱取0.25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點樣孔中分別加入5微升的擴增產物和2微升DNA分子量標準Marker，打開電泳儀開關，在電泳儀電壓為100伏特時開始電泳，電泳30分鐘后關閉電泳儀，在凝膠成像系統中觀察到551bp的條帶時，備用；
9)用DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化
取I. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將擴增產物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的擴增產物放在已稱重的I. 5ml離心管c中，稱取I. 5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的擴增產物的重量，然后將I. 5ml離心管c中的擴增產物搗碎，按擴增產物的克數加入相同毫升數的DNA純化結合液，混合均勻，將I. 5ml離心管c放置在50° C水浴中加熱至擴增產物完全融解，得到混合液V，將混合液V加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘,離心I分鐘后,取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加 A 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘， 后將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA 純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，將DNA純化柱置于收集管內，然后將收集管放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將I. 5ml離心管d在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5ml離心管中d中的液體，備用；
10)將步驟9)中回收、純化后的液體進行測序，后將測出的DNA序列在基因庫Genbank 進行BLAST比對，結果表明，本發明測出的液體序列與DNA序列數據庫中登錄編號為 EU151482. I、DQ102438. I和⑶966507. I的序列具有同源性，且同源性分別為99%、99%和 99%，在BLAST系統發育樹上觀察到玉米青枯病原鐮刀菌，登錄編號(EU151482. I)為赤霉屬菌，登錄編號(DQ102438. I)為角擔子菌屬菌，登錄編號(⑶966507. I)為凸臍蠕孢屬菌，根據rDNA的ITS區序列的一般分析準則，本發明中分離檢測的菌株為玉米青枯病原鐮刀菌， 即玉米上感染玉米青枯病原鐮刀菌。實施例2
一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其檢測方法為
步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備1)在IOOOmL水中加入17g瓊脂,加熱使瓊脂溶解,后加入I.5g的硝酸鈣、I. 5g的硝酸鉀、Ig的磷酸二氫銨和0. 5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶 IOOmL,丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內， 在壓強為0. 14MPa，溫度為121°C，滅菌30分鐘，制得營養瓊脂培養基，備用；
2)在無菌條件下，將步驟I)中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入IOOmL的去離子水，然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為0. 7cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養基，備用；
步驟二、玉米苗培養
按重量分數比取I份粒徑為0. 8mm的玉米和2份濃度為0. 1%的汞，將玉米在汞中浸泡10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中，后在培養容器內加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養容器送入25°C的培養箱內，培養3天待玉米發芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中， 28 °C條件下，見光培養，備用；
步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種
1)在IOOmL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮25分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至IOOmL止，制得馬鈴薯液體培養基， 備用;
2)在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25°C條件下，發酵培養培養5天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌180分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態，后繼續培養24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；
3)玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至5片葉子時止，在無菌條件下，向培養玉米的三角瓶內加入6mL步驟2)中得到的鐮刀菌接種菌液， 28°C條件下，見光培養10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；
步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測
1)取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內加入取Ig感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0. 5mL的TE溶液、0. 5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；
2)將步驟I)中得到的物料全部轉入5mL離心管內，在65°C條件下放置10分鐘，后加入 600 ii L濃度為7. 5mol/L的乙酸銨溶液，置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，將含有物料的 5mL離心管送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液I，在I. 5mL 離心管a內加入500 u L的上清液I、50 ii L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的I. 5mL離心管a置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，后將含有混合液I的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為13000轉/分鐘，離心10 分鐘，得到I. 5mL離心管a底部的沉淀，備用；
3)在含有沉淀的I.5mL離心管a內加入200 y L的TE溶液，將沉淀溶解，后加入5 u L 的RNase酶，混合均勻，后置于65°C條件下，放置10分鐘，再加入200 u L的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液II，將含有形成混合液II的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，在I. 5mL離心管b中加入500 u L的上清液IK50 u L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇,混合均勻，形成混合液III,將含有混合液III的I. 5mL離心管b送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀， 備用;
4)用濃度為70%的乙醇對步驟3)中I.5mL離心管b內的沉淀洗滌I次，待乙醇揮發完畢后，在I. 5mL離心管b內加入25 ii L的TE溶液，混合均勻，形成DNA模板，備用；
5)真菌ITS通用
上游引物5 z -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ^
下游引物5 z -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ^
6)在0.5ml離心管I內加入2 ii L步驟一中得到的DNA模板、4. 0 y L的10倍緩沖液、 I U L的dNTP、I u L的上游引物、I U L的下游引物、I U L的Taq聚合酶和40. 0 ii L的去離子水，混合均勻，得到混合液IV，備用；
7)將含有混合液IV的0.5ml離心管I放入基因擴增儀中，進行PCR擴增，PCR擴增程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環，共35次循環，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴增產物，備用；
8)稱取0.25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點樣孔中分別加入5微升的擴增產物和2微升DNA分子量標準Marker，打開電泳儀開關，在電泳儀電壓為100伏特時開始電泳，電泳30分鐘后關閉電泳儀，在凝膠成像系統中觀察到551bp的條帶時，備用；
9)用DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化
取I. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將擴增產物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的擴增產物放在已稱重的I. 5ml離心管c中，稱取I. 5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的擴增產物的重量，然后將I. 5ml離心管c中的擴增產物搗碎，按擴增產物的克數加入相同毫升數的DNA純化結合液，混合均勻，將I. 5ml離心管c放置在50° C水浴中加熱至擴增產物完全融解，得到混合液V，將混合液V加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘,離心I分鐘后,取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加 A 700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘， 后將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA 純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，將DNA純化柱置于收集管內，然后將收集管放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將I. 5ml離心管d在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5ml離心管中d中的液體，備用；
10)將步驟9)中回收、純化后的液體進行測序，后將測出的DNA序列在基因庫Genbank進行BLAST比對，結果表明，本發明測出的液體序列與DNA序列數據庫中登錄編號為 EU151482. I、DQ102438. I和⑶966507. I的序列具有同源性，且同源性分別為99%、99%和 99%，在BLAST系統發育樹上觀察到玉米青枯病原鐮刀菌，登錄編號(EU151482. I)為赤霉屬菌，登錄編號(DQ102438. I)為角擔子菌屬菌，登錄編號(⑶966507. I)為凸臍蠕孢屬菌，根據rDNA的ITS區序列的一般分析準則，本發明中分離檢測的菌株為玉米青枯病原鐮刀菌， 即玉米上感染玉米青枯病原鐮刀菌。 實施例2
一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其檢測方法為
步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備
1)在IOOOmL水中加入17g瓊脂,加熱使瓊脂溶解,后加入I.5g的硝酸鈣、I. 5g的硝酸鉀、Ig的磷酸二氫銨和0. 5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶 IOOmL,丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內， 在壓強為0. 14MPa，溫度為121°C，滅菌30分鐘，制得營養瓊脂培養基，備用；
2)在無菌條件下，將步驟I)中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入IOOmL的去離子水，然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為0. 8cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養基，備用；
步驟二、玉米苗培養
按重量分數比取I份粒徑為0. 8mm的玉米和2份濃度為0. 1%的汞，將玉米在汞中浸泡10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中，后在培養容器內加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養容器送入25°C的培養箱內，培養4天待玉米發芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中， 30°C條件下，見光培養，備用；
步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種
1)在IOOmL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮30分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至IOOmL止，制得馬鈴薯液體培養基， 備用;
2)在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25°C條件下，發酵培養培養6天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌200分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態，后繼續培養24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；
3)玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至5片葉子時止，在無菌條件下，向培養玉米的三角瓶內加入6mL步驟2)中得到的鐮刀菌接種菌液， 30°C條件下，見光培養10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；
步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測
1)取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內加入取Ig感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、0. 5mL的TE溶液、0. 5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；
2)將步驟I)中得到的物料全部轉入5mL離心管內，在65°C條件下放置10分鐘，后加入 600 ii L濃度為7. 5mol/L的乙酸銨溶液，置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，將含有物料的5mL離心管送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液I，在I. 5mL 離心管a內加入500 u L的上清液I、50 ii L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的1.5mL離心管a置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，后將含有混合液I的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為13000轉/分鐘，離心10 分鐘，得到I. 5mL離心管a底部的沉淀，備用；
3)在含有沉淀的I.5mL離心管a內加入200 y L的TE溶液，將沉淀溶解，后加入5 u L 的RNase酶，混合均勻，后置于65°C條件下，放置10分鐘，再加入200 u L的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液II，將含有形成混合液II的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，在I. 5mL離心管b中加入500 u L的上清液 IK50 u L濃度為3mol/L的NaAc和300 u L的異丙醇,混合均勻，形成混合液III,將含有混合液III的I. 5mL離心管b送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀， 備用;
4)用濃度為70%的乙醇對步驟3)中I.5mL離心管b內的沉淀洗滌I次，待乙醇揮發完畢后，在I. 5mL離心管b內加入25 ii L的TE溶液，混合均勻，形成DNA模板，備用；
5)真菌ITS通用
上游引物5 z -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ^
下游引物5 z -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ^
6)在0.5ml離心管I內加入2 ii L步驟一中得到的DNA模板、4. 0 y L的10倍緩沖液、 I U L的dNTP、I u L的上游引物、I U L的下游引物、I U L的Taq聚合酶和40. 0 ii L的去離子水，混合均勻，得到混合液IV，備用；
7)將含有混合液IV的0.5ml離心管I放入基因擴增儀中，進行PCR擴增，PCR擴增程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環，共35次循環，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴增產物，備用；
8)稱取0.25克瓊脂糖粉末加到含有25毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點樣孔中分別加入5微升的擴增產物和2微升DNA分子量標準Marker，打開電泳儀開關，在電泳儀電壓為100伏特時開始電泳，電泳30分鐘后關閉電泳儀，在凝膠成像系統中觀察到551bp的條帶時，備用；
9)用DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化
取I. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將擴增產物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的擴增產物放在已稱重的I. 5ml離心管c中，稱取I. 5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的擴增產物的重量，然后將I. 5ml離心管c中的擴增產物搗碎，按擴增產物的克數加入相同毫升數的DNA純化結合液，混合均勻，將I. 5ml離心管c放置在50° C水浴中加熱至擴增產物完全融解，得到混合液V，將混合液V加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘,離心I分鐘后,取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘，后將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA 純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，將DNA純化柱置于收集管內，然后將收集管放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將I. 5ml離心管d在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5ml離心管中d中的液體，備用；
10)將步驟9)中回收、純化后的液體進行測序，后將測出的DNA序列在基因庫Genbank 進行BLAST比對，結果表明，本發明測出的液體序列與DNA序列數據庫中登錄編號為 EU151482. I、DQ102438. I和⑶966507. I的序列具有同源性，且同源性分別為99%,99%和 99%，在BLAST系統發育樹上觀察到玉米青枯病原鐮刀菌，登錄編號(EU151482. I)為赤霉屬菌，登錄編號(DQ102438. I)為角擔子菌屬菌，登錄編號(⑶966507. I)為凸臍蠕孢屬菌，根據rDNA的ITS區序列的一般分析準則，本發明中分離檢測的菌株為玉米青枯病原鐮刀菌， 即玉米上感染玉米青枯病原鐮刀菌；
所述的DNA純化結合液的組成成份每升DNA純化結合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸,余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的SDS裂解液的組成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羥甲基氨基甲烷和 IOg的十_■燒基硫酸納，余量為水；
所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有24份的氯仿和I份的戊醇；
所述的TE溶液的組成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、 Immol的乙二胺四乙酸，余量為水。在本發明中圖2為rDNAITS序列的玉米青枯病原鐮刀菌的系統發育樹，由BLAST pairwise alignments自動生成的玉米青枯病原鐮刀菌的系統發育樹,紅色三角代表玉米青枯病原鐮刀菌的rDNA ITS序列。
權利要求
1.一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法為步驟一、水-瓊脂混合培養基的制備1)在IOOOmL水中加入17g瓊脂,加熱使瓊脂溶解,后加入I.5g的硝酸鈣、I. 5g的硝酸鉀、Ig的磷酸二氫銨和O. 5g的硫酸鎂，攪拌均勻，形成混合液，分裝于300mL三角瓶中，每瓶 IOOmL,丙烯膜封口，并留有排氣孔，然后將每一個含有混合液的三角瓶送入高壓滅菌鍋內， 在壓強為O. 14MPa，溫度為121°C，滅菌30分鐘，制得營養瓊脂培養基，備用；2)在無菌條件下，將步驟I)中每一個滅菌后的營養瓊脂培養基中加入IOOmL的去離子水，然后將營養瓊脂培養基攪碎至粒徑為O. 5-0. 8cm的顆粒時止，混合均勻，形成水-瓊脂混合培養基，備用；步驟二、玉米苗培養按重量分數比取I份粒徑為O. 8mm的玉米和2份濃度為O. 1%的汞，將玉米在汞中浸泡 10分鐘，取出，用去離子水洗滌3次，然后將洗滌后的玉米放到底層鋪有無菌濾紙的培養容器中，后在培養容器內加入無菌去離子水，去離子水的加入量淹沒濾紙時止，后將培養容器送入25°C的培養箱內，培養3-4天待玉米發芽后，將玉米芽移植到水-瓊脂混合培養基中， 250C _30°C條件下，見光培養，備用；步驟三、鐮刀菌接種菌液制備與接種1)在IOOmL的去離子水中加入20g的馬鈴薯片，煮20-30分鐘，過濾，得到濾液，后在濾液中加入2g的葡萄糖，混合均勻，然后用去離子水定容至IOOmL止，制得馬鈴薯液體培養基，備用；2)在無菌條件下，在馬鈴薯液體培養基中接入一個玉米青枯病原鐮刀菌種，送入搖床上，在25°C條件下，發酵培養培養4-6天，形成玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液，然后在玉米青枯病原鐮刀菌培養菌液中加入磁力攪拌器，轉速為150轉/分鐘，攪拌160-200分鐘，使整個菌液呈糊狀并能用玻璃吸管定量吸入狀態，后繼續培養24小時，形成鐮刀菌接種菌液，備用；3)玉米幼苗生長至丙烯膜處，在丙烯膜上開一個玉米生長口，待玉米生長至4-5片葉子時止，在無菌條件下，向培養玉米的三角瓶內加入5-6mL步驟2)中得到的鐮刀菌接種菌液，25-30°C條件下，見光培養10天，得到感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米，備用；步驟四、對感染玉米青枯病原鐮刀菌的玉米進行檢測O取直徑為2cm的感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部，洗凈，然后在研缽內加入取Ig感染玉米青枯病原鐮刀菌玉米的根部及莖部、O. 5mL的TE溶液、O. 5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均勻，得到物料，備用；2)將步驟I)中得到的物料全部轉入5mL離心管內，在65°C條件下放置10分鐘，后加入 600 μ L濃度為7. 5mol/L的乙酸銨溶液，置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，將含有物料的 5mL離心管送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液I，在I. 5mL 離心管a內加入500 μ L的上清液I、50 μ L濃度為3mol/L的NaAc和300 μ L的異丙醇，混合均勻，形成混合液I，將含有混合液I的I. 5mL離心管a置于0°C條件下，放置8分鐘，取出，后將含有混合液I的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為13000轉/分鐘，離心10 分鐘，得到I. 5mL離心管a底部的沉淀，備用；3)在含有沉淀的I.5mL離心管a內加入200 μ L的TE溶液，將沉淀溶解，后加入5 μ L 的RNase酶，混合均勻，后置于65°C條件下，放置10分鐘，再加入200 μ L的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，形成混合液II，將含有形成混合液II的I. 5mL離心管a送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心5分鐘，得到上清液，在I. 5mL離心管b中加入500 μ L的上清液II、50 μ L濃度為3mol/L的NaAc和300 μ L的異丙醇,混合均勻，形成混合液III,將含有混合液III的I. 5mL離心管b送入離心機內，以轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，得到沉淀， 備用;4)用濃度為70%的乙醇對步驟3)中I.5mL離心管b內的沉淀洗滌I次，待乙醇揮發完畢后，在I. 5mL離心管b內加入25 μ L的TE溶液，混合均勻，形成DNA模板，備用；5)真菌ITS通用引物上游引物5 ζ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ^下游引物5 ζ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ^6)在O.5ml離心管I內加入2 μ L步驟一中得到的DNA模板、4. O μ L的10倍緩沖液、 I μ L的dNTP、I μ L的上游引物、I μ L的下游引物、I μ L的Taq聚合酶和40. O μ L的去離子水，混合均勻，得到混合液IV，備用；7)將含有混合液IV的O.5ml離心管I放入基因擴增儀中，進行PCR擴增，PCR擴增程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸100秒，變性、退火和延伸為一次循環，共35次循環，后72°C再次延伸10分鐘，取出，得到擴增產物，備用；8)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在凝膠成像系統中確認擴增產物中含有551bp 的目的條帶，備用；9)用DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化取I. 5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將擴增產物從步驟I)中的凝膠上切下，將切下的擴增產物放在已稱重的I. 5ml離心管c中，稱取I. 5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的擴增產物的重量，然后將I. 5ml離心管c中的擴增產物搗碎，按擴增產物的克數加入相同毫升數的DNA純化結合液，混合均勻，將I. 5ml離心管c放置在50° C水浴中加熱至擴增產物完全融解，得到混合液V，將混合液V加到DNA純化柱上，DNA純化柱位于收集管中，收集管在21°C條件下放置I分鐘，將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘,離心I分鐘后,取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，后將收集管在21°C條件下放置I分鐘， 后將收集管放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA 純化柱，倒掉收集管內的液體，向DNA純化柱上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱置于收集管內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心I分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱，倒掉收集管內的液體，將DNA純化柱置于收集管內，然后將收集管放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱放置于I. 5ml離心管d中，后在DNA純化柱上加入40微升洗脫液，將I. 5ml離心管d在21°C條件下放置I分鐘，然后將收集管放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心I分鐘，取出DNA純化柱得到I. 5ml離心管中d中的液體，備用；10)將步驟9)中回收、純化后的液體進行測序，并在Genbank進行比對，確定為玉米青枯病原鐮刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原鐮刀菌；所述的DNA純化結合液的組成成份每升DNA純化結合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三輕甲基氨基甲燒-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸,余量為水；所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的洗脫液的組成成份每升洗脫液中含50mmol的三羥甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的SDS裂解液的組成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羥甲基氨基甲烷和 IOg的十_■燒基硫酸納，余量為水；所述的氯仿和異戊醇混合液的組成成分按體積比氯仿和異戊醇混合液中含有24份的氯仿和I份的戊醇；所述的TE溶液的組成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、 Immol的乙二胺四乙酸，余量為水。
全文摘要
一種玉米青枯病原鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其監測方法包括感染玉米青枯病源鐮刀菌玉米的制備、引物設計及合成、感染玉米青枯病源鐮刀菌玉米DNA的提取、目的基因的擴增及分離和擴增終產物的分離、進行測序鑒定，并在基因庫Genbank進行比對，確定為玉米上感染玉米青枯病源鐮刀菌，本發明一種玉米青枯病源鐮刀菌對玉米苗期致病性的檢測方法，其鑒定方法操作簡單，鑒定結果迅速準確，可以應用到實際生產中。
文檔編號C12Q1/68GK102586428SQ20121000963
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者侯軍, 張建祥, 張春奇, 林曉民, 韓文忠 申請人:河南科技大學