專利名稱：一種高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法
技術領域：
本發明涉及一種具有絮凝和吸附功能的生物絮凝劑的制備方法，尤其是涉及一種通過高濃度發酵方式生產用于水質凈化處理的生物絮凝劑的方法，屬于生物工程領域。
背景技術：
目前，隨著工業的快速發展和人口的急劇增加，城鎮飲用地表水需求量和工業廢水、城市生活污水、養殖廢水排放量與日俱增。由于污水排放類型不斷上升，水中的污染物成分變得越來越復雜，因此對污水進行處理的難度也越來越大。如果處理不當，會對工農業生產和人類健康帶來嚴重威脅。利用絮凝劑對污染物絮凝處理是對水質進行凈化的有效手段。但是目前使用的化學絮凝劑容易造成對環境的二次污染，例如老年癡呆與現在廣泛使用的含鋁無機絮凝劑有關；有機高分子絮凝劑聚丙烯酰胺的單體是直接的致癌、致畸、致突變劑，并具有強烈的神經毒性。并且隨著化學絮凝劑用量的不斷增加，使生態環境更加惡化。因此，研究與開發高效生物絮凝劑已成為大勢所趨。國務院辦公廳2007年4月8日以國辦發〔2007〕23號發布的國家發改委《生物產業發展“十一五”規劃》中明確規定國家重點支持發展高性能的生物水處理絮凝劑、混凝劑等生物環保技術。微生物絮凝劑的研發符合國家發改委會令第9號公布的《產業結構調整指導目錄(2011年本)》第一類“鼓勵類”的第2章“水利”的第3條“城鄉供水水源工程”;第38章“環境保護與資源節約綜合利用”的第2條“海洋環境保護及科學開發”、第16 條“三廢處理用生物菌種和添加劑開發與生產”、第18條“重復用水技術應用”以及第22條 “新型水處理藥劑開發與生產”中的規定。微生物絮凝劑是由特殊代謝功能的微生物產生的具有絮凝和吸附作用的生物高分子。微生物絮凝劑最突出的特點是具有生物可降解性，它是一種高效、無毒，使用無二次污染的環境友好型水質凈化劑。微球菌DS16是由山東省醫藥生物技術研究中心分離并保存的一產生高效微生物多糖絮凝劑的菌株(黃俊，欒興社，王世立，等.響應面法優化微球菌DS16產絮凝劑的條件.化工科技[J]，2009，17 (4) :17 22.)，該菌株屬于真細菌目微球菌科微球菌屬。在上述文章中，作者通過實驗證明對生物絮凝劑的產生來說，液糖與 (NH4)2SO4具有交互作，Mn2+的促進作用明顯，其絮凝活性達98%。但是該技術在實際應用中存在著產品濃度低(產品產量<0.76% (w/v))、生產效率低、操作繁瑣、成本高等不足， 限制了廣泛推廣與應用。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種產品濃度高、效率高、易于操作、成本低的實用產業化工藝。本發明的技術方案是一種高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法，其特征是，將微生物絮凝劑產生菌微球菌DS16通過生產菌種制備、發酵、發酵液預處理、產品提取生產高效微生物絮凝劑，具體包括以下步驟
(I)生產菌種的擴大培養①斜面培養基及斜面菌種培養斜面培養基牛肉膏3_6g/L，大豆蛋白胨8_12g/L，液糖7_12g/L，NaCl 3_6g/L， ρΗ7· 0-7. 2 ；將微球菌DS16接種于新鮮斜面，并在28_30°C保溫培養36h ； ②搖瓶培養基及搖瓶菌種培養搖瓶培養基液糖8-12g/L，大豆蛋白胨6-12g/L，酵母提取物O. 3-0. 8g/L，K2HPO4 3-8g/L, KH2P042-7g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3-0. 9g/L, pH7. 2 ；每300mL三角瓶裝液體搖瓶培養基70mL，每瓶接種斜面菌種一接種環，180r/min, 28-30°C保溫培養 8-12h ;③生產菌種培養基及生產菌種培養生產菌種培養基同搖瓶培養基；按2-5%的體積比接入搖瓶菌種進行通氣培養， 無菌空氣通風比I O. 35-0. 65 (V/V)，攪拌轉速為150-250r/min，27-30°c下培養9-15h，得生產菌種備用；培養完成后菌體形態均一，菌種生長光密度OD值凈增O. 5以上。⑵發酵①發酵培養基基礎發酵培養基液糖18-28g/L，尿素O. 4-0. 9g/L，(NH4) 2S04l_5g/L，大豆蛋白胨 O. 6-1. 2g/L, K2HP043-8g/L, NaH2P042_7g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. 028g/ L, MnCl2 · H2O 0. 035g/L, pH7. 2 ；補料發酵培養基液糖48_68g/L ;尿素I. 0-3. Og/L, pH7. 2 ；②接種及發酵(采用菌量優勢方式進行高濃度發酵)發酵罐A中裝入基礎發酵培養基，然后按體積比5-10%接入生產菌種進行攪拌通氣培養8-12h后，將培養液平均分裝到三臺發酵罐B中；然后分別在三臺發酵罐B中加入培養液體積2倍的補料發酵培養基，繼續培養22-30h ;所述發酵罐A的培養條件為無菌空氣通風比I O. 35-0. 75(V/V)，攪拌轉速為120-180r/min，溫度為22-32°C，罐壓為 O. 01-0. 03MPa ;所述發酵罐B控制的培養條件為:無菌空氣通風比I O. 25-0. 65(V/V)，攪拌轉速為 90-170r/min，溫度為 20_30°C，罐壓為 O. 01-0. 03MPa ；(3)發酵液預處理將發酵液升溫至65_80°C，維持10_20min，使菌體滅活并充分變性，然后趁熱以離心機離心去除菌體及其它雜質，得預處理發酵液備用；所述離心機轉速優選為6000-8000 轉/分；(4)產品提取與制成以氫氧化鈉溶液(其濃度優選為重量百分比為8-12% )調節預處理發酵液pH為
5.8-7. 5，在50-90r/min充分攪拌下加入I. 6-2. 6倍預處理發酵液體積的90% -95% (V/V) 乙醇，得沉淀；將沉淀用離心機離心，將所得固形物以90% -95% (V/V)的乙醇充分洗滌； 將含醇固形物用真空干燥器在真空度-O. 07Mpa，35-45°C下干燥至水分小于5%，用粉碎機粉碎。產品產量彡2.0% (w/v發酵液)，收率彡95%。本發明生產的微生物絮凝劑可廣泛地應用于城鎮飲用水原水、工業廢水、城市生活污水、養殖廢水、發酵工業分離純化、生物量回收等，添加量為O. l-10mg/L;使用時將其配成重量百分比千分之一的溶液，按需要量直接攪拌加入到需要處理的污染水體中進行絮凝和吸附。繼而通過沉淀分離工藝過程將污染物從水體中進行分離。本發明的技術效果是本發明制備微生物絮凝劑的方法具有工藝簡單，生產成本低(與現有發酵方式相比，耗用同等質量分數的碳源的條件下，產量提高了 33%，噸產品總能耗降低30% )，可進行大規模生產，發酵產量高和產品活性高(每克產品能夠從水中分離去除700克以上的污染物)等特點。產品理化與微生物指標達到了食品級要求(山東省食品質量監督檢驗站檢驗報告，W20040723015。檢驗結果說明樣品水分7. 5%，樣品鉛 < O. 511^/敁，砷< O. 3mg/Kg，大腸桿菌< 30個/100g，致病菌未檢出)。本發明的微生物絮凝劑與現有的化學產品相比具有無毒、無害(山東省疾病預防控制中心檢驗報告，魯疾控檢字2004D059。檢驗結果說明該樣品急性經口毒性實驗屬實際無毒；AmeS實驗結果為陰性；對小鼠骨髓嗜多染紅細胞無致微核作用)、可生物降解、具有去除有機無機物和重金屬的復合功能(加量3mg/L對黃河水(飲用水原水)進行絮凝和吸附處理，SS去除率>98%， COD去除率≥87%，鐵離子去除率≥99%，錳離子去除率≥98%;加量3mg/L對生活污水進行絮凝和吸附處理，COD去除率≥93 %，鐵離子去除率≥99 %，銅離子去除率≥95 % )、使用方便(直接應用于水質凈化，不需復雜的操作)、凈化速度快(5_30min固液分離)的優勢。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明進一步說明，本發明實施例中各培養基(斜面培養基、 搖瓶培養基、生產菌種培養基、發酵培養基、補料培養基)均經過O. IMpa高壓蒸汽滅菌， 121°C 下滅菌 20-30min。實施例1 :(1)生產菌種的擴大培養①斜面培養基及斜面菌種培養牛肉膏4g/L，大豆蛋白胨10g/L，液糖7g/L，NaCl 5g/L，pH7. 0-7. 2 ;將微球菌DS16接種于新鮮斜面，并在28_30°C保溫培養36h。②搖瓶培養基及搖瓶菌種培養液糖8g/L，大豆蛋白胨9g/L，酵母提取物O. 3g/ L，K2HP044g/L, KH2P043g/L, MgSO4 · 7H20 0. 4g/L，pH7. 2 ;每 300mL 三角瓶裝液體搖瓶培養基 70mL，每瓶接種斜面菌種一接種環，180r/min, 28_30°C保溫培養9h。③生產菌種培養基及生產菌種培養生產菌種培養基同搖瓶培養基；按2. 5%的體積比接入搖瓶菌種進行通氣培養，無菌空氣通風比I : 0.4(V/V)，攪拌轉速為180r/min， 27-30°C下培養10h，得生產菌種備用；培養完成后菌體形態均一，菌種生長光密度OD值凈增O. 5以上。(2)發酵①發酵培養基基礎發酵培養基各組分重量配比為(g/L):液糖20，尿素O. 4，(NH4) 2S042，大豆蛋白胨 I. 0，K2HP043，NaH2P043，MgSO4 ·7Η20 O. 2，FeS04 ·7Η20 O. 028，MnCl2 .H2O O. 035, ρΗ7. 2。補料發酵培養基各組分重量配比為(g/L):液糖50，尿素11，pH為7. 2。②接種及發酵等容積攪拌通氣發酵罐A—臺、發酵罐B三臺，裝料系數為75%。發明采用菌量優勢方式進行高濃度發酵將基礎發酵培養基分裝于發酵罐A中，然后按體積比5%接入的生產菌種進行攪拌通氣培養IOh后，將其中培養液平均分裝到三臺發酵罐B中，然后分別在三臺發酵罐B中補足裝料總體積2/3 (培養液體積的2倍)的滅菌補料發酵培養基進行繼續培養26h，直到發酵結束。所得發酵液進入預處理。罐A中的培養液分裝到發酵罐B中后即可開始下批培養。發酵罐A控制的培養條件為無菌空氣通風比I O. 45(V/V)，攪拌轉速為130r/min，29°C，罐壓為O. OlMPa;發酵罐B控制的培養條件為無菌空氣通風比I O. 35(V/V)，攪拌轉速為1101'/1^11，20-301，罐壓為0.0210^;(3)發酵液預處理將發酵液升溫至65°C，維持18min，使菌體滅活并充分變性，然后趁熱以離心機離心去除菌體及其它雜質，得預處理發酵液備用。(4)產品提取與制成用重量百分比為11%的NaOH溶液調節預處理發酵液pH為 6. 5，在55r/min充分攪拌下加入2. O倍體積的93% (V/V)乙醇，得沉淀，將沉淀用離心機離心5min，將所得固形物用8倍93% (V/V)乙醇充分洗滌，將含醇固形物用真空干燥器在真空度-O. 07Mpa, 43°C下干燥至水分小于5 %，用粉碎機粉碎成80目粉狀。產品產量彡2. 03 % (w/v)，收率> 95. 2%0實施例2 (I)生產菌種的擴大培養①斜面培養基及斜面菌種培養牛肉膏3. 5g/L，大豆蛋白胨9g/L，液糖8g/L，NaCl 4g/L, pH7. 0-7. 2 ;將微球菌DS16接種于新鮮斜面，并在28_30°C保溫培養36h。②搖瓶培養基及搖瓶菌種培養液糖9g/L，大豆蛋白胨8g/L，酵母提取物O. 4g/L， K2HP045g/L,KH2P042. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 35g/L,pH7. 2 ;每 300mL 三角瓶裝液體搖瓶培養基 70mL，每瓶接種斜面菌種一接種環，180r/min, 28_30°C保溫培養8_12h。③生產菌種培養基及生產菌種培養生產菌種培養基同搖瓶培養基；按3%的體積比接入發明的搖瓶菌種進行通氣培養，無菌空氣通風比I : 0.5(￥八)，攪拌轉速為1601·/ min, 27-30°C下培養9，得生產菌種備用；培養完成后菌體形態均一，菌種生長光密度OD值凈增O. 5以上。(2)發酵①發酵培養基基礎發酵培養基各組分重量配比為(g/L):液糖20，尿素O. 45，(NH4)2S041. 5，大豆蛋白胨 O. 8，Κ2ΗΡ043· 5，NaH2P042. 5，MgSO4 · 7H20 O. 15，FeSO4 · 7H20 0. 028，MnCl2 · H2O 0. 035，pH 為 7. 2。補料發酵培養基各組分重量配比為(g/L):液糖53，尿素I. 2，pH為7. 2。②接種及發酵等容積攪拌通氣發酵罐A—臺、發酵罐B三臺，裝料系數為75%。發明采用菌量優勢方式進行高濃度發酵發酵罐A中裝入基礎發酵培養基，然后按體積比6%接入生產菌種進行攪拌通氣培養IOh后，將其中培養液平均分裝到三臺發酵罐B中，然后分別在三臺發酵罐B中補足裝料總體積2/3的滅菌補料發酵培養基進行繼續培養27h，直到發酵結束。所得發酵液進入預處理。罐A中的培養液分裝到發酵罐B中后即可開始下批培養。發酵罐A控制的培養條件為無菌空氣通風比I : 0.48(V/V)，攪拌轉速為 130r/min，30°C，罐壓為O. OlMPa ;發酵罐B控制的培養條件為無菌空氣通風比I : O. 3 (V/ V)，攪拌轉速為 105r/min, 28°C，罐壓為 O. 02MPa ；
(3)發酵液預處理將發酵液升溫至70°C，維持15min，使菌體滅活并充分變性，然后趁熱以離心機離心去除菌體及其它雜質，得預處理液發酵備用。(4)產品提取與制成用重量百分比為9%的NaOH溶液調節預處理發酵液pH為 6. 8，在60r/min充分攪拌下加入I. 9倍體積的93% (V/V)乙醇，得沉淀，將沉淀用離心機離心4min，將所得固形物用7倍95% (V/V)乙醇充分洗滌，將含醇固形物用真空干燥器在真空度-O. 07Mpa，42°C下干燥至水分小于5%，用粉碎機粉碎成80目粉狀。產品產量彡2. 1% (w/v)，收率彡 95. 2%0實施例3 (I)生產菌種的擴大培養①斜面培養基及斜面菌種培養牛肉膏4. 2g/L，大豆蛋白胨8. 5g/L，液糖9g/L， NaC14. 5g/L，pH7. 0-72 ;將微球菌DS16接種于新鮮斜面，并在28_30°C保溫培養36h。②搖瓶培養基及搖瓶菌種培養液糖10g/L，大豆蛋白胨9. 5g/L，酵母提取物 O. 35g/L，Κ2ΗΡ045· 5g/L，KH2P042g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，pH7. 2 ;每 300mL 三角瓶裝液體搖瓶培養基70mL，每瓶接種斜面菌種一接種環，180r/min, 28_30°C保溫培養8_12h。③生產菌種培養基及生產菌種培養生產菌種培養基同搖瓶培養基；按3. 5%的體積比接入發明的搖瓶菌種進行通氣培養，無菌空氣通風比I : 0.55(V/V)，攪拌轉速為 180r/min, 27_30°C下培養9h,得生產菌種備用；培養完成后菌體形態均一，菌種生長光密度OD值凈增O. 5以上。(2)發酵①發酵培養基及制備基礎發酵培養基各組分重量配比為(g/L):液糖18，尿素O. 4，(NH4)2S041. 5，大豆蛋白胨 O. 65，Κ2ΗΡ043· 5，NaH2P042. 5，MgSO4 · 7H20 O. 15，FeSO4 · 7H20 0. 028，MnCl2 · H2O 0. 035，ρΗ7· 2。補料發酵培養基各組分重量配比為(g/L):液糖55，尿素I. 3，pH為7. 2。②接種及發酵等容積攪拌通氣發酵罐A—臺、發酵罐B三臺，裝料系數為75%。發明采用菌量優勢方式進行高濃度發酵發酵罐A中裝入基礎發酵培養基，然后按體積比8%接入生產菌種進行攪拌通氣培養9h后，將其中培養液平均分裝到三臺發酵罐 B中，然后分別在三臺發酵罐B中補足裝料總體積2/3的滅菌補料發酵培養基進行繼續培養 28h，直到發酵結束。所得發酵液進入預處理。罐A中的培養液分裝到發酵罐B中后即可開始下批培養。發酵罐A控制的培養條件為無菌空氣通風比I : O. 55(V/V)，攪拌轉速為130r/ min，30°C，罐壓為O. OlMPa;發酵罐B控制的培養條件為無菌空氣通風比I O. 35 (V/V), 攪拌轉速為100r/min，28°C，罐壓為O. 02MPa ；(3)發酵液預處理將發酵液升溫至75°C，維持13min，使菌體滅活并充分變性，然后趁熱以離心機離心去除菌體及其它雜質，得預處理發酵液備用。(4)產品提取與制成用重量百分比為10%的NaOH溶液調節預處理發酵液pH為
6.6，在70r/min充分攪拌下加入I. 8倍體積的95% (V/V)乙醇，得沉淀，將沉淀用離心機離心5min，將所得固形物用9倍90% (V/V)乙醇充分洗滌，將含醇固形物用真空干燥器在真空度-O. 07Mpa，42°C下干燥至水分小于5%，用粉碎機粉碎成80目粉狀。產品產量彡2. 17%(w/v)，收率> 95. 3%0
權利要求
1.一種高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法，其特征是，包括以下步驟(1)生產菌種的擴大培養①斜面培養基及斜面菌種培養斜面培養基牛肉膏3-6g/L，大豆蛋白胨8-12g/L，液糖7-12g/L，NaCl 3_6g/L， ρΗ7· 0-7. 2 ；將微球菌DS16接種于新鮮斜面，并于28-30°C下保溫培養36h ；②搖瓶培養基及搖瓶菌種培養搖瓶培養基液糖8-12g/L，大豆蛋白胨6-12g/L，酵母提取物O. 3-0. 8g/L，K2HP043_8g/ L, KH2P042-7g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3-0. 9g/L, pH7. 2 ；每300mL三角瓶裝液體搖瓶培養基70mL，每瓶接種斜面菌種一接種環，180r/min, 28-30°C保溫培養 8-12h ;③生產菌種培養基及生產菌種培養生產菌種培養基同搖瓶培養基；按2-5%的體積比接入搖瓶菌種進行通氣培養，無菌空氣通風比I O. 35-0. 65 (V/V)，攪拌轉速為150-250r/min，27-30°C下培養9-15h，得生產囷種備用；(2)發酵①發酵培養基基礎發酵培養基液糖18-28g/L，尿素O. 4-0. 9g/L，(NH4) 2S04l_5g/L，大豆蛋白胨 O. 6-1. 2g/L, K2HP043-8g/L, NaH2P042_7g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. 028g/ L, MnCl2 · H2O 0. 035g/L, pH7. 2 ；補料發酵培養基液糖48-68g/L ;尿素I. 0-3. Og/L, pH7. 2 ；②接種及發酵發酵罐A中裝入基礎發酵培養基，然后按體積比5-10%接入生產菌種進行攪拌通氣培養8-12h后，將培養液平均分裝到三臺發酵罐B中；然后分別在三臺發酵罐B中加入培養液體積2倍的補料發酵培養基，繼續培養22-30h ;所述發酵罐A的培養條件為無菌空氣通風比I O. 35-0. 75(V/V)，攪拌轉速為120-180r/min，溫度為22-32°C，罐壓為0.01-0. 03MPa ;所述發酵罐B控制的培養條件為:無菌空氣通風比I O. 25-0. 65(V/V)，攪拌轉速為 90-170r/min，溫度為 20_30°C，罐壓為 O. 01-0. 03MPa ；(3)發酵液預處理將發酵液升溫至65-80°C，維持10-20min，然后趁熱以離心機離心，得預處理發酵液備用；(4)產品提取與制成以氫氧化鈉溶液調節預處理發酵液PH為5. 8-7. 5，在50-90r/min充分攪拌下加入1.6-2. 6倍預處理發酵液體積的乙醇，得沉淀；將沉淀用離心機離心，將所得固形物以乙醇充分洗滌；將含醇固形物用真空干燥器干燥至水分小于5%，用粉碎機粉碎。
2.如權利要求I所述的一種高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法，其特征是，所述步驟(4)控制真空干燥器的真空度為-O. 07Mpa，溫度為35_45°C。
3.如權利要求I所述的一種高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法，其特征是，所述步驟(4)氫氧化鈉溶液的重量百分比為8-12%，所述乙醇濃度為90% -95% (V/V)。
4.如權利要求1-3中任意一項所述的一種高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法，其特征是，所述步驟(3)離心機轉速為6000-8000轉/分。
全文摘要
本發明公開了一種高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法，屬于生物工程領域。本發明選用微球菌DS16為生物絮凝劑的生產菌種，采用菌量優勢方式的高濃度發酵生產用于水質凈化的生物絮凝劑。制備過程包括生產菌種制備、發酵液制備、發酵液預處理、產品提取。制備的生物絮凝劑無毒、無害，具有生物可降解性，可安全、高效地應用于分離去除污染廢水中的重金屬和其它污染物質，使用無二次污染。本發明高濃度發酵制備生物絮凝劑的方法具有生產成本低，可進行大規模生產，發酵產量高(產量≥2.0％)和產品活性高(每克粉狀產品能夠從水中分離去除700克污染物)等特點。
文檔編號C12P1/06GK102586331SQ20121001080
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者欒興社 申請人:欒興社