專利名稱：一種基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒性腦膜腦炎病原體的診斷，特別是一種針對造成病毒性腦膜腦炎的主要病原體，包括DNA病毒單純皰疹病毒I型HSV-I、II型HSV-II和Epstein-Barr病毒；RNA病毒EV71、柯薩奇病毒CA16、埃可病毒ECHO的診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
病毒性腦膜腦炎是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、抽搐、意識障礙和腦膜刺激癥狀等，可致中樞神經(jīng)系統(tǒng)局灶性損害。病毒性腦膜腦炎預(yù)后不佳，死 亡率高，常留有嚴(yán)重后遺癥。目前，病原體培養(yǎng)是感染疾病診斷的標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)際臨床工作中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體檢出十分困難，常常造成確診困難，誤診率和漏診率很高，而且該方法耗時(shí)、操作復(fù)雜；分子生物學(xué)中的PCR技術(shù)的應(yīng)用可以幫助臨床作出快速診斷，但因其靈敏度過高，容易出現(xiàn)假陽性；免疫學(xué)方法檢測病原體特異性相關(guān)抗體，也是常用的一種診斷手段，但其陽性率較低而且一次只能篩查一種病原體，不能為臨床提供有力依據(jù)。因此，尋找一種早期快速、靈敏特異、一次可篩查多種病原體(高通量)的實(shí)驗(yàn)診斷方法就突顯其重要性。近年來出現(xiàn)的高通量xMAP技術(shù)為我們解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原診斷帶來了希望。它的核心技術(shù)是在不同熒光編碼的微球共價(jià)耦聯(lián)寡核苷酸、抗原、抗體、酶、底物、配體或受體形成微球生物探針(包括寡核苷酸及蛋白生物探針)，之后將不同的微球混合，與待測樣品(如血清、腦脊液、PCR產(chǎn)物等)進(jìn)行反應(yīng)或雜交。待微球與樣品中抗原、抗體或核苷酸結(jié)合后，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報(bào)告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)。因此xMAP技術(shù)是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術(shù)平臺。該技術(shù)已成為一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究工具，也是最早通過美國食品與藥物管理局(FDA)認(rèn)證的可用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)已有檢測方法的不足，依靠xMAP技術(shù)平臺，實(shí)現(xiàn)快速，敏感特異，高通量檢測病毒性腦膜腦炎病原體，對診斷疾病具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下
一種基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒，包括下列部件
1)探針耦聯(lián)編碼微球A液，I管，內(nèi)裝6種不同微球分別耦聯(lián)六種病毒探針；
2)B液，I管，內(nèi)裝I. 5X氯化四甲銨(I. 5XTMAC);
3)C液，I管，內(nèi)裝IX氯化四甲銨(IXTMAC);
4)D 液，I 管，內(nèi)裝 I XTE，pH 8.0 ；
5)E液，I管，內(nèi)裝鏈酶親和素-藻紅蛋白(SA-PE)；
6)F液，引物，6管，分別裝有六種病毒特異性引物，其中下游引物5’末端經(jīng)biotin修
飾；7)陽性對照G液，6管，分別裝有六種病毒標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA陽性模板；
8)96孔濾模板，I張。
上述基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒，其六種病毒探針及引物是根據(jù)各自基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的，探針的5’末端用H2N-C12標(biāo)記，其DNA序列分別如下
探針序列(5’-3’ )
HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG引物序列(5’-3’ )
HSV-I 上游弓 I 物一GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotinHSV-II 上游引物一GTAAGCGCGGGCCAAAGGAT下游引物一TCAAACACGGAAGCCCGAAC - biotinEpstein-Barr :上游引物一CCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAG下游引物一AGCCAACCATAGACCCGCTTCCT - biotinEV71 :上游引物一 GAGCCCTCACTCATGCTCTAC下游引物一AGITGTGCCTTCAAGAGGGAG - biotinCA 16 :上游引物一 CCTACAGCTGCCAACACTGAA下游引物一ACCATCCGTGITCTGTGTACC - biotinECHO :上游引物一 CCAGGATGTCGATACCATTCATGAG下游引物一TCACCCCTTGCACATCAAAGITGAC - biotin。上述基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒的使用方法，按下列步驟進(jìn)行
(1)病毒基因組DNA或RNA提取，RNA需逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；
(2)設(shè)計(jì)五種病毒引物，下游引物5’末端用Biotin修飾，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括10XMulti Hotstart Buffer、超純 dNTP (2.5 mM each), DNAPo I ymerase、上游引物、下游引物、基因組DNA模板、UDG、dUTP、ddH20 ；
按下列條件擴(kuò)增
95° C 10 min 預(yù)變性，一94° C 30 sec 35 個(gè)循環(huán)一72° C 10 min —4° C 保存
57。C 90 sec 72。C 60 sec ；
(3)雜交檢測
I)準(zhǔn)備探針微球混合工作液用I. 5 X TMAC雜交液B液使探針微球A液的濃度稀釋為每種微球150個(gè)/ ii 1，震蕩混勻；
2分別向樣本管、陽性對照管、陰性對照管和空白管加入33 Ul探針微球混合工作液；
3)向各樣本管、陽性對照管和陰性對照管依次對應(yīng)加入5 u I已生物素化的PCR產(chǎn)物，空白管加入5iU ddH20，然后向各反應(yīng)管補(bǔ)加pH 8. O的TE buffer D液，使反應(yīng)總體積為50u I ；
4)將各反應(yīng)管置于PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件，95°C 5 min, 55° C 15 min ；
5)在第4步同時(shí)，用C液IXTMAC配制新鮮的31^/ml的SA-PE，震蕩混勻；
6)將第4步中的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入預(yù)濕的96孔濾模板孔內(nèi)，負(fù)壓真空抽濾除去上清，依次向每孔加入100 W 3Pg/ml的SA-PE，震蕩混勻，室溫避光孵育IOmin ;迅速將96孔濾模板轉(zhuǎn)移至LumineX200液相芯片檢測儀內(nèi)，設(shè)置雜交溫度后進(jìn)行檢測；檢測樣本的熒光信號值大于四倍陰性對照熒光信號值則為陽性，反之視為陰性。 本發(fā)明選擇6種常見病毒性腦膜腦炎病原體的特異性基因，從GenBank獲得保守基因序列，進(jìn)行序列比對，保證其特異性。應(yīng)用oligo6. 65設(shè)計(jì)特異性引物及寡核苷酸探針，通過生物信息學(xué)分析和試驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出針對六種病原體的6對特異性引物及相應(yīng)的探針。首先用5’-H2NC12標(biāo)記的寡核苷酸探針包被不同編碼微球作為反應(yīng)載體，然后將各種探針熒光微球混合，制作懸浮芯片，與單重或多重PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行雜交反應(yīng)，最后應(yīng)用Luminex200流式熒光微球檢測分析儀進(jìn)行定性和定量檢測。這種技術(shù)可以同時(shí)檢測六種病毒性腦膜腦炎病原體，而且可檢測到Pg級DNA含量，具有很高的特異性和靈敏性。本發(fā)明的病毒性腦膜腦炎診斷試劑盒是一種基于xMAP技術(shù)的液相芯片，它以病毒特異性寡核苷酸探針耦聯(lián)熒光編碼微球?yàn)榉磻?yīng)載體，與檢測樣本中的病毒基因組進(jìn)行雜交，通過Luminex200分析儀快速、特異、高通量地對病原體進(jìn)行檢測，因此優(yōu)于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)檢測方法，所以該試劑盒可大大提高病毒性腦膜腦炎的診斷效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于xMAP技術(shù)及液相芯片檢測方法對病原進(jìn)行檢測。運(yùn)用生物信息學(xué)知識和相關(guān)生物信息學(xué)知識軟件，對6種目標(biāo)病毒的核苷酸序列分別進(jìn)行同源性分析，設(shè)計(jì)引物和探針，通過PCR，分子雜交，再用Luminex200系統(tǒng)進(jìn)行檢測，從而確定樣本中所含病原體的種類。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例I
已知樣本中含有單純皰疹病毒I型HSV-I，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測，具體操作如下
1、提取樣本總DNA；
2、以步驟I中提取的樣本總DNA為模板，以HSV-I特異性生物素修飾PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)分別以G液中HSV-I病毒標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA和超純水作為陽性對照和陰性對照，弓丨物序列如下(5’-3’ )
上游引物一 GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA 下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotin
3、在PCR 管中加入下列物質(zhì)10XMulti Hotstart Buffer5 y I、超純 dNTP (2. 5 mMeach) 4 u I, DNA Polymerasel yl、上游引物 lyl、下游引物 I ul、基因組 DNA 模板 I ii I、UDG0. 5 ii I、dUTPO. 2 y I、ddH20 補(bǔ)至 50 yl。4、PCR過程條件為95。C 10 min ;94。C 30 sec,57° C 90 sec,72° C 60 sec,共35個(gè)循環(huán)；72° C10min;4° C保存。5、準(zhǔn)備探針微球混合工作液用I. 5 X TMAC雜交液B液使探針微球A液的濃度稀釋為每種微球150個(gè)/ul，震蕩混勻；六種編碼微球分別耦聯(lián)六種H2N-C12標(biāo)記病毒探針，序列如下(5’-3’ )
HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG
6、分別向樣本管、陽性對照管、陰性對照管和空白管加入33Ul探針微球混合工作液；
7、向各樣本管、陽性對照管和陰性對照管依次對應(yīng)加入5u I已生物素化的PCR產(chǎn)物，空白管加入5 ill ddH20，然后向各反應(yīng)管補(bǔ)加TE buffer (PH 8. 0) D液，使反應(yīng)總體積為50u I ；
8、將各反應(yīng)管置于PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件，95°C 5 min, 55° C 15 min ；
9、在第8步同時(shí)，用C液IXTMAC配制新鮮的SA-PE(3l^g/ml)，震蕩混勻；
10、將第8步中的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入預(yù)濕的96孔濾模板孔內(nèi)，負(fù)壓真空抽濾除去上清，依次向每孔加入IOOW SA-PE (31^/ml)，震蕩混勻，室溫避光孵育IOmin ；
11、迅速將96孔濾模板轉(zhuǎn)移至LumineX200液相芯片檢測儀內(nèi)，設(shè)置雜交溫度后進(jìn)行檢測。檢測樣本的熒光信號值大于四倍陰性對照信號值則為陽性，反之視為陰性；
12、用LumineX200液相芯片檢測儀分別讀取經(jīng)步驟10雜交后的6種微球上的熒光標(biāo)記的目標(biāo)基因與探針結(jié)合的產(chǎn)物的熒光檢測值，結(jié)果如下
I)空白管背景孔中，熒光檢測值為145。2) 陰性對照孔中，熒光檢測值為194. 3。3) 陽性對照孔中，熒光檢測值為8025. 3。4) 微球耦聯(lián)探針為HSV-I的熒光檢測值為7418. 3。5) 微球耦聯(lián)探針為HSV- II的熒光檢測值為205.8。6) 微球稱聯(lián)探針為Epstein-Barr病毒的突光檢測值為338. 3。7) 微球耦聯(lián)探針為EV71的熒光檢測值為253. 8。8) 微球耦聯(lián)探針為CA16的熒光檢測值為325. 8。9) 微球耦聯(lián)探針為ECHO的熒光檢測值為310. 3。微球耦聯(lián)探針中探針為HSV-II、Epstein-Barr, EV71、CA16和ECHO的雜交產(chǎn)物的熒光檢測值分別小于四倍的陰性對照的熒光檢測值，認(rèn)為樣本中不含有HSV- 11、Epstein-Barr, EV71、CA16和ECHO五種病毒。微球耦聯(lián)探針中探針為HSV- I的雜交產(chǎn)物的突光檢測值大于四倍的陰性對照的突光檢測值，認(rèn)為樣本中含有HSV- I病毒。實(shí)施例2
已知樣本中含有EV71病毒，因其為RNA病毒，所以在第一步中首先提取RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測，具體步驟如實(shí)施例I (2-12)。熒光檢測值的結(jié)果如下I) 空白管背景孔中，熒光檢測值為103。2) 陰性對照孔中，熒光檢測值為153. 5。3) 陽性對照孔中，熒光檢測值為5730. 5。4) 微球耦聯(lián)探針為HSV-I的熒光檢測值為168。5) 微球耦聯(lián)探針為HSV- II的熒光檢測值為273. 5。
6) 微球稱聯(lián)探針為Epstein-Barr病毒的突光檢測值為189。7) 微球耦聯(lián)探針為EV71的熒光檢測值為3970。8) 微球耦聯(lián)探針為CA16的熒光檢測值為359。9) 微球耦聯(lián)探針為ECHO的熒光檢測值為281. 5。微球耦聯(lián)探針中探針為HSV-I、HSV-II, Epstein-Barr, CA16和ECHO的雜交產(chǎn)物的熒光檢測值分別小于四倍的陰性對照的熒光檢測值，認(rèn)為樣本中不含有HSV-I、HSV-II、Epstein-Barr,CA16和ECHO五種病毒。微球耦聯(lián)探針中探針為EV71的雜交產(chǎn)物的熒光檢測值大于四倍的陰性對照的熒光檢測值，認(rèn)為樣本中含有EV71病毒。實(shí)施例3
I例未知病毒樣本按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測，具體操作如下
1、提取樣本總DNA和總RNA，后者反轉(zhuǎn)錄為cDNA；
2、以步驟I中獲得的DNA和cDNA為模板，以六種特異性生物素修飾PCR引物進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，同時(shí)以超純水作為陰性對照。3、在 PCR 管中加入下列物質(zhì)10XMulti Hotstart Buffer5 U I、超純 dNTP (2. 5 mM each) 4 U 1、DNA Polymerasel U I、上游引物Iy I、下游引物Iu I、基因組DNA模板
Iu l、cDNA 模板 Iii 1、UDG0. I, dUTPO. 2 u I、ddH20 補(bǔ)至 50 y I (其中 6 對引物同時(shí)加入
反應(yīng)體系)。其余步驟同實(shí)施例1，熒光檢測值的結(jié)果如表I。
表I 樣本檢測熒光值 HSV-I HSV-II Epstein-Barr EWl CAl 6 ECHO 樣本 236 198.5203180 176.5 7532
陰性對照 75 718066 82 63
空白背景 50 5263.553 61 59.5樣本經(jīng)過多重PCR，與6種特異的微球耦聯(lián)探針雜交后，應(yīng)用Luminex200流式熒光微球檢測分析儀對雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測。微球耦聯(lián)探針中探針為HSV-I , HSV-II,Epstein-Barr, EV71和CA16的雜交產(chǎn)物的熒光檢測值分別小于四倍的陰性對照的熒光檢測值，認(rèn)為樣本中不含有HSV-I、HSV- II、Epstein-Barr, EV71和CA16五種病毒。微球耦聯(lián)探針中探針為ECHO的雜交產(chǎn)物的熒光檢測值大于四倍的陰性對照的熒光檢測值，認(rèn)為樣本中含有ECHO病毒。
權(quán)利要求
1.一種基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒，其特征在于包括下列部件 (1)探針耦聯(lián)編碼微球A液，I管，內(nèi)裝6種不同微球分別耦聯(lián)六種病毒探針； (2)B液，I管，內(nèi)裝I. 5X氯化四甲銨； (3)C液，I管，內(nèi)裝IX氯化四甲銨； (4)0液，1管，內(nèi)裝1父丁￡，？118. O ； (5)E液，I管，內(nèi)裝鏈酶親和素-藻紅蛋白； (6)F液，引物，6管，分別裝有六種病毒特異性引物，其中下游引物5’末端經(jīng)biotin修飾； (7)陽性對照G液，6管，分別裝有六種病毒標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA陽性模板； (8)96孔濾模板，I張。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒，其特征在于六種病毒探針及引物是根據(jù)各自基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的，探針的5’末端用H2N-C12標(biāo)記，其DNA序列分別如下 探針序列(5’-3’ )HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG引物序列(5’-3’ )HSV-I 上游弓 I 物一GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotinHSV-II 上游引物一GTAAGCGCGGGCCAAAGGAT下游引物一TCAAACACGGAAGCCCGAAC - biotinEpstein-Barr :上游引物一CCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAG下游引物一AGCCAACCATAGACCCGCTTCCT - biotinEV71 :上游引物一 GAGCCCTCACTCATGCTCTAC下游引物一AGITGTGCCTTCAAGAGGGAG - biotinCA 16 :上游引物一 CCTACAGCTGCCAACACTGAA下游引物一ACCATCCGTGITCTGTGTACC - biotinECHO :上游引物一 CCAGGATGTCGATACCATTCATGAG下游引物一TCACCCCTTGCACATCAAAGITGAC - biotin。
3.權(quán)利要求I所述的基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒的使用方法，按下列步驟進(jìn)行 (1)病毒基因組DNA或RNA提取，RNA需逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； (2)設(shè)計(jì)五種病毒引物，下游引物5’末端用Biotin修飾，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括10XMulti Hotstart Buffer、超純 dNTP、DNA Polymerase、上游引物、下游引物、基因組DNA模板、UDG、dUTP、ddH20 ；按下列條件擴(kuò)增 95° C 10 min 預(yù)變性，一94° C 30 sec 35 個(gè)循環(huán)一72° C 10 min —4° C 保存 57。C 90 sec 72。C 60 sec ； (3)雜交檢測 A、準(zhǔn)備探針微球混合工作液用I.5 X TMAC雜交液B液使探針微球A液的濃度稀釋為每種微球150個(gè)/ ii 1，震蕩混勻； B、分別向樣本管、陽性對照管、陰性對照管和空白管加入33Ul探針微球混合工作液；C、向各樣本管、陽性對照管和陰性對照管依次對應(yīng)加入5u I已生物素化的PCR產(chǎn)物，空白管加入5iU ddH20，然后向各反應(yīng)管補(bǔ)加pH 8. (^ATE buffer D液，使反應(yīng)總體積為50u I ； D、將各反應(yīng)管置于PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件，95°C 5 min, 55° C 15 min ； E、在第4步同時(shí)，用C液IXTMAC配制新鮮的31^/ml的SA-PE，震蕩混勻； F、將第4步中的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入預(yù)濕的96孔濾模板孔內(nèi)，負(fù)壓真空抽濾除去上清，依次向每孔加入100 W 3Pg/ml的SA-PE，震蕩混勻，室溫避光孵育IOmin ;迅速將96孔濾模板轉(zhuǎn)移至LumineX200液相芯片檢測儀內(nèi)，設(shè)置雜交溫度后進(jìn)行檢測；檢測樣本的熒光信號值大于四倍陰性對照熒光信號值則為陽性，反之視為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于xMAP技術(shù)的快速診斷病毒性腦膜腦炎試劑盒，包括探針耦聯(lián)編碼微球、氯化四甲銨、TE、鏈酶親和素-藻紅蛋白及六種病毒特異性引物，其中下游引物5'末端經(jīng)biotin修飾、六種病毒標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA陽性模板和96孔濾模板。本發(fā)明的病毒性腦膜腦炎診斷試劑盒是一種基于xMAP技術(shù)的液相芯片，它以病毒特異性寡核苷酸探針耦聯(lián)熒光編碼微球?yàn)榉磻?yīng)載體，與檢測樣本中的病毒基因組進(jìn)行雜交，通過Luminex200分析儀快速、特異、高通量地對病原體進(jìn)行檢測，因此優(yōu)于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)檢測方法，該試劑盒可大大提高病毒性腦膜腦炎的診斷效率。
文檔編號C12R1/93GK102643928SQ20121001066
公開日2012年8月22日 申請日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者趙鋼 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)