一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌，應用該地衣芽孢桿菌能夠在酸性環境下正常生長，且能夠合成酯類物質，分解淀粉及蛋白質類物質。其保藏編號為：CGMCCNO.7484。本發明還提供上述地衣芽孢桿菌在產生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶中的應用；同時提供上述地衣芽孢桿菌在酯的合成和蛋白質水解制肽中的應用。本發明篩選到的地衣芽孢桿菌CGMCCNO.7484，能在酸性環境下培養產生酯酶、蛋白酶和淀粉酶，應用產生的酯酶能夠制備增香酯類如：己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等，應用蛋白酶能夠制備蛋白水解肽。本發明的地衣芽孢桿菌CGMCCNO.7484可以作為大曲酒發酵過程中所使用的產酶微生物的備選。
【專利說明】一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程中酶工程發酵【技術領域】，具體地，涉及一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌。
【背景技術】
[0002]酯酶能水解酯類產生相應的酸和醇，也可以完成酯化、轉酯、酯交換等反應，合成食品工業中很多重要的香味物質。在酒類、食醋、醬油和其他釀制食品的釀造中均可以利用酯酶催化產生的酯類來增進香味。我國是世界上重要的白酒生產大國，目前在利用紅曲霉、根霉和球擬酵母等產生的酯酶，來增加白酒中的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等4大類酯的含量，提高白酒優級率均取得較好進展，但對產酯酶細菌的篩選和應用的研究還鮮有報到。而且在大曲酒發酵過程中酒醅的酸度逐漸增大從而抑制了產酶微生物的正常代謝，造成酒醅中的淀粉和蛋白質殘存較高。因此篩選在酸性條件下能正常生長同時能產生酸性酶系的微生物對提高酒醅原料中淀粉和蛋白質的利用率，增加酒的產出率，具有重要實際意義。

【發明內容】

[0003]本發明提供了一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌，應用該地衣芽孢桿菌能夠在酸性環境下正常生長，且能夠合成酯類物質，分解淀粉及蛋白質類物質。
[0004]本發明提供一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌{Bacillus licheniformis')，、為哀子2013年4月18日送至位于北 京市朝陽區北辰西路I號院的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行保藏，保藏編號為CGMCC N0.7484。
[0005]進一步地，所述生產多酶系是所述地衣芽孢桿菌在同一培養條件下能同時產生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。
[0006]本發明所述地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484的酯酶酶活為11.5 U/ml。
[0007]本發明所述地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484的酸性蛋白酶酶活為768 U/ml。
[0008]本發明所述地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484的酸性淀粉酶酶活為11.995 U/ml。
[0009]進一步地，所述培養條件為在酸性環境下培養。
[0010]本發明的第二個目的是提供一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌的篩選方法，是高溫大曲在以三丁酸甘油酯為誘導底物、PH 5.0-6.0的平板上培養篩選獲得；優選地，所述pH為6.0，所述生產多酶系是所述地衣芽孢桿菌在同一培養條件下能同時產生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。PH 5.0-6.0時，均能篩選得到產生酯酶、酸性蛋白酶和酸性淀粉酶的地衣芽孢桿菌，在PH為6.0時篩選得到的地衣芽孢桿菌產生酯酶、酸性蛋白酶和酸性淀粉酶的量最多。
[0011]本發明的第三個目的是提供上述地衣芽孢桿菌的擴大培養方法，是用培養基在pH為5.0-6.0的條件下培養的，優選地，所述pH為6.0。pH為5.0-6.0之間時，均能完成對本發明的地衣芽孢桿菌的擴大培養，當PH為6.0時，擴大培養的效果最好。[0012]本發明的第四個目的是提供上述地衣芽孢桿菌在產生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶中的應用；優選地，所述應用是用培養基在PH為5.0-6.0的條件下培養所述地衣芽孢桿菌，優選地，所述PH為6.0。
[0013]本發明的第五個目的是提供上述地衣芽孢桿菌在酯的合成和蛋白質水解制肽中的應用。
[0014]本發明篩選到的地衣芽抱桿菌Cfeci77w5.Iicheniformis) CGMCC N0.7484,能在酸性環境下培養產生酯酶、蛋白酶和淀粉酶，應用產生的酯酶可以制備增香酯類如:己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等，同時可以應用蛋白酶制備蛋白水解肽。可以作為大曲酒發酵過程中所使用的產酶微生物的備選。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發明的地衣芽孢桿菌7icA6wi/orffl/5.)菌株的革蘭氏染色照片； 圖2為本發明的地衣芽孢桿菌7icA6wi/orffl/5.)菌株的芽孢染色照片；
圖3為本發明的地衣芽孢桿菌7icA6wi/orffl/5.)菌株的酯酶篩選平板照片；
圖4為本發明的地衣芽孢桿菌7icA6wi/orffl/5.)菌株的酸性淀粉酶篩選照片； 圖5為本發明的地衣芽孢桿菌Iicheniformis')菌株的酸性蛋白酶篩選照片。
【具體實施方式】
[0016]以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本發明范圍。
[0017]一、地衣芽抱桿菌Ii cheni formi s ) CGMCC N0.7484 的獲得。
[0018]將高溫大曲(取自安徽雙輪酒業`有限責任公司)研磨成粉狀，準確稱取25 g加入到含有200 ml的無菌生理鹽水的錐形瓶中。加入滅菌的玻璃珠放入搖床(180r/min)室溫下震蕩打散30min后取出靜置30min。取I mL上清液并加入9mL無菌生理鹽水，配制成10_1菌懸液。依次類推，配制成10_3、10_4……10_7的菌懸液，均勻涂布于已隔夜冷卻的分離培養基(分離培養基的制備方法為:將牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂條20g，三丁酸甘油酯4ml，制霉菌素0.01g混合，加蒸餾水至1000mL,調pH為6.0，121°C，滅菌20min,得到分離培養基)平板上，將接種好的平板置于37°C恒溫培養箱中培養48h。觀察菌落周圍有無透明圈出現，將有透明圈產生的菌落挑出并純化至純種4°C冰箱斜面保存。
[0019]將應用上述方法篩選到的最優菌株(透明圈最大)通過鏡檢和16SrDNA鑒定，證實與GenBank中公布的各種地衣芽孢桿菌的16SrDNA的同源性為99%，從而確定該菌株為地衣芽孢桿菌將其于2013年4月18日送至位于北京市朝陽區北辰西路I號院的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行保藏，保藏編號為 CGMCC N0.7484。
[0020]二、地衣芽抱桿菌Ii cheni formi s ) CGMCC N0.7484 的發酵培養。
[0021]從斜面上挑取地衣芽抱桿菌CfeciBw1S Ii cheni formi s ) CGMCC N0.7484菌株到種子培養基(種子培養基的配方為:牛肉膏20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2S04 1.0g/L, MgSO4.7H20 1.0g/L, NaCl 0.5g/L, FeSO4.7H20 0.01g/L，其余為蒸餾水，將以上配方混合，調pH至6.0，121°C，滅菌20min，制得種子培養基。)中培養，將用種子培養基培養到對數期的種子，按5%接種量加入到發酵培養基(發酵培養基的配方為:牛肉膏20.0g/ L，葡萄糖 20.0g/L，K2HPO4 1.0g/L, ( NH4) 2S04 1.0g/L, MgSO4.7H20 1.0g/L, NaCl0.5g/L，FeSO4.7H20 0.01g/L,其余為蒸餾水，將以上配方混合，調pH至6.0,121 V，滅菌20min，制得發酵培養基。)中，然后置于37°C、150r/min條件下振蕩培養72h。收集發酵液離心IOmin (12000r/min，4°C)，取上清液及菌體以備檢測。
[0022]三、地衣芽抱桿菌Iicheni formi s ) CGMCC N0.7484 的酯酶酶活測定: 將步驟二中得到的的菌體用無菌生理鹽水洗滌3次，并加滅菌后的玻璃珠震蕩，利用
顯微計數法將菌體濃度調整為IO8個/L得到粗酶液，取粗酶液5ml加入到25ml的酯化液(酯化液由以下質量濃度的各組分混合制成:無水乙醇2%，己酸1.5%，酵母提取物0.1%)中30°C靜置反應24h后，測定總酯的生成量，以己酸乙酯計。以加入5ml沸水滅活的粗酶液作對照。測得地衣芽孢桿菌UaciJJw1S licheniformis) CGMCC N0.7484的酯酶酶活為11.5U/ml。酯酶酶活力單位定義:在此實驗條件下，每小時生成Iymol己酸乙酯所需要的酶量為I個酶活力單位。
[0023]將地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484涂在含有三丁酸甘油酯的培養基(培養基的配方:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂條20g/L，三丁酸甘油酯4ml/L，其余為蒸餾水；調pH為6.0，121 °C，滅菌20min。)平板上，37°C恒溫培養48h，長出的菌落見圖3，因地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484能產生酯酶而分解其周圍的三丁酸甘油酯形成水解透明圈。
[0024]四、地衣芽孢桿菌{Bacillus licheniformis ) CGMCC N0.7484的酸性淀粉酶測定:
用pH4.0的磷酸緩沖液配 制質量百分比為1%的可溶性淀粉，取25ml的比色管加入3ml上述可溶性淀粉溶液37°C預熱IOmin,加入同樣預熱的酶液0.5ml (步驟二中離心收集的上清液，即為酶液)，準確反應10min后加入5ml HCL (0.0ImoI/L)終止反應。加入1.5mlDNS(3,5 一二硝基水楊酸，3, 5-DinitrosalicyIicacid )，沸水浴5min后，用蒸懼水定容至25ml,在A54tol處測定吸光度。每次試驗做3個平行，以沸水浴滅活的等量酶液做對照。測得地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484的酸性淀粉酶酶活為11.995 U/ml。
[0025]酸性淀粉酶酶活定義:在本發明實驗條件下，每分鐘水解可溶性淀粉生成I μ mol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。
[0026]將地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484涂在含有可溶性淀粉的培養基(培養基的配方為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂條20g/L，可溶性淀粉20g/L，其余為蒸餾水；調pH為5.0，121°C，滅菌20min)平板上，37°C恒溫培養48h后，再在平板中加入1.0mL 1%1-KI溶液，并搖勻，產生的顯色圈見圖4。因地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484能產生淀粉酶而分解其周圍的淀粉而呈現出碘色圈。
[0027]五、地衣芽抱桿菌licheniformis^) CGMCC N0.7484 的酸性蛋白酶測定:
用pH4.0的磷酸緩沖液配制質量百分比為2.0%的酪蛋白溶液，取2ml酪蛋白溶液置于試管中30°C水浴lOmin，加入同樣預熱的酶液0.5ml (步驟二中離心收集的上清液，即為酶液)。準確反應10min后，從水浴中取出，立即加入質量百分比為10%三氯乙酸溶液3ml，靜置15min,用濾紙過濾得到濾液。另取一支試管加入濾液和水各Iml,并加入碳酸鈉(0.55mol/L)溶液5ml混合均勻后再加入福林試劑1ml，在30°C顯色15min在A68tol測其吸光度，每個實驗做3個平行，以沸水滅活的等量酶液做對照。測得地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484的酸性蛋白酶酶活為768 U/ml。
[0028]酸性蛋白酶酶活定義:在本發明實驗條件下，每分鐘水解酪蛋白產生I μ g酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位。
[0029]將地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484涂在含有酪蛋白的培養基(培養基的配方為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂條20g/L，酪蛋白20g/L，其余為蒸餾水；調pH為
5.0，121°C，滅菌20min)平板上，37°C恒溫培養48h，長出的菌落見圖5，因地衣芽孢桿菌CGMCC N0.7484能產生蛋白酶而分解其周圍的酪蛋白形成水解暈圈。
[0030]六、地衣芽抱桿菌Ii cheni formi s ) CGMCC N0.7484產生的酯酶合成酯性能實驗
分別取步驟三中制備的粗酶液5ml加入到25ml的酯化液1、酯化液2和酯化液3(酯化液I由以下質量濃度的各組分混合制成:無水乙醇2%，己酸1.5%，酵母提取物0.1% ;酯化液2由以下質量濃度的各組分混合制成:無水乙醇2%，乙酸1.5%，酵母提取物0.1% ;酯化液3由以下質量濃度的各組分混合制成:無水乙醇2%，乳酸1.5%，酵母提取物0.1%)中，30°C靜置反應24h后，測定總酯的生成量分別為6.63g/L、3.45g/L、6.00g/L。實驗說明了可以用本發明的地衣芽孢桿菌UaciJJm licheniformis) CGMCC N0.7484產的酯酶制備增香酯類。
[0031]七、地衣芽抱桿菌Ii cheni formi s ) CGMCC N0.7484產生的蛋白酶水解大米蛋白實驗:
在50ml用pH4.0的磷酸緩沖液配制的質量百分濃度為10%的大米蛋白溶液中，加入IOmL按步驟二制備的上清液,混勻，置于40°C水浴中進行水解,水解5h,反應中每隔20min滴加0.5mol/L的NaOH維持pH值，待反應結束后，將反應體系加熱到100°C滅酶，保持5min，終止反應，得到水解蛋白液。
`[0032]用甲醛法測定水解度:取水解蛋白液IOml于小燒杯中，加入30ml去CO2蒸餾水并磁力攪拌，用精密pH計指示其pH值，用0.5mol/L NaOH滴至pH=8.2，并加入已中和好的甲醛溶液(pH=8.2)10ml，記錄將其pH值滴至8.2時所耗0.5mol/L NaOH的ml數，并作空白試驗。實驗測得蛋白水解度為24.33%。實驗證明，可以用本發明的地衣芽孢桿菌licheniformis ) CGMCC N0.7484產的酸性蛋白酶制備蛋白水解肽。
[0033]最后應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種生產多酶系的地衣芽孢桿菌(ifeci77i/5.7icAe/?i/br?i5.),其保藏編號為:CGMCCN0.7484。
2.根據權利要求1所述的地衣芽孢桿菌，其特征在于:所述生產多酶系是所述地衣芽孢桿菌在同一培養條件下能同時產生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。
3.根據權利要求2所述的地衣芽孢桿菌，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌CGMCCN0.7484的酯酶酶活為11.5 U/ml。
4.根據權利要求2所述的地衣芽孢桿菌，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌CGMCCN0.7484的酸性蛋白酶酶活為768 U/ml。
5.根據權利要求2所述的地衣芽孢桿菌，其特征在于:所述地衣芽孢桿菌CGMCCN0.7484的酸性淀粉酶酶活為11.995 U/ml。
6.根據權利要求2所述的地衣芽孢桿菌，其特征在于:所述培養條件為在酸性環境下培養。
7.—種生產多酶系的地衣芽孢桿菌的篩選方法，是高溫大曲在以三丁酸甘油酯為誘導底物、pH 5.0-6.0的平板上培養篩選獲得；優選地，所述pH為6.0，所述生產多酶系是所述地衣芽孢桿菌在同一培養條件下能同時產生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。
8.權利要求1-6任一所述的地衣芽孢桿菌的擴大培養方法，是用培養基在pH為5.0-6.0的條件下培養的；優選地，所述pH為6.0。
9.權利要求1-6任一所述的地衣芽孢桿菌在產生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶中的應用；優選地，所述應用`是用培養基在PH為5.0-6.0的條件下培養所述地衣芽孢桿菌；更優選地，所述pH為6.0。
10.權利要求1-6任一所述的地衣芽孢桿菌在酯的合成和蛋白質水解制肽中的應用。
【文檔編號】C12N9/56GK103509739SQ201310337856
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月6日 優先權日:2013年8月6日
【發明者】薛正蓮, 劉陽, 王洲, 蘇燕南, 趙世光, 梁慧, 王彩霞 申請人:安徽工程大學