專利名稱：肝癌易感基因無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種肝癌易感基因檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因水平評(píng)估肝癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為預(yù)防和治療肝癌的方向指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
肝癌是全球第五位常見惡性腫瘤，也是今年來發(fā)病率上升最快的腫瘤之一，其病死率位于因癌癥而死亡的第三位。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，肝癌高發(fā)于非洲東南部和東南亞，我國(guó)多見于東南沿海。我國(guó)每年有11萬人死于肝癌，其中男性8萬，女性3萬，占全世界肝癌死亡人數(shù)45%。引起肝癌的危險(xiǎn)因素很多，我國(guó)主要是由乙型肝炎病毒感染引起，其中 25 % -30 %的乙型肝炎患者可發(fā)展為肝硬化進(jìn)而演變?yōu)楦伟＝陙恚瑖?guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)肝癌的危險(xiǎn)因素做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)遺傳易感性是肝癌發(fā)病的內(nèi)因，相關(guān)基因的變異可引起相應(yīng)酶表達(dá)的異常，導(dǎo)致個(gè)體對(duì)毒物或致癌物產(chǎn)生不良反應(yīng)。最近的研究表明，肝癌的發(fā)生與EPHX1、GSTMU GSTTU CYPlAl四個(gè)遺傳易感基因密切相關(guān)。EPHXl為環(huán)氧化物水解酶編碼基因，屬于II相代謝酶，該酶的主要功能是催化各種環(huán)氧化物水解，形成可溶性的物質(zhì)排出體外。環(huán)氧化物很容易與DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞毒性或基因突變。EPHXl Tyrll3His單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)是EPHXl 基因第3號(hào)外顯子上一個(gè)C/T多態(tài)性位點(diǎn)突變，該多態(tài)位點(diǎn)的基因型有CC、CT、TT三種， CC (His/His)和CT(His/Tyr)風(fēng)險(xiǎn)基因型攜帶者，其EPHXl基因編碼蛋白的第113個(gè)氨基酸由Tyr(Y)變?yōu)镠is (H)，使該酶活性下降，從而使環(huán)氧化物水解速度降低，引起DNA單鏈斷裂，增加肝癌的易感性。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)屬于II相代謝酶，能促進(jìn)各種親電子的化合物(包括環(huán)境致癌物及其中間代謝產(chǎn)物)與谷胱甘肽結(jié)合，形成易溶于水的化合物排除體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關(guān)的酶類，已知人類GSTs家族中GSTMl和GSTTl與腫瘤發(fā)生的關(guān)系最為密切。GSTMl具有present和null兩個(gè)等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指結(jié)構(gòu)基因缺失的純合子，又稱為空白基因型，缺乏GSTMl酶活性。 GSTTl基因多態(tài)現(xiàn)象與GSTMl類似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl 和GSTTl酶活性可能通過促進(jìn)致癌劑的親電作用及從體內(nèi)的排除而保護(hù)易感組織，防止體細(xì)胞的DNA突變，而GSTMl或GSTTl基因的純和缺失可能會(huì)降低或喪失機(jī)體代謝及排出致癌物的功能，從而具有較大的腫瘤危險(xiǎn)性。因此，GSTMl、GSTT1基因缺失可以作為肝癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。細(xì)胞色素P450家族基因CYPlAl也是肝癌發(fā)生相關(guān)的重要基因，該基因編碼一種重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類細(xì)胞色素P4501A1，該酶是肝臟微粒體中重要的代謝酶之一，它的異常表達(dá)會(huì)促使大量致癌物在肝臟中聚集，且被激活的CYPlAl能將多種環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)。大量研究顯示，CYPlAl基因與環(huán)境因素的交互作用會(huì)影響包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。比如，當(dāng)CYPlAl酶蛋白462位氨基酸由Ile變?yōu)閂al時(shí)，CYPlAl酶的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致具有致癌能力的環(huán)氧化物濃度增加，引起DNA的損傷及染色體畸變，導(dǎo)致包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，鑒于EPHXl、GSTM1、GSTT1和CYPlAl基因與肝癌的發(fā)生有著重要的關(guān)聯(lián)關(guān)系，可以做為預(yù)測(cè)和篩查肝癌的潛在指征，通過這些肝癌易感基因的檢測(cè)，能在預(yù)防和治療肝癌以及降低肝癌發(fā)生率等方面起到不容忽視的重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于EPHXl 基因上 Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/ Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl 基因上 Ile462Val (rsl048943)的 4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評(píng)估肝癌發(fā)病的危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，研制一種肝癌易感基因檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)EPHXl基因上Tyrll3His(rsl042522)，GSTM1 基因是否缺失(Null/Present)， GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl 基因上 Ile462Val (rsl048943)的 4 個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物； PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測(cè)序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I.檢測(cè)試劑盒的使用I、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì)(I)EPHXl (Tyrll3His)正向引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'EPHXl(Tyrll3His)反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;(3)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(4)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性lmin，50°C Imin退火，72°C延伸 50s，35個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10分鐘。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物 20ul，lU/ul SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA測(cè)序反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測(cè)序引物(I)EPHXl (Tyrll3His)測(cè)序引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'(2)GSTMl (Null/Present)測(cè)序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(3)GSTTl (Null/Present)測(cè)序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYPlAl(Ile462Val)測(cè)序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 測(cè)序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測(cè)
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的 SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.篩查肝癌風(fēng)險(xiǎn)人群的基因無創(chuàng)檢測(cè)服務(wù)I.無創(chuàng)采樣
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔粘膜上皮細(xì)胞取樣，樣本用細(xì)胞保存液常溫保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法對(duì)采集到的口腔粘膜細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提。3.基因型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740) ,GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present)，CYPlAl基因上Ile462Val (rsl048943)的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA 測(cè)序，確定這4個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。4.肝癌發(fā)病高危人群生物信息學(xué)分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通過對(duì)受檢者SNPs基因型的生物信息學(xué)分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型鑒定，出具肝癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了受檢者EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740) ,GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present), CYPlAl基因上Ile462Val (rsl048943)的4個(gè)SNP位點(diǎn)基因檢測(cè)信息、肝癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果和防治方案。根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明并解讀肝癌易感基因無創(chuàng)檢測(cè)報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)肝癌易感基因的無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，其組成成分為檢測(cè)EPHXl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) Tyrl 13His (rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)Ile462Val (rsl048943)基因型的PCR特異引物與DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特點(diǎn)在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì) EPHXl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl基因是否缺失(Null/ Present), GSTTl基因是否缺失(Null/Present), CYPlAl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) Ile462Val (rsl048943)，能特異性擴(kuò)增出包含4個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特點(diǎn)在于所述的DNA測(cè)序引物是針對(duì)EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失 (Null/Present)，CYPlAl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)Ile462Val (rsl048943)，能通過DNA 測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出上述4個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所示的試劑盒，其所含的4對(duì)特異性引物序列如下(1)EPHXl(Tyrll3His)正向引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'EPHXl (Tyrll3His)反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(3)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(4)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測(cè)序引物序列如下(1)EPHXl(Tyrll3His)測(cè)序引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'(2)GSTMl(Null/Present)測(cè)序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(3)GSTTl(Null/Present)測(cè)序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYPlAl(Ile462Val)測(cè)序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1) 0 反應(yīng)體系10父？0 反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對(duì)，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測(cè)序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本項(xiàng)發(fā)明提供了一種檢測(cè)肝癌易感基因的無創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)EPHX1基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)Tyr113His(rs1051740)，GSTM1基因是否缺失(Null/Present)，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，CYP1A1基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)Ile462Val(rs1048943)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物純化體系、DNA測(cè)序反應(yīng)體系等。本項(xiàng)發(fā)明的試劑盒通過檢測(cè)與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來評(píng)估中國(guó)人群肝癌患病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并根據(jù)受檢者基因檢測(cè)結(jié)果從基因方向指導(dǎo)中國(guó)人群有針對(duì)性的預(yù)防肝癌的發(fā)生，以降低肝癌的發(fā)病概率。本項(xiàng)發(fā)明所使用樣本為口腔粘膜細(xì)胞，采集方法無痛、無創(chuàng)、可避免交叉感染。基因測(cè)序過程采用ABI 3730型測(cè)序儀，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，適合推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586430SQ20121002198
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月1日
發(fā)明者姜麗, 潘加奎 申請(qǐng)人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司