專利名稱：一種產鳥氨酸的菌株及用該菌株生物合成鳥氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及能夠生產鳥氨酸的一種新微生物菌株及其培養發酵生產鳥氨酸或含有精氨酸酶的菌體，并將該菌體用于生物制備鳥氨酸的方法，屬于食品生物技術領域，廣泛應用于食品、化妝品、醫藥等行業。更具體的說本發明涉及來源于土壤的見/-Wii如《7ΛΛ5 pycnus (SK23. 002)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466，利用該菌株生物合成鳥氨酸 (ornithine)。
背景技術：
近年發現鳥氨酸可刺激腦垂體分泌成長激素，促進蛋白質合成及糖與脂肪之代謝(基礎代謝)，在結合運動情況下攝食鳥氨酸可減少體內脂肪堆積，增強肌肉和體力，起到減肥保健的作用，此外鳥氨酸還可促進腸道成長提高腸道免疫功能；L-鳥氨酸也是細胞成長因子聚胺合成之前體可能有助于美膚作用，在提高免疫功能和抗癌功能上也有一定作用。 L-鳥氨酸加在運動員保健品支鏈氨基酸中，還具有脫苦作用，所以鳥氨酸是一多功能的氨基酸，故成為關注的熱點。本發明所制的鳥氨酸具有以下特征。分子式=C5H12N2O2,分子量132. 19，熔點 140°C (細微結晶，120°C軟化)，溶解性易溶于水和乙醇，微溶于乙醚，其溶液呈堿性，易溶于水、乙醇，微溶于乙醚。通常作為試劑使用的是其單鹽，L-鳥氨酸單鹽易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚。在生物體內，鳥氨酸主要參與尿酸循環，對于體內氨態氮的排出有重要作用。鳥氨酸在醫藥上除作為試劑與注射液外，通常與精氨酸一起用于配置恢復疲勞的發泡飲料。近年來，鳥氨酸在食品工業和醫藥工業上的應用日益廣泛。目前鳥氨酸的生產主要有合成法、酶法和發酵法3種方法。合成法是早期研究鳥氨酸時的制備方法，其過程復雜，成本較高，D-鳥氨酸及L-鳥氨酸都有，不好分離，故已被淘汰。酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，生成L-鳥氨酸，此法產品純度高，但價格昂貴， 精氨酸及精氨酸酶均不易獲得，限于實驗室制備。發酵法生產的鳥氨酸，此法簡便易行，只要選擇合適的菌種，可以達到較高的產量，適用于工業化規模生產。所以，隨著鳥氨酸在食品工業和醫藥工業上的應用日益廣泛，對微生物發酵法生產鳥氨酸的研究就具有重大的理論意義和經濟意義。本發明人深入調查和研究了現有技術，并從土壤中篩出多株生產鳥氨酸的菌株進行了研究，最終篩選到一株能高產鳥氨酸的新微生物，優化后可達90%以上的轉化率，并通過分離純化以及濃縮干燥等手段得到較純的鳥氨酸。基于上述發現提出了本發明。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的微生物，它能夠高產鳥氨酸，且發酵過程中可不依賴精氨酸的誘導。其二，是提供一種該菌株生產鳥氨酸的方法，以得到高的轉化率。再者，是提供一種鳥氨酸分離純化與精制的方法，以得到高純度的鳥氨酸。為了實現上述目的，本發明提供一種來源于土壤的RwmeliibaciIlus pycnus(SK23-002)，保藏編號為 CCTCC NO :M 2010073。本發明的技術方案一株產鳥氨酸的菌株，其分類命名為Rmmeliibacillus pycnus (SK23-002)，是通過根據一定法則的菌類學性質、生物化學性質的分析和16sRNA序列的測定而得出。利用該微生物，發酵生產鳥氨酸的方法，步驟如下
(1)種子培養
種子培養基=L-Arg l-20g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L以及加或不加少量無機鹽等，調pH6. 0-7. 5 ；
種子培養條件=CCTCC NO =M 2011466菌株于30-37°C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養10-1 活化該菌株。(2)發酵培養
發酵培養基酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-100g/L，L-Arg l_20g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L以及加或不加少量無機鹽等，調pH6. 0-7. 5 ；
發酵條件接種量1%_10%，30-37°C、轉速100-500rpm的條件下在發酵培養基中發酵 5-72h。(3)發酵后處理
發酵液經冷凍離心后收集含鳥氨酸的發酵液及含精氨酸酶的濕菌體，并用0. 1%的生理鹽水和pH6. 0的0. lmol/L醋酸鹽緩沖液清洗菌體，得靜息細胞進行全細胞轉化反應，經檢測轉化率在80%以上。(4)全細胞轉化反應底物精氨酸濃度10_200g/L，靜息細胞量0. l_10g/L，此反應在pH4. 0-8. 0，30-70°C的條件下轉化反應時間5_40h，得到轉化后的反應液，
(5)鳥氨酸的分離純化
將含鳥氨酸的發酵液或轉化后的反應液經脫色后利用強酸性陽離子交換樹脂001 X 7， 氨水洗脫，進行鳥氨酸分離純化。本發明的有益效果本發明涉及一株從土壤中篩選而來的RimmeliibaciIlus pycnus (SK23-002)，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466，以此芽孢菌為出發酵菌株，以葡萄糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發酵培養基，發酵生產含有精氨酸酶的菌體，發酵所得菌體添加到5%-20%精氨酸溶液中轉化合成鳥氨酸，經檢測可知，轉化率可達80%以上， 而且此發酵過程可不依賴精氨酸誘導作用。本發明方法生產的鳥氨酸安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性產品，被廣泛的應用于食品、化妝品、醫藥等行業。該發明能高效地生產鳥氨酸，適于進行大規模生產。生物材料樣品保藏一種產鳥氨酸的菌株，其分類命名為(MmmelUbaciIlus pycnus) SK23. 002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466，保藏日期2011年12月12日。
具體實施例方式議飛良Rummeliibaci 1 Ius pycnus (SK23. 002)進行發酵生產鳥氨酸的實施例，但本發明的技術范圍并不限于所列出的幾個實例，在不改變其要點的前提下，可做各種改變進行實施。另外，本發明的技術范圍延及均等的范圍。實施例1 SK23. 002號菌株的發酵培養使用菌株SK23. 002，在含L-Arg 0. 5%、葡萄糖1%、酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，無機氮源 0. 1%以及含或不含少量無機鹽等，調pH6. 0的培養基中，37°C，190 rpm的條件下培養22h， 冷凍離心，制得具有精氨酸酶活的靜息細胞。實施例2轉化反應
使用實施例1所得菌體，在含精氨酸質量濃度為50g/L、靜息細胞量0. l-10g/L的 IOOmM醋酸緩沖液(HAc-NaAc、pH6. 0)中，在37°C下進行轉化反應5_40h，合成鳥氨酸。實施例3鳥氨酸產量的測定
將實施例2中進行的反應液經滅酶(TCA沉淀)、稀釋，通過安捷倫液相色譜儀，分別對精氨酸、鳥氨酸進行定量。分析條件如下儀器型號Agilent 1100，色譜柱(250*4.6)mm 5 μ m ODS HYPERSIL,柱溫40°C。實施例4新型鳥氨酸產生菌的鑒定
將新型鳥氨酸生產菌送往中國典型培養物保藏中心測定該菌的形態特征、生理生化特性以及16SrRNA基因序列分析，鑒定為TP-Wii^ciBm pycnus,是安全菌株。實施例5鳥氨酸的分離純化
將轉化所得的反應液經脫色后，利用強酸性陽離子交換樹脂001X7，用不同濃度的氨水進行洗脫，得到純化的鳥氨酸。
權利要求
1.一株產鳥氨酸的菌株，其分類命名為OP-WiihciB^S pycnus)^2 ,. 002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011466。
2.用權利要求1所述的CCTCCNO =M 2011466菌株發酵生產鳥氨酸的方法，其特征在于，經發酵生產鳥氨酸及通過發酵生產具有精氨酸酶活性的菌體細胞，然后進行全細胞轉化反應，合成鳥氨酸；步驟為(1)種子培養種子培養基=L-Arg l-20g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L,調ρΗ6· 0-7. 5，去離子水配制；種子培養條件=CCTCC NO =M 2011466菌株于30-37°C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養10-1 活化該菌株；(2)發酵培養發酵培養基酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-100g/L，L-Arg l_20g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L，調ρΗ6· 0-7. 5，去離子水配制；發酵條件接種量1%_10%，30-37°C、轉速100-500rpm的條件下在發酵培養基中發酵 5-72h ；(3)發酵后處理發酵液經冷凍離心后收集含鳥氨酸的發酵液及含精氨酸酶的濕菌體，并用0. 1%的生理鹽水和pH6. 0的0. lmol/L醋酸鹽緩沖液清洗菌體，得靜息細胞進行全細胞轉化反應，經檢測轉化率在80%以上；(4)全細胞轉化反應底物精氨酸濃度10-200g/L，靜息細胞量0.l-10g/L,此反應在 pH4. 0-8. 0，30-70°C的條件下轉化反應時間5_40h，得到轉化后的反應液，(5)鳥氨酸的分離純化將含鳥氨酸的發酵液或轉化后的反應液經脫色后利用強酸性陽離子交換樹脂001 X 7， 氨水洗脫，進行鳥氨酸分離純化。
全文摘要
一株產鳥氨酸的菌株及用該菌株生物合成鳥氨酸的方法，屬于食品生物技術領域。本發明涉及一株從土壤中篩選而來的Rummeliibacilluspycnus(SK23-002)，保藏編號為CCTCCNOM2011466，以此芽孢菌為發酵菌株，以葡萄糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發酵培養基，發酵生產鳥氨酸或含有精氨酸酶的菌體并將所得菌體添加到5%-20%精氨酸溶液中轉化合成鳥氨酸，經檢測可知，轉化率可達80%以上，而且此發酵過程可不依賴精氨酸誘導作用。本發明方法生產的鳥氨酸安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性產品，被廣泛的應用于食品、化妝品、醫藥等行業。該發明能高效地生產鳥氨酸，適于進行大規模生產。
文檔編號C12R1/01GK102433288SQ20121001202
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者張濤, 江波, 沐萬孟, 王瑩, 繆銘 申請人:江南大學