專利名稱：一種利用側芽孢桿菌生產抗菌肽的方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵領域，具體地，涉及側芽孢桿菌發酵制備抗菌肽的工藝方法。
背景技術：
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMP)是生物產生的一種具有抗菌活性的多肽， 一般分子量小于5kD，氨基酸數目小于100。與抗生素相比，抗菌肽安全性高，對人和動物正常細胞無害，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類生物防腐劑。它具有較廣的抑菌譜，不僅能夠抑制細菌，而且對真菌、病毒及癌細胞也有一定的抑殺作用。此外，還具有穩定性高、耐熱性好、溶解性好等特點。這些優點使其在食品工業和飼料工業中有廣闊的應用前景。在食品防腐領域，目前使用最廣泛的抗菌肽是由乳酸鏈球菌產生的乳酸鏈球菌肽 (Nisin)。Nisin可以被消化道中酶降解，是一種對人體無毒的天然食品防腐劑，已被廣泛應用于乳制品、肉制品、罐裝食品和飲料的防腐保鮮。然而Nisin也存在一些局限性，例如抑菌譜較窄，僅對親緣關系相近的革蘭氏陽性菌有顯著的抑菌作用，而對革蘭氏陰性菌和真菌沒有活性；在中性和堿性條件下對熱不穩定，從而使其在食品中的應用受到了一定限制。 作為飼料添加劑，抗菌肽具有顯著的防病促生長效果，近年來受到國內外的極大關注，已成為飼用抗生素替代品的研究熱點之一。例如柞蠶抗菌肽應用于預防及治療雞白痢效果明顯；蠶抗菌肽可減輕斷奶仔豬的腹瀉；酵母基因工程抗菌肽可促進仔雞生產和減少排泄物氮含量，對粵黃雞具有促生長、保健和治療疾病的功能。抗菌肽酵母制劑作飼料添加劑的應用效果顯著，而其它大規模運用于生產實際的抗菌肽添加劑不多見。迄今為止，已在許多生物包括動物、植物及微生物中發現了 600多種內源性抗菌肽。由于植物、動物源抗菌肽的來源有限，限制了其在實際中的大規模應用，而利用微生物發酵生產抗菌肽具有明顯的優勢周期短、成本低、且不受季節和氣候等環境因素的影響， 可實現大規模工業化生產，是克服抗菌肽實際應用技術瓶頸的有利途徑。許多微生物可以產生抗菌肽，當前的研究主要集中在乳酸菌，然而乳酸菌來源的抗菌肽大多存在抗菌譜窄、 耐熱性差等問題，因此，進一步開發抗菌譜更廣，性能優良的抗菌肽防腐劑顯得更加迫切。 芽孢桿菌和類芽孢桿菌產生的抗菌肽普遍抑菌譜廣、穩定性高，開始引起國內外研究人員的注意，而對芽孢桿菌和類芽孢桿菌產生的抗菌肽報道不多。

發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種利用側孢短芽飽桿菌生產抗菌肽的方法。本發明的第二個目的在于提供上述方法生產的抗菌肽在食品防腐和飼料添加劑中的應用。側孢短芽孢桿菌，也被稱為側孢芽孢桿菌，細胞桿狀，形成橢圓形芽孢，芽孢位于芽孢囊一側，好氧，最適合生長溫度為^_30°C，產生大量幾丁質酶，可以抑制多種真菌。側孢芽孢桿菌已被用來生產功能性食品和飼用微生態制劑，是食品、飼料中允許使用的微生物，具有極高的安全性，是一種潛在的益生菌。本發明提供的發酵生產抗菌肽的方法，是以側孢短芽孢桿菌(Brevikicillus laterosporu)為菌種，接入碳源、氮源及無機鹽組成的發酵培養基中，發酵制備得到抗菌肽。本發明發酵生產抗菌肽的方法，其包括步驟1)種子培養將側孢芽孢桿菌接入滅菌后的種子培養基中，于30-37°C培養12-1 !，得到種子液，含菌量為107-108cfu/ml。種子培養基的配制如下牛肉膏0.5-lg，蛋白胨l_2g，氯化鈉0.5-0. 7g，蒸餾水 100ml, pH 7. 2-7. 4 ；2)發酵培養將步驟1)得到的種子液按接種量-3%接種到發酵培養基中進行發酵培養，培養條件30-40°C，搖床轉速180j80r/min，發酵培養12_24h。所述發酵培養基分別含碳源0. 5 % -3 %，氮源0. 5 % -3. 5 %，無機鹽 0. 005% -0. 2%,均為質量體積比。上述步驟1)的側孢芽孢桿菌為側孢芽孢桿菌(Brevikicillus laterosporus) ASl.864，(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2738,側孢芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2739，側孢芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)CICC6014 中的一種或多種。其中步驟1)所述的種子培養，其培養條件為30°C，培養12h。其中步驟1)所述的種子培養基，為牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，氯化鈉0.5g，水 100ml, pH 7. 3 ；其中步驟2)所述的發酵培養條件為32°C，搖床轉速MOr/min，發酵培養18h。其中步驟2、所述的碳源包括葡萄糖、玉米淀粉糖、可溶性淀粉中的一種或幾種。優選碳源為葡萄糖。其中步驟2、所述的氮源包括玉米漿、大豆粕、蛋白胨中的一種或幾種。優選氮源為玉米漿。其中步驟2)所述的無機鹽選用CaCl2、ZnCl2^MnCl2中的一種或幾種。優選無機鹽為CaCl2。本發明提供了利用側芽飽桿菌發酵生產的抗菌肽在食品防腐或飼料添加劑中的應用。抑菌實驗表明，本發明方法發酵得到的抗菌肽對常見的食源性指示菌(如金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌)有抑菌表現，具有廣譜抑菌活性。將制備得到的發酵液經脫水濃縮，與輔料按1 1比例(質量比)混合，所得添加劑以2% (質量百分比)的濃度添加到濃縮飼料中，可用于動物生產中，其對包括大腸桿菌、 沙門氏菌、金黃色葡萄球菌在內的革蘭氏陰性菌及其他雜菌具有很好的抑制作用。用本發明方法制得的抗菌肽進行急性攻毒試驗，臟器系數、血液生理生化指標表明，在已超出試劑使用量添加到食品中，小鼠食用后，并沒有對小鼠的生長、代謝、免疫功能造成損害，仍然是安全的，因此可以認定本發明方法制得的抗菌肽在使用安全，毒性級別應屬于“安全無毒級”，是一種安全的制劑。本發明提供的一種利用側孢短芽孢桿菌發酵制備抗菌肽的方法，制備工藝簡單、 產率高，通過發酵的方法，12-24h發酵液中抗菌肽效價達1000-1500AU/ml。側孢短芽孢桿菌可以在廉價發酵培養基產生高活性的抗菌肽，降低生產成本，所得抗菌肽具有廣譜的抗菌活性、PH范圍廣、耐熱性能好，可作為食品防腐劑和飼料添加劑。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。本發明實施例所用菌種為側孢短芽孢桿菌Brevibacillus Iaterosporus ASl. 864 ；Brevibaci1Ius laterosporus ASl.2738 ；Brevibaci1Ius Iaterosporus ASl. 2739 ；以上菌種均已公開，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1抗菌肽的制備1、制備種子液將側孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2738接入滅菌后的種子培養基中，于30°C培養16h，得到種子液，含菌量為108cfu/ml。所述種子培養基的配制如下酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，pH 7. 3 ；2、發酵培養制備抗菌肽將步驟1)得到的種子液按接種量2%體積比接種到發酵培養基中進行發酵培養， 培養條件32°C，搖床轉速180r/min，發酵培養18h，所述發酵培養基分別含碳源3. 5 %，氮源3 %，無機鹽0.2%，均為質量體積比。實施例2抗菌肽的制備1、制備種子液將側孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)ASl. 2739接入滅菌后的種子培養基中，于37°C培養12h，得到種子液，含菌量為107cfu/ml。所述種子培養基的配制如下牛肉膏10g，蛋白胨20g，氯化鈉7g，蒸餾水1000ml， pH 7. 2 ；2、發酵培養制備抗菌肽將步驟1)得到的種子液按接種量2%體積比接種到發酵培養基中進行發酵培養， 培養條件35°C，搖床轉速^Or/min，發酵培養16h，所述發酵培養基分別含碳源0. 5%，氮源0. 5%，無機鹽0. 005%，均為質量體積比。實施例3抗菌肽的確定采用國際公認的“蛋白酶敏感法”，將實施例1和實施例2獲得的發酵液分別進行如下處理1、IOOOOrpm離心15min去除菌體得到上清液，然后經0. 22 μ m濾膜過濾除確保去除菌體；2、將上清液pH調至6. 5以排除有機酸的作用；3、取等量樣液，分別與lOmg/mL的蛋白酶(胃蛋白酶、蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K)溶液1 1體積混合， 在37°C恒溫水浴鍋中反應池，反應結束后100°C沸水浴中煮沸滅酶5min ；4、分別取蛋白酶處理前后的樣品，用瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑，并進行比較。結果如表1所示，結果表明 實施例1和實施例2獲得抑菌物質對蛋白酶E和胃蛋白酶敏感，抑菌圈直徑分別減小至8. O 和14. Omm，特別是經蛋白酶E處理后抑菌活性完全損失，這表明該物質為抗菌肽。表1抗菌肽的確定
im>m>m>mmmmmimimimieammma>>>m>m>mimmimimif!TX!TX!TX!T^>>>">>>">>>"mmimimK::.:::.:::.:::.mnmmmimimimmtimimiim............WMwmwMttMtMtMmaMiMiMiMtMtMmMsawMWMWwwwwwwwBmBmBmBmttMtMtMtwaMaMaMaaiMwwwMwmwmBmBmttMtMmMmimim!
_對照蛋白酶K 蛋白酶E 胃蛋白酶胰蛋白酶抑菌圏直徑 17.016.88.014.016.8
(mm)
^maaasaaasaaaoasmememmmmmmmmmememtmmmm.............................................................................................................................................................................................................................................................................................賊賊銷實施例4不同碳源對抗菌肽效價的影響制得3份發酵培養基，其為分別在蒸餾水中按質量百分比中添加，葡萄糖1%、 糊精和可溶性淀粉1%，另外每份發酵培養基中添加玉米漿1.0%，CaCl2 0.05%，對 Brevibacillus laterosporus ASl. 864進行發酵實驗，發酵IMi后對發酵液進行檢測，結果如表2所示，葡萄糖作為碳源抗菌肽的效價較高，不同碳源對抗菌肽的生成有較為顯著的區別。抗菌肽的效價測定采用國際上公認的“二倍稀釋法”，將抗菌肽依次進行2倍稀釋，抗菌肽的效價定義為2n(AU/ml)，η表示指示菌的最大稀釋度的倒數。表2不同碳源對抗菌肽效價的影響
葡萄糖可溶性淀粉糊精-
抗菌肽(AU/ml)800-1000800-900300-400實施例5不同氮源對抗菌肽效價的影響制得3份發酵培養基，其為分別在蒸餾水中按質量百分比中添加，蛋白胨1%、 玉米漿和大豆粕1%，另外每份發酵培養基中添加玉米漿1.0%，CaCl2 0.05%，對 Brevibacillus laterosporus ASl. 864進行發酵實驗，發酵IMi后對發酵液進行檢測，抗菌肽的效價測定采用國際上公認的“二倍稀釋法”，將抗菌肽依次進行2倍稀釋，抗菌肽的效價定義為2n(AU/ml)，η表示指示菌的最大稀釋度的倒數。結果如表3所示，玉米漿作為碳源抗菌肽的效價較高，不同氮源對抗菌肽的生成有較為顯著的區別。表3不同氮源對抗菌肽效價的影響
wsmsmsma......................................................................................................igg&gg&gg&aa^^^^gg&gg&gg&aaaBaaaBaaaBawwftmftmwa&ggagg&gsfwmwmwmoggoggogg&gs&gs&gs&gs&as&as&asiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiKWMWMWMWwwftmwa&gg&gg&ggfeggfeggfegg&^^^^iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiia&gg&gg&ggfeggfeggfegggMMaBaaaBaaaBaafeggfeggfegggMmogsogsogs^^^
Γ 蛋白胨玉米漿大豆粕-
抗菌肽(AU/ml)800-10001000-1500700-800實施例6不同金屬離子對抗菌肽效價的影響參照實施例3和4配制培養基的方法，制得3份發酵培養基，與上述不同的是，本實施例培養基含葡萄糖1. 0%，玉米漿1. 0%，3份培養基分別添加不同金屬離子0. 3%，通過檢測Brevibacillus laterosporus ASl. 864發酵1 后抗菌肽的效價，抗菌肽的效價測定采用國際上公認的“二倍稀釋法”，將抗菌肽依次進行2倍稀釋，抗菌肽的效價定義為 2n(AU/ml)，η表示指示菌的最大稀釋度的倒數。添加金屬離子CaCl2抗菌肽效價最高。不同金屬離子對抗菌肽效價的影響如表4所示。表4不同金屬離子對抗菌肽效價的影響
權利要求
1.一種發酵生產抗菌肽的方法，是以側孢短芽孢桿菌(Brevikicillus laterosporu) 為菌種，接入碳源、氮源及無機鹽組成的發酵培養基中，發酵制備得到抗菌肽。
2.如權利要求1所述的方法，其包括步驟1)種子培養將側孢短芽孢桿菌接入滅菌后的種子培養基中，于30-37°C培養12-1他，得到種子液， 含菌量為 107-108cfu/ml ；種子培養基的配制如下牛肉膏0. 5-lg，蛋白胨l-2g，氯化鈉0. 5-0. 7g，蒸餾水100ml， pH 7. 2-7. 4 ；2)發酵培養將步驟1)得到的種子液按接種量-3%接種到發酵培養基中進行發酵培養，培養條件30-40°C，搖床轉速 180480r/min，發酵培養 12_24h，所述發酵培養基分別含碳源0.5% -3%，氮源0.5% -3. 5%，無機鹽0. 005% -0.2%, 均為質量體積比。
3.如權利要求2所述的方法，其中步驟1)所述的側孢短芽孢桿菌為側孢芽孢桿菌 (Brevibacillus laterosporus)ASl. 864, (Brevibacillus laterosporus)AS 1.2738,側孢芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)AS 1· 2739，側孢芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus) CICC6014 中的一種或多種。
4.如權利要求2所述的方法，其中步驟1)所述的種子培養，其培養條件為30°C，培養12h。
5.如權利要求2所述的方法，其中步驟1)所述的種子培養基，為牛肉膏0.5g，蛋白胨 lg，氯化鈉 0. 5g，水 100ml, pH 7. 3。
6.如權利要求2所述的方法，其中步驟幻所述的發酵培養條件為32°C，搖床轉速 M0r/min，發酵培養18h。
7.如權利要求2所述的方法，其中步驟幻所述的碳源為葡萄糖、玉米淀粉糖、可溶性淀粉中的一種或幾種。
8.如權利要求2所述的方法，其中步驟2)所述的氮源為玉米漿、大豆粕、蛋白胨中的一種或幾種。
9.如權利要求2所述的方法，其中步驟2)所述的無機鹽選用CaCl2、&iCl2、MnCl2中的一種或幾種。
10.權利要求1-9所述方法生產的抗菌肽在食品防腐或飼料添加劑中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種生產抗菌肽的方法，是以側孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporu)為菌種，接入添加碳源、氮源及無機鹽組成的發酵培養基中，30-40℃搖床培養12-24小時，得到效價1000-1500AU/ml的抗菌肽，該抗菌肽抗菌譜廣、安全性好、穩定性高。本發明提供的生產抗菌肽的方法及其產品具有成本低、制備工藝簡單、產率高、抗菌譜廣、殺菌效力高等優點，可廣泛地應用于食品、水果及蔬菜保鮮防腐及飼料添加劑等領域。
文檔編號A23J3/20GK102524518SQ20121001995
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月21日 優先權日2012年1月21日
發明者孫繼良, 李興峰, 王廣賢, 王志新, 田豐偉, 賈英民, 陳衛 申請人:河北科技大學