專利名稱：一種用改良stela法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法。
背景技術(shù)：
端粒(Telomere)是一段DNA重復(fù)序列，位于染色體末端，可以保持染色體的完整性。1990年，Harley等證實(shí)端粒的長度可以隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而逐漸變短。這一發(fā)現(xiàn)在端粒和細(xì)胞衰老之間建立了緊密的聯(lián)系。端粒重復(fù)序列的長度可能起著一種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細(xì)胞的壽命明顯不同,其端粒的長度也不相同。是隨著年齡的增長而縮短。來自新生兒的體細(xì)胞可在體外傳代培養(yǎng)80—90代，來自70歲老人的體細(xì)胞在體外只能傳代培養(yǎng)20 30代，而且端粒的重復(fù)序列長度也縮短很多。端粒酶(Telomerase)是細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長的一種酶,是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端。端粒在不同物種細(xì)胞中對于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒(縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限)，從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。但是，在正常人體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到相當(dāng)嚴(yán)密的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)證明，體細(xì)胞里沒有端粒酶的活性，所以體細(xì)胞每分裂一次，端粒也就縮短一些。隨著細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，端粒的長度將越來越短，當(dāng)達(dá)到一個臨界長度時，細(xì)胞染色體會失去穩(wěn)定性，使細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂而進(jìn)入凋亡(apoptosis)。端粒的長度決定了細(xì)胞的壽命，因此可用丟失的端粒重復(fù)序列的長度來推測細(xì)胞有絲分裂的次數(shù)，所以端粒被稱為分子鐘或有絲分裂鐘(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色體穩(wěn)定性,細(xì)胞的衰老和死亡外,還與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在人體內(nèi)的各種細(xì)胞中，生殖細(xì)胞和干細(xì)胞染色體的末端比體細(xì)胞染色體的末端長出幾千個堿基對，并且在這兩類細(xì)胞里能檢測到端粒酶的活性。除此之外，其他所有體細(xì)胞里都未測得端粒酶的活性。惟一的例外是來源于體細(xì)胞的惡性腫瘤細(xì)胞卻又重新出現(xiàn)了端粒酶活性，發(fā)揮其合成端粒重復(fù)序列的功能，以補(bǔ)償正常的端粒序列丟失，使端粒的重復(fù)序列不會達(dá)到導(dǎo)致細(xì)胞死亡的臨界長度，從而獲得細(xì)胞的“永生性”(immortality)。這樣，惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)或體外都能無限制地分裂增殖。上文提到的端粒長度縮短指的是所有染色體末端端粒的平均長度。近年來，很多實(shí)驗(yàn)觀察開始質(zhì)疑端粒的平均長度與衰老之間的聯(lián)系。一些研究小組提出了于端粒相關(guān)的細(xì)胞衰老是由單一或某幾個短端粒引起的觀點(diǎn)。這一觀點(diǎn)的正確性也被越來越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所證明。目前，研究端粒長度主要是應(yīng)用TRF法(mean length of telomere restrictionfragments)。但是，這個方法測量的是細(xì)胞內(nèi)端粒的平均長度，而無法測量其中短端粒所占的比例，因此有很大的局限性。單個端粒長度分析(STELA, single telomere length analysis)是在單個染色體水平上基于PCR的端粒測量方法。第I步是“telorette” (在與端粒G懸突不配對的20個核苷酸后有7個同源的TTAGGG接頭)的退火.第2步是將“telorette”連接到富C鏈5末端.此后用識別telorette尾巴的teltail引物同亞端粒上游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在研究這個區(qū)域的多態(tài)現(xiàn)象時，上游引物可以是特異的等位基因。STELA最先被用于分析人類X染色體短臂。最近對秀麗隱桿線蟲的端粒和沃納綜合征的成纖維細(xì)胞的端粒的研究表明，在單個染色體水平上STELA的分析有很高的可靠性。STELA的PCR擴(kuò)增具有高度的端粒特異性，用STELA測量人類成纖維細(xì)胞的XpYp端粒長度始終比TRF的平均值小，且這兩者成線性關(guān)系，說明STELA沒有包括亞端粒長度。另外，有一些手段可以比較精確的研究染色體中短端粒的情況，例如基于熒光原位雜交(Q-FISH)的技術(shù)。但是這些技術(shù)手段都或多或少存在一些不足之處，無法作為高效精確地研究或檢測最短端粒的合適手段。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本專利涉及一種改良的STELA法，可以有效快速地檢測研究細(xì)胞染色體短端粒長度和所占的比例。技術(shù)方案
一種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法，其特征在于按步驟實(shí)現(xiàn)
A、限制性內(nèi)切酶消化細(xì)胞中提取的gDNA經(jīng)過MseI和NdeI兩種限制性內(nèi)切酶酶切(摩爾比I :1)；
B、Linker寡核苷酸連接Linker通過互補(bǔ)配對連接到各個gDNA片斷的5’-TA-3’ ；其中 linker 為 11+2-mer oligo 和 42-mer oligo ；ll+2-mer oligo 的序列為 5，_TAC CCGCGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGGTGC GGA CGC GGG-3 ；
C、Telorette片斷的連接telorette被連接到端粒的5，端；其中Telorette序列如下，可任選擇其中一個序列
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3，；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3，；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3，。D、PCR 擴(kuò)增端粒片段，其中引物為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3，，5，-TGCTCC GTG CAT CTG GCA TC-3，-標(biāo)記物。作為一種優(yōu)化方式，其步驟為
A、培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞BJ和人肺成纖維細(xì)胞MR-90，并分離上述兩種細(xì)胞的生長期細(xì)胞和衰老細(xì)胞的gDNA ；
B、取步驟A中的gDNAI ug,加入Msel/Ndel雙酶切(摩爾比I :1),同時加入IxNEBuf fer2 和 Ix BSA, 37 1反應(yīng)過夜；
C、10ng 消化后的 gDNA 片斷于 65 °C加入 50 uM 42-mer oligo 和 50 uM ll+2-meroligo，反應(yīng)體積為7 ul ;之后將反應(yīng)溫度由65 °〇于I h內(nèi)降至16 V ;加入20 U T4 DNA連接酶，Ix NEBuffer2和Ix ATP,于16 1反應(yīng)過夜；其中 11+2-mer oligo 的序列為 5’ -TAC CCG CGT CCG C-3’ ；
42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGCGGG-3 ；
D、在步驟(C)中反應(yīng)體系中補(bǔ)加20 U T4 DNA連接酶和I(T3 uM Telorette，并補(bǔ)充相應(yīng)的Ix NEBuffer2和Ix ATP，使反應(yīng)體積達(dá)到25 ul，35 1反應(yīng)過夜，然后于65 °C反應(yīng)20 min,滅活T4 DNA連接酶,獲得DNA ;其中Telorette序列如下,可任選擇其中一個序列5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3，；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3，；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；
5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；
5， -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3，。E、PCR反應(yīng)體積為 12 ul，模板DNA 50 pg(步驟(3)獲得)，Ix FailSafe PCR PreMixH, 0. I uM teltail 引物和 Adaptor 引物，I. 25 U FailSafe enzyme ;PCR 條件為
權(quán)利要求
1.一種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法，其特征在于按步驟實(shí)現(xiàn) A、限制性內(nèi)切酶消化細(xì)胞中提取的gDNA經(jīng)過MseI和NdeI兩種限制性內(nèi)切酶酶切摩爾比1:1; B、Linker寡核苷酸連接Linker通過互補(bǔ)配對連接到各個gDNA片斷的5’-TA-3’ ；其中 linker 為 11+2-mer oligo 和 42-mer oligo ;ll+2_mer oligo 的序列為 5，_TAC CCGCGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGGTGC GGA CGC GGG-3 ； C、Telorette片斷的連接telorette被連接到端粒的5，端；其中Telorette序列如下，可任選擇其中ー個序列5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3’ ； D、PCR擴(kuò)增端粒片段，其中引物為 5’-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA-3，，5，-TGC TCCGTG CAT CTG GCA TC-3，-標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法，其特征在于按步驟實(shí)現(xiàn)A、提取gDNA ； B、取步驟A中的gDNAI ug,加入Msel/Ndel摩爾比1:1雙酶切，同時加入IxNEBuf fer2 和 Ix BSA, 37 °C 反應(yīng)過夜； C、10ng 消化后的 gDNA 片斷于 65 °C加入 50 uM 42-mer oligo 和 50 uM ll+2-meroligo，反應(yīng)體積為7 ul ;之后將反應(yīng)溫度由65で于I h內(nèi)降至16 V ;加入20 U T4 DNA連接酶，Ix NEBuffer2和Ix ATP,于16 °C反應(yīng)過夜； 其中 11+2-mer oligo 的序列為 5，-TAC CCG CGT CCG C-3，；42-mer oligo 的序列為 5，-TGT AGC GTG AAG ACG ACA GAA AGG GCG TGG TGC GGA CGCGGG-3 ； D、在步驟(C)中反應(yīng)體系中補(bǔ)加20U T4 DNA連接酶和I(T3 uM Telorette，并補(bǔ)充相應(yīng)的Ix NEBuffer2和Ix ATP，使反應(yīng)體積達(dá)到25 ul，35で反應(yīng)過夜，然后于65で反應(yīng)20 min,滅活T4 DNA連接酶,獲得DNA ;其中Telorette序列如下,可任選擇其中ー個序列5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CCT AAC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCT AAC CCT-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC CTA ACC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCC TAA CCC-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA ACC CTA-3’ ；5’ -TGC TCC GTG CAT CTG GCA TCA CCC TAA-3’ ； E、PCR反應(yīng)體積為 12 ul，模板 DNA 50 pg (步驟(3)獲得)，1x FailSafe PCR PreMixH, 0.1uM teltail 引物和 Adaptor 引物，1.25 U FailSafe enzyme ;PCR 條件為
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法，其特征在于步驟(E)中所述的標(biāo)記物包括放射性標(biāo)記物和非放射性標(biāo)記物，放射性標(biāo)記物包括同位素32P或35S ;非放射性標(biāo)記物包括生物素、地高辛、異硫氰酸熒光素、羅丹明、金或銀。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法，其特征在于其中步驟(A)中g(shù)DNA來自于人皮膚成纖維細(xì)胞BJ和人肺成纖維細(xì)胞MR-90的生長期細(xì)胞和衰老細(xì)胞的gDNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法，其特征在于步驟(E)獲得PCR結(jié)束后，以免疫印跡法檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用改良STELA法測細(xì)胞中最短端粒長度的方法。本發(fā)明涉及一種改良的STELA法，可以有效快速地檢測研究細(xì)胞染色體短端粒長度和所占的比例。該改良STELA法與傳統(tǒng)的STELA法相比，在連接telorette之前多了一步連接反應(yīng)。其可以檢測最短端粒長度，而現(xiàn)有技術(shù)只能檢測平均端粒長度，擴(kuò)大應(yīng)用范圍，同時更加準(zhǔn)確可以簡便，快速，直觀的測量樣品中最短端粒的長度以及其所占的比例。
文檔編號C12Q1/68GK102618633SQ20121002370
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日
發(fā)明者葉亞東, 葉汝章, 夏琰, 張娟, 朱文華, 楊紫俊, 滕凌, 潘鸝, 胡芳, 路易斯伊格納羅, 霍世元 申請人:常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司