專利名稱：一株產瓜氨酸的菌株及用該菌株生物合成瓜氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及能夠生產瓜氨酸的一種從土壤篩出的微生物菌株廣 (Kurthia sp. nov J 浙J及其培養發酵生產瓜氨酸或發酵生產含有精氨酸酶的菌體并將該菌體用于生物制備瓜氨酸的方法，廣泛應用于食品、化妝品、醫藥等行業。屬于食品生物技術領域。
背景技術：
瓜氨酸具有提高免疫系統功能，維護關節運動的機能，平衡正常的血糖水平，含豐富的抗氧化劑吸收有害的自由基，幫助保持膽固醇的正常水平。它也可以使人的血管獲得松弛，用于增強男性性功能，以及治療性功能障礙。還可以維護建康的肺功能以及提高腦力清晰度，降低壓力和克服沮喪情緒，有幫助腦神經細胞具貯藏與調回訊息的功能。隨著生物技術和遺傳工程研究的迅速發展，生物化學制品市場也得到了持續增加，世界年銷售額高達幾十億美元。因此對很多生物制品如酶類，疫苗，抗體等的保存受到越來越多的重視。瓜氨酸清除羥基的功能得到了很好的利用，研究表明瓜氨酸對DNA和酶具有抗羥基保護。瓜氨酸作為抗氧化劑，可以用于化妝品，保健食品，食品添加劑以及營養強化劑，同時還可對厭氧物質提供保護。因此，人們對瓜氨酸越來越重視，并寄希望于開發出新型的功能食品和功能藥物。至今為止，瓜氨酸的制造方法，主要有四種。第一，是從植物中提取的方法。來自天然，但提取率和含量低。第二，化學有機合成茶氨酸的方法。該法可能會殘留毒性物質，安全性有待考量， 且生成物分離精制操作復雜。第三，利用微生物酶法進行生產。酶法生產瓜氨酸即采用Str^tococcus faecal is, Clostridium perfringens，Micrococcus pyogenes, Bacillus pyocyaneus ^^ 生物生產的精氨酸脫亞氨基酶，由精氨酸生產瓜氨酸。第四，發酵法進行生產。發酵法的優點是成本低，產量高，產物的純度高，在產品的生產過程中沒有有毒物質的產生，給產物后加工提供了方便，降低了成本，且適合大規模的生產。國外在瓜氨酸方面的研究較多，尤其是在日本、美國和歐洲。在瓜氨酸的制備方法上，國外主要采用發酵法和酶法生產，分離純化多數使用離子交換等常用的分離方法。

發明內容
本發明的目的本發明深入調查和研究了現有技術，并從土壤中篩出多株生產瓜氨酸的菌株進行了研究，最終篩選到一株能高產瓜氨酸的新菌種。其二，提供通過該菌株發酵生產瓜氨酸或用精氨酸溶液的全細胞轉化的方法制備瓜氨酸，以得到高的轉化率和較純的產品。再者，提供一種瓜氨酸分離純化與精制的方法，以得到高純度的瓜氨酸。
本發明的技術方案本發明提供一種來源于土壤高產瓜氨酸的菌株，其分類命名為庫特氏菌屬印.nov. JSK23. 003，是通過根據一定法則的菌類學性質、生物化學性質的分析和16sRNA序列的測定而得出，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011467。利用該微生物CCTCC NO =M 2011467，發酵生產瓜氨酸的方法，步驟如下
(1)種子培養
種子培養基=L-Arg l-100g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L以及加或不加少量無機鹽等，調pH4. 0-7. 5，去離子水配制；
種子培養條件菌株于30-37°C、100-300rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養5_30h 活化該菌株。(2)發酵培養
發酵培養基=L-Arg l-100g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-0. Og/L以及加或不加少量無機鹽等，調pH4. 0-7. 5，去離子水配制；
發酵條件接種量1%_10%，30-37°C、轉速100-500r/m的條件下在發酵培養基中發酵 5-72h，獲得具有酶活的發酵液及濕菌體。(3)發酵后處理
發酵液經冷凍離心后收集含瓜氨酸的發酵液或含精氨酸脫亞氨酶的濕菌體，并用0. 1% 的生理鹽水和pH6. 0的0. lmol/L醋酸鹽緩沖液清洗菌體，得靜息細胞，以便進行全細胞轉化反應，經檢測轉化率在80%以上。(4)靜息細胞將精氨酸轉化生產瓜氨酸底物精氨酸濃度10_200g/L，靜息細胞量 0. l-10g/L，在pH4. 0-7. 5、轉化反應溫度為30_70°C、轉化反應時間5_40h的條件下轉化制得備瓜氨酸；
(5)瓜氨酸的分離純化
將轉化后的反應液經脫色后利用強酸性陽離子交換樹脂001X7，進行瓜氨酸分離純化。本發明的有益效果本發明涉及一株從土壤中篩選而來的潛在新種庫特氏菌屬 (.Kurthia sp. nov. )SK23. 003，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M 2011467，以此菌為發酵菌株，以精氨酸為誘導物、以葡萄糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發酵培養基，通過發酵制備瓜氨酸或用發酵生產的含有精氨酸脫亞氨酶的菌體添加到5%-20%精氨酸溶液中轉化合成瓜氨酸，經檢測可知，轉化率可達80%以上。本發明方法生產的瓜氨酸安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性產品，被廣泛的應用于食品、化妝品、醫藥等行業。該發明能高效地生產瓜氨酸，適于進行大規模生產。生物材料樣品保藏一株產瓜氨酸的菌株，其分類命名為庫特氏菌屬GferiAia sp. nov. ) SK23. 003，已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011467，保藏日期2011年12月12日。
具體實施例方式以下是庫特氏菌屬sp. nov. J SK23. 003進行發酵生產瓜氨酸的實施例，但本發明的技術范圍并不限于所列出的幾個實例，在不改變其要點的前提下，可做各種改變進行實施。另外，本發明的技術范圍延及均等的范圍。實施例1 SK23. 003菌株的發酵培養
使用菌株SK23. 003，在含葡萄糖1%、精氨酸1. 2%、酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，無機氮源 0. 1%以及含或不含少量無機鹽等，調pH6. 0的培養基中，37°C，190 rpm的條件下培養22h， 冷凍離心，制得具有精氨酸酶活的靜息細胞。實施例2轉化反應
使用實施例1所得菌體，在含精氨酸質量濃度為50g/L，靜息細胞量0. l-10g/L的 IOOmM醋酸緩沖液(HAc-NaAc、pH6. 0)中，在37°C下進行轉化反應，合成瓜氨酸。實施例3瓜氨酸產量的測定
將實施例2中進行的反應液經滅酶(TCA沉淀)、稀釋，通過安捷倫液相色譜儀，分別對精氨酸、瓜氨酸進行定量。分析條件如下儀器型號=Agillent 1100，色譜柱(250*4. 6)mm 5 μ m ODS HYPERSIL,柱溫40°C。實施例4新型瓜氨酸產生菌的鑒定
將新型瓜氨酸生產菌送往中國典型培養物保藏中心測定該菌的形態特征、生理生化特性以及16SrRNA基因序列分析，鑒定為庫特氏菌屬印.nov. J SK23. 003。實施例5瓜氨酸的分離純化
將轉化所得的反應液經脫色后，利用強酸性離子交換樹脂001 X 7，然后用不同濃度的氨水進行洗脫，得到純化的瓜氨酸。
權利要求
1.一株產瓜氨酸的菌株，其分類命名為庫特氏菌屬GferiAia sp. nov. ) 23. 003，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011467。
2.用權利要求1所述的CCTCCNO =M 2011467菌株生物合成瓜氨酸的方法，其特征在于，以CCTCC NO =M 2011467為發酵菌株；(1)種子培養種子培養基=L-Arg l-100g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-20. Og/L，調ρΗ4· 0-7. 5，去離子水配制；種子培養條件菌株于30-37°C、100-300rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養5_30h 活化該菌株；(2)發酵培養發酵培養基=L-Arg l-100g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，無機氮源1. 0-0. Og/L，調ρΗ4· 0-7. 5，去離子水配制；發酵條件接種量1%_10%，30-37°C、轉速100-500r/m的條件下在發酵培養基中發酵 5-72h，獲得具有酶活的發酵液及濕菌體；(3)發酵后處理發酵液經冷凍離心后收集含瓜氨酸的發酵液及具有精氨酸脫亞氨酶活性的濕菌體，濕菌體用0. 1%的生理鹽水和pH6. 0的0. lmol/L醋酸鹽緩沖液清洗菌體，得靜息細胞用于進行全細胞轉化反應，經檢測轉化率在80%以上；(4)靜息細胞將精氨酸轉化生產瓜氨酸底物精氨酸濃度10-200g/L，靜息細胞量 0. l-10g/L，在pH4. 0-7. 5、轉化反應溫度為30_70°C、轉化反應時間5_40h的條件下轉化制得備瓜氨酸；(5)瓜氨酸的分離純化將轉化后的反應液經脫色后利用強酸性陽離子交換樹脂001X7，進行瓜氨酸分離純化。
全文摘要
一株產瓜氨酸的菌株及用該菌株生物合成瓜氨酸的方法，屬于食品生物技術領域。本發明涉及一株從土壤中篩選而來的潛在新種SK23.003為庫特氏菌屬(Kurthiasp.nov.)，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM2011467，以此菌為發酵菌株，以精氨酸為誘導物、以葡萄糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發酵培養基，通過發酵制備瓜氨酸或用發酵生產的含有精氨酸酶的菌體添加到5%-20%精氨酸溶液中轉化合成瓜氨酸，經檢測可知，轉化率可達80%以上。本發明方法生產的瓜氨酸安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性產品，被廣泛的應用于食品、化妝品、醫藥等行業。該發明能高效地生產瓜氨酸，適于進行大規模生產。
文檔編號C12N1/20GK102433289SQ20121001203
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者張濤, 江波, 沐萬孟, 王瑩, 繆銘 申請人:江南大學