專利名稱：一種EAAT2基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，涉及一種探針及其設計方法，尤其是一種EAAT2基因 cRNA原位雜交的探針及其設計方法。
背景技術：
谷氨酸是哺乳動物中樞神經系統最重要的神經遞質，在體內主要與親離子性和親代謝性兩種谷氨酸受體家族結合發揮活化作用。谷氨酸如果在細胞外濃度過高，過度興奮谷氨酸受體可導致神經細胞死亡，由于細胞外沒有能分解谷氨酸的酶，釋放的谷氨酸幾乎完全依賴神經元以及神經膠質細胞膜上的谷氨酸轉運蛋白(EAAT)的攝取來保持濃度的相對穩定，同時EAAT也為體內很多代謝途徑提供谷氨酸來源。谷氨酸轉運蛋白分高親合力和低親合力轉運蛋白兩種，高親合力轉運蛋白都作用于依賴鈉-鉀的L-谷氨酸，L-和 D-天冬氨酸，所以也稱為鈉-鉀谷氨酸轉運蛋白或興奮性氨基酸轉運蛋白(Excitatory amino acid transporter, EAAT)。目前已有五種被克隆，它們是 EAATl (GLAST， Glutamate-aspartate transporter), EAAT2(GLT, glial glutamate transporter), EAAT3(EAAC, excitatory amino acid Carrier), EAAT4 和 EAAT5。

發明內容
本發明的目的在于提供一種EAAT2基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法。本發明的目的是通過以下技術方案來解決的一種EAAT2基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為5 ' AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAATGAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCG TTATCAAGAAGGGCCTGGAGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTTATTGCTTTCGGCAT TGCCATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCAAGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATGAAG TTAGTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCCTGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAG GACTT 3'。所述探針的設計方法(I)根據EAAT2的Gene bank序列我們設計了 EAAT2特異的引物，并且此對引物擴增出278bp的EAAT2片段作為EAAT2特異的探針序列；(2)構建EAAT2的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；⑶EAAT2的cRNA原位雜交探針； (4)檢測EAAT2的cRNA探針的原位雜交。所述步驟⑴中EAAT2特異的引物是上游引物是5' CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3'；下游引物是5' AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3'。所述步驟(2)按照如下步驟進行
(a)將大鼠的cDNA用設計的弓丨物進行PCR擴增；(b)將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；(c)將回收后的產物于4°C與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接;(d)將連接好的質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序。所述步驟(3)按照如下步驟進行(a)步驟⑵得到的細菌測序正確后，經判斷確認EAAT2探針序列插入載體的順序是正向的；(b)需要使用BamH I限制性內切酶對質粒進行酶切；(c)將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；(d)用SP6 RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。所述步驟(4)按照如下步驟進行(a)將大鼠用O. 4戍巴比妥納深麻后，經左心室插管至升王動脈，用O. Olmol/ L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4 %多聚甲醛灌注固定；所述的O. 01mol/L DEPC-PBS是2. 9克磷酸氫二鈉，O. 29克磷酸二氫鈉，9. O克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為O. 1%的DEPC Iml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4% 的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500. Oml 的O. 2mol/L PB緩沖液定容至IOOOml ;所述O. 2mol/L PB緩沖液是用29. 01克磷酸氫二鈉， 2. 96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml配制而成；(b)取材后進行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時；(c)將固定好的組織進行切片將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存于O. 01mol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用；(d)將切好的組織片用O. 01mol/L的DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5-10分鐘；(e)將上述清洗過的片子用5x SSC清洗2次，室溫，每次5_10分鐘；所述5x SSC 是由20x SSC用超純水稀釋的，20x SSC為一種檸檬酸緩沖液；(f)將5x SSC清洗后的組織片浸入預雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1_2小時； 所述預雜交液是由5ml的去離子甲酰胺,2. 5ml的20x SSC溶液，200μ I的50x Denhardt’s 溶液，50 μ I的濃度為200mg/ml的Heparin溶液，100 μ I的濃度為10mg/ml的tRNA溶液， 100 μ I的濃度為10%的CHAPS溶液，100 μ I的濃度為10 %的Tween-20溶液，100 μ I的濃度為0. 5mol/L的pH8. O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50x DenhardtJ s為一種常用的雜交試劑；所述200mg/ml的Heparin為200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為IOmg的tRNA粉末溶于Iml的 DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS為Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的Tween-20為100 μ I的Tween-20溶于900 μ I的DEPC-H20中配制而成；所述0. 5mol/L的pH8. O的EDTA為186. Ig 二水乙二胺四乙酸二鈉加入800ml的DEPC-H20中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調pH值至8. O然后定容至IL配制而成高壓滅菌備用； 所述DEPC-H2O為IL超純水加入體積百分比為0. 1%的DEPC 1ml，放置過夜并高壓滅菌處理后的水；(g)將預雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時；所述雜交液是上述預雜交液中加入終濃度為I. Oug/ml的cRNA探針配置成的；(h)雜交后用Ix SSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘；⑴用2x SSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10-15分鐘；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37。。，I 次，每次 30-40 分鐘；(k)用2x SSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；(I)用0. Olmol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；所述
0.01mol/L PBS是2. 9克磷酸氫二鈉，0. 29克磷酸二氫鈉，9. 0克氯化鈉用超純水定容至IL 配置的磷酸緩沖液；(m)按I : 2000的抗體效價,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體,對洗滌后的組織切片進行孵育，室溫，放置過夜；(n)將經過上步抗體孵育的組織片用0. 01mol/L PBS洗滌，于室溫，清洗3次，每次 10-15分鐘；(O)用TS9. 5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述TS9. 5為是由終濃度為摩爾濃度為0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩爾濃度為0. lmol/L NaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/LMgCL2用超純水配制而成；(p)將上述切片放于NBT-BCIP反應液中避光孵育4 6小時，在此過程中觀察切片呈色強度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產的呈色反應液；(q)當呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘；(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；(S)晾干切片，再經過二甲苯脫色，封片，以備觀察。本發明的有益效果是本發明對活體動物建立模型后進行灌注、取材、切片，通過地高辛標記的cRNA探針與組織中EAAT2基因的mRNA發生特異性的結合，從而方便、準確的觀察到組織中EAAT2基因mRNA水平的變化。本發明使用的EAAT2的探針序列，對EAAT2基因mRNA的顯示有明確的特異性，實現了對EAAT2基因mRNA水平的顯示作用。


圖I為本發明的EAAT2在海馬的分布X4倍圖；圖2為本發明的EAAT2在海馬的分布X20倍圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步詳細描述參見圖I和圖2，EAAT2基因cRNA原位雜交的探針的設計方法，按照如下步驟(I)根據EAAT2的Gene bank序列我們設計了 EAAT2特異的引物，并且此對引物擴增出278bp的EAAT2片段作為EAAT2特異的探針序列；(2)構建EAAT2的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；⑶EAAT2的cRNA原位雜交探針；(4)檢測EAAT2的cRNA探針的原位雜交。探針的設計
根據EAAT2的Gene bank序列我們設計了 EAAT2特異的引物，并且此對引物擴增出278bp的EAAT2片段作為EAAT2特異的探針序列。EAAT2特異的引物如下上游引物5' CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3'；下游引物5' AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3'。EAAT2特異的探針序列5 ' AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAATGAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCG TTATCAAGAAGGGCCTGGAGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTTATTGCTTTCGGCAT TGCCATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCAAGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATGAAG TTAGTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCCTGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAG GACTT 3' EAAT2的cRNA原位雜交的探針質粒的構建I.將大鼠的cDNA用設計的弓I物進行PCR擴增。2.將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收。3.將回收后的產物于4°C與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接。4.將連接好的質粒轉化細菌后，搖菌培養送金斯瑞公司進行測序。EAAT2的cRNA原位雜交探針的制備I.測序正確后，經判斷確認EAAT2探針序列插入載體的順序是正向的。2.需要使用BamH I限制性內切酶對質粒進行酶切，3.將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收。4.用SP6 RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記，體外轉錄的試劑盒(Ambion MEGAscript)是Ambion公司的產品。 EAAT2的cRNA探針的原位雜交檢測I.將大鼠用O. 4%戊巴比妥鈉深麻后，經左心室插管至升主動脈，用O. Olmol/L的 DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。2.取材后進行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時。3.將固定好的組織進行切片將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存于O. Olmol/L DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用。4.將切好的組織片用O. Olmol/L DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5分鐘。5.將上述清洗過的片子用5x SSC清洗2次，室溫，每次5分鐘。6.將5x SSC清洗后的組織片浸入預雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育I小時。7.將預雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時。8.雜交后用Ix SSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘。9.用2x SSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘。10.用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，I 次，每次 30 分鐘。11.用2x SSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘。12.用0. 01mol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘。13.加入抗體Anti-Digoxigenin-AP對洗滌后的組織切片進行孵育，于室溫，放置過夜。14.將經過上步抗體孵育的組織片用O.Olmol/L PBS的洗滌，于室溫，清洗3次，每次10分鐘。15.用TS9. 5洗滌上述O. 01mol/L PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15分鐘。16.將上述切片放于NBT-BCIP反應液中避光孵育4 6小時，在此過程中觀察切
片呈色強度。17.當呈色完成后，將切片用0. 01mol/L PBS清洗3次，室溫，每次10分鐘。18.將上述洗滌后切片表于載玻片上。19.晾干切片，再經過二甲苯脫色，封片，以備觀察。所用試劑
TIANGEN膠回收試劑盒公司:天根貨號DP214-02
兩端具有T7，SP6啟動子的載體公司invitrogen貨號K466001
BamH I限制性內切酶公司Takara貨號D1010A
SP6 RNA聚合酶試劑盒公司Ambion貨號ΑΜ1330
20x SSC公司invitrogen貨號ΑΜ9763
50x Denhardt’ s公司invitrogen貨號750018
Heperine公司sigma貨號Η3393
tRNA公司sigma貨號R8759
CHAPS公司sigma貨號C9426
Tween-20公司sigma貨號Ρ9416
Anti-Digoxigenin-AP公司Roche貨號:11093274910
以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，雖
然本發明已以較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用上述揭示的方法及技術內容作出些許的更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種EAAT2基因cRNA原位雜交的探針，其特征在于，該探針的序列為5 ' AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAATGAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCGTTA TCAAGAAGGGCCTGGAGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTTATTGCTTTCGGCATTGC CATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCAAGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATGAAGTTA GTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCCTGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAGGACT T 3'。
2.如權利要求I所述探針的設計方法，其特征在于(1)根據EAAT2的Genebank序列我們設計了 EAAT2特異的引物，并且此對引物擴增出 278bp的EAAT2片段作為EAAT2特異的探針序列；(2)構建EAAT2的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；(3)EAAT2的cRNA原位雜交探針；(4)檢測EAAT2的cRNA探針的原位雜交。
3.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(I)中EAAT2特異的引物是上游引物是 5' CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3'；下游引物是 5' AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3'。
4.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進行(a)將大鼠的cDNA用設計的引物進行PCR擴增；(b)將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；(c)將回收后的產物于4°C與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接；(d)將連接好的質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序。
5.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進行(a)步驟(2)得到的細菌測序正確后，經判斷確認EAAT2探針序列插入載體的順序是正向的；(b)需要使用BamHI限制性內切酶對質粒進行酶切；(c)將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；(d)用SP6RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。
6.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進行(a)將大鼠用O.4%戍巴比妥納深麻后，經左心室插管至升王動脈，用O. 01mol/L的 DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的O. 01mol/L DEPC-PBS 是2. 9克磷酸氫二鈉，O. 29克磷酸二氫鈉，9. O克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為O. I %的DEPC Iml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4%的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500. Oml的 O. 2mol/L PB緩沖液定容至IOOOml ;所述O. 2mol/L PB緩沖液是用29. 01克磷酸氫二鈉， 2. 96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml配制而成；(b)取材后進行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時；(c)將固定好的組織進行切片將組織切成25 30μ m組織切片，并將切好的切片保存于O. 01mol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用；(d)將切好的組織片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5_10分鐘；(e)將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5x SSC是由 20x SSC用超純水稀釋的，20x SSC為一種檸檬酸緩沖液；(f)將5xSSC清洗后的組織片浸入預雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1-2小時；所述預雜交液是由5ml的去離子甲酰胺,2. 5ml的20x SSC溶液,200 μ I的50x DenhardtJ s 溶液，50 μ I的濃度為200mg/ml的Heparin溶液，100 μ I的濃度為10mg/ml的tRNA溶液， 100 μ I的濃度為10 %的CHAPS溶液，100 μ I的濃度為10 %的Tween-20溶液，100 μ I的濃度為O. 5mol/L的pH8. O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50x DenhardtJ s為一種常用的雜交試劑；所述200mg/ml的Heparin為200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為IOmg的tRNA粉末溶于Iml的 DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS為Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的Tween-20為100 μ I的Tween-20溶于900 μ I的DEPC-H20中配制而成；所述O. 5mol/L的pH8. O的EDTA為186. Ig 二水乙二胺四乙酸二鈉加入800ml的DEPC-H20中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調pH值至8. O然后定容至IL配制而成高壓滅菌備用； 所述DEPC-H2O為IL超純水加入體積百分比為O. 1%的DEPC 1ml，放置過夜并高壓滅菌處理后的水；(g)將預雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時； 所述雜交液是上述預雜交液中加入終濃度為I. Oug/ml的cRNA探針配置成的；(h)雜交后用IxSSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘；(i)用2xSSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10-15分鐘；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，I 次，每次 30-40 分鐘；(k)用2x SSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；(I)用O. Olmol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；所述O. 01mol/L PBS是2. 9克磷酸氫二鈉，0. 29克磷酸二氫鈉，9. O克氯化鈉用超純水定容至IL配置的磷酸緩沖液；(m)按I : 2000的抗體效價,在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體,對洗漆后的組織切片進行孵育，室溫，放置過夜；(η)將經過上步抗體孵育的組織片用0. Olmol/L PBS洗滌，于室溫，清洗3次，每次 10-15分鐘；(ο)用TS9. 5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述 TS9. 5為是由終濃度為摩爾濃度為0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩爾濃度為0. lmol/L NaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/LMgCL2用超純水配制而成；(P)將上述切片放于NBT-BCIP反應液中避光孵育4 6小時，在此過程中觀察切片呈色強度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產的呈色反應液；(q)當呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘；(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；(S)晾干切片，再經過二甲苯脫色，封片，以備觀察。
全文摘要
本發明公開了一種EAAT2基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法，按照如下步驟(1)根據EAAT2的Gene bank序列我們設計EAAT2特異的引物，并且此對引物擴增出278bp的EAAT2片段作為EAAT2特異的探針序列；(2)構建EAAT2的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；(3)制備EAAT2的cRNA原位雜交探針；(4)檢測EAAT2的cRNA探針的原位雜交。
文檔編號C12N15/11GK102605051SQ20121002202
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月1日 優先權日2012年2月1日
發明者李俊杰, 李霄, 竇科峰, 趙威 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學