專利名稱：自然殺傷細胞的增殖方法
技術領域：
本發明涉及獲得高收率的自然殺傷細胞(Natural Killer cell，NK細胞)的增殖 方法。進一步涉及包括在外周血淋巴細胞存在的條件下，在含有抗-CD3抗體及白介素蛋白 的培養基中培養自然殺傷細胞的步驟的自然殺傷細胞的增殖方法。
背景技術：
自然殺傷細胞(以下有簡稱為“NK細胞”的情況)是擔當免疫反應角色的淋巴細 胞譜系細胞。該細胞具有多種功能，特別地具有很強的殺死腫瘤細胞的活性，因此被認為是 體內清除已經腫瘤化的或正在腫瘤化的異常細胞的免疫監視系統中的重要成員。因此，將 該細胞有效地用于腫瘤治療或用于去除被認為是腫瘤的發生來源的病毒感染細胞的研究 很早就開始了。存在于健康人體內的大部分NK細胞為非活性狀態。很多研究人員進行了從健康 人的血液中或非活性的患者血液中將NK細胞活化的研究。在體外被活化的NK細胞的高細胞毒性使其具有了作為免疫細胞治療制劑的可能 性，并通過體外或通過動物實驗來確定了其對各種癌癥的治療可能性。一般，通過利用腫瘤 細胞系來確認試管內的細胞毒性，對血癌、肝癌、肺癌、腎癌、小兒神經癌及皮膚癌等多種癌 癥顯示出了一定的細胞毒性。特別地，對血癌和小兒神經癌顯示出了肯定性的臨床及非臨 床治療效果。雖然具有這種在臨床上的應用可能性，但在體內的NK細胞的數量并不多，而 為了達到治療效果，所需的有效NK細胞的數量很多，因此即使是通過白細胞分離法 (Leukapheresis)來收集大量的白細胞，一次采血也只能用于一兩次的治療。在細胞療法(Celltherapy)中充足的細胞數量(Celldose)和反復給藥是非常重 要的因素，但NK細胞的增殖很弱，無法提供充足數量的細胞進行給藥，這成為將其應用于 臨床的最大的問題，為克服上述情況，有很多關于對NK細胞增殖的研究，但還沒有達到適 用于臨床的水平。一般通過IL-2或除此之外的細胞因子及化合物來對NK細胞進行增殖的 研究，只能夠增加到初期分離的NK細胞數量的3 10倍左右。1990年代后，對自然殺傷細胞的增殖在各個方面進行了研究。這些方面包括了 用于現有T細胞增殖/活性的IL-2的研究；還包括有IL-15 (Dunne J等，Immunology, vol. 167 :3129. 2001 ；SA Perez,等，Blood, vol. 106 :158,2005)、LPS (MR Goodier 等， Immunology 165 :139,2000),禾Ij 用作為刺激 CD3 的 0KT-3 抗體(Condiotti R,等， Experimental Hematology 29 :104，2001)，以單獨或結合的使用形式來增殖自然殺傷細胞 的研究。但上述這些僅是通過對一直使用的IL-2的變體及演化的形態找到了新的增殖物 質，但并沒能夠提供具有突破意義的增殖方法。并且，還有關于有些研究人員將腫瘤細胞株用作飼養細胞(feeder cell)來增殖 NK細胞的報道，但大部分將腫瘤細胞株用作飼養細胞等，這些方法對于臨床應用中非常重 要的安全性沒有保障。
因此，本發明人確認了具有下述優點，完成了本發明，即通過將失活的自體外周血 細胞作為飼養細胞來確保了安全性，通過同時處理0KT-3抗體和IL-2來維持自然殺傷細胞 的殺傷能力，并且能夠顯著地提高增殖率。

發明內容
本發明的目的在于提供一種以高效率對自然殺傷細胞增殖的方法。為達到上述目的，本發明提供包括在外周血淋巴細胞存在的條件下、在含有 抗-CD3抗體及白介素蛋白的培養基中培養自然殺傷細胞的步驟的，以在短時間內能夠爆 發性地增殖高純度的自然殺傷細胞的方法。在自然殺傷細胞的培養中本發明優選例為，將自體外周血淋巴細胞(PBL， peripheral blood lymphocyte)作為飼養細胞，對OKT-3抗體和IL-2同時進行處理。進一步地，上述方法包括在培養物中除去抗-CD3抗體的步驟，及在含有白介素蛋 白的培養基內加入除去上述抗-CD3的培養液的步驟。此時，用于追加培養而加入的除去了 抗-⑶3抗體的培養液，優選為含有IX IO5至3Χ IO6細胞/孔濃度的自然殺傷細胞。


圖1為從健康人體內的外周血中分離的初期NK細胞的表面形態的分析結果。圖2為通過本發明方法進行培養獲得的NK-細胞的表面形態的分析結果。圖3為確認了通過本發明方法進行培養獲得的NK-細胞的腫瘤殺傷能力的結果。圖4為確認了通過本發明方法進行培養獲得的NK-細胞的增殖能力的結果。圖5為對在有或無飼養細胞外周血單核細胞、作為抗⑶3抗體的0ΚΤ-3及IL_2的 各種培養條件下進行培養獲得的NK-細胞的增殖能力的比較結果。圖6為改變自然殺傷細胞接種濃度來進行培養獲得的NK-細胞的增殖能力的比較 結果。
具體實施例方式下面將對本發明詳細說明。本發明第一個觀點為有關包括在外周血淋巴細胞存在的條件下，在含有抗-CD3 抗體及白介素蛋白的培養基中培養NK細胞的步驟的自然殺傷細胞的增殖方法。本發明的上述自然殺傷細胞的增殖方法沒有特別地限定，例如可通過包括下列步 驟進行。(i)從人體外周血中分離外周血淋巴細胞及自然殺傷細胞的步驟；(ii)將沒有分離自然殺傷細胞的自體外周血淋巴細胞進行失活的步驟(制備經 過了失活的飼養細胞的步驟)；(iii)在外周血淋巴細胞存在的條件下，在含有抗-CD3抗體及白介素蛋白的培養 基中培養自然殺傷細胞的步驟；(iv)從上述培養物中除去抗-⑶3抗體的步驟；及(ν)將上述除去了抗-CD3抗體的培養液加入到含有白介素蛋白的培養基中進行 追加培養的步驟。
在正常的血液中含有約10 15%的NK細胞，與非自體(non-self)反應時具有 很強的殺傷能力。NK細胞對于被各種病毒感染的細胞或細菌的侵入及非正常細胞的生成， 以非特異性地即刻反應去除異物。但是存在于體內的NK細胞數量并不多，為了得到治療效 果，需要很多的有效的NK細胞，因此實際情況為對于有效的NK細胞增殖方法有必要進行研對于自然殺傷細胞的增殖方法大致可分為兩種。僅將NK細胞純粹地分離后，使用 飼養細胞通過適當的刺激來達到增殖的方法，另一種是在整體外周血淋巴細胞或外周血單 核細胞(PBMC !peripheral blood mononuclear cell)中選擇性地對NK細胞增殖，以獲得 相對較多的NK細胞。通過不經過自然殺傷細胞的分離，從外周血淋巴細胞中選擇性地對自然殺傷細胞 增殖的方法而得到的細胞與純粹的自然殺傷細胞系相比，細胞殺傷能力下降，不僅存在純 粹的自然殺傷細胞，由于還存在τ細胞，因此如果不通過自體主要組織相容性復合物(MHC) 分子去除識別自體(self)和非自體(non-self)的T細胞，則會有只能限于自體移植的問題。本發明是有關對前者的已分離的自然殺傷細胞(NK細胞)進行增殖的方法，本發 明中的增殖方法也是以使用飼養細胞為特征的。從外周血中分離自然殺傷細胞的方法可以采用本領域人員公知的常用方法，也可 以在市場上購買使用。本發明的一個具體例中使用了購買的Rosettes印NK細胞富集混合 物(Stem cell technologies,15065)。另一方面，培養飼養細胞雖然沒有讓其進行分裂增殖，但具有代謝活性，通過生產 各種代謝物質來幫助目標細胞增殖的細胞，將最初移植的細胞稱為“飼養細胞”。本發明中 還將‘feeder cell’稱為飼養細胞。本發明中所使用的飼養細胞，例如有導入了基因的動物細胞系或各種對細胞因子 及化合物進行了處理的外周血淋巴細胞(PBL)、自體或非自體的外周血淋巴細胞(PBL)、 T-細胞、B-細胞或單核細胞等。最優選為使用自體外周血淋巴細胞(PBL)。將上述用作飼養細胞的自體外周血淋巴細胞經失活處理后使用，以確保安全性。 作為失活方法可采用業界公知的常用方法，例如可以使用照射伽馬線的方法。這種失活的 飼養細胞包括純化的T-細胞。像本發明這樣使用飼養細胞的增殖方法是將自然殺傷細胞純粹分離后再進行增 值的方法，具有之后也可以繼續只增殖純粹的自然殺傷細胞的優點。并且，本發明的增殖方法的特征為在含有抗-CD3抗體及白介素蛋白的培養基中 培養自然殺傷細胞。CD3抗體是指對與T細胞抗原受體(TCR)進行結合后形成抗原識別復合體的分子 系的CD3抗原進行特異性反應的蛋白，CD3分子與T細胞抗原受體相比，細胞內區域長，起 到將抗原識別信號傳遞到細胞內的作用。本發明可以使用的抗-CD3抗體有，如0KT_3、UCHTl、HIT3a等，優選為0KT-3抗體。白介素anterleukin，IL)蛋白是淋巴細胞或單核及巨噬細胞等免疫細胞生成的 蛋白特性的生物活性物質的總稱，指細胞因子內的一群分子種系。本發明能夠使用的白介素蛋白例如有，IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21等，優選為IL-2蛋白。本發明的培養方法為在一般用于培養動物細胞的如AIM-V培養基、RIMI1640、 CellGro SCGM、X-VIV020等培養基上，加入從人體外周血分離的NK細胞及外周血淋巴細 胞，在該培養物中加入抗CD3抗體及白介素蛋白進行培養。本發明的一個具體例中加入了 0KT-3抗體和IL-2進行了培養。加入的0KT-3抗體的濃度為0. 1 lOOng/ml，優選為約使 用10ng/ml，IL-2的濃度為10 2000U/ml，優選為約使用500U/ml。并且，這里也可以加入血清或血漿和追加地加入對淋巴細胞的增殖起到支持的增 殖因子進行培養。加入到培養基內的血清或血漿的種類沒有特別的限制，因此可以使用市 售的來自各種動物的血清或血漿，但作為來自人體的血清或血漿，優選其本人的血清或血 漿。也可以使用本領域技術人員公知的方法，例如有加入由外周血單核細胞來增殖淋巴細 胞的細胞激素的組合或加入對淋巴細胞增殖起到刺激的植物血凝素等。另一觀點認為，本發明提供了能夠使自然殺傷細胞顯著增殖的最優選的自然殺傷 細胞的培養濃度。如前面所述，對本發明的培養更加具體的敘述為，本發明包括首先在外周血淋巴 細胞存在的條件下、在含有抗-CD3抗體及白介素蛋白的培養基中培養分離的自然殺傷細 胞的步驟；在上述培養物中除去抗-CD3抗體的步驟；及在含有白介素蛋白的培養基內加入 上述除去了抗-CD3抗體的培養液的追加培養步驟。此時，就去除了抗-CD3抗體的培養液加入到含有白介素蛋白的培養基中進行的 追加培養來說，接種于培養基的自然殺傷細胞的濃度對增殖率有很大的影響。優選為以1 X IO5至1 X IO6細胞/孔的濃度進行接種，更優選為以1 X IO5至3 X IO6 細胞/孔的濃度進行接種。特別地，通過實驗確認了以2X IO5細胞/孔的濃度接種時，培 養后第14天時顯示出了約900倍的增殖率。本發明中通過以適當的自然殺傷細胞濃度，使用飼養細胞，并同時處理如0KT-3 抗體的抗-CD3抗體和如IL-2的白介素蛋白，與僅使用飼養細胞或僅通過0KT-3抗體刺激 的現有研究相比，能夠在短時間內更顯著地增殖高純度的自然殺傷細胞。另一方面，本發明是有關通過上述方法得到的自然殺傷細胞。下面對根據上述方 法增殖培養的自然殺傷細胞的表面形態特征進行說明。健康人的外周血分離的初期NK細胞的90%以上具有⑶3-/⑶56+的表面形態。將 其通過本發明方法進行增殖培養時，在第7天時⑶3+T細胞會相對地減少，而⑶3-/⑶56+NK 細胞會增多，在培養的第10天時基本上所有的CD3+T細胞幾乎全部消失，95%以上的細胞 全為表現CD16的活化的NK細胞。即、能夠在短時間內獲得具有CD16+的表面形態的高純 度的自然殺傷細胞。并且通過利用大量可臨床應用的活化的NK細胞，能夠制造出有效去除被認為是 腫瘤發生來源的病毒感染細胞的細胞治療劑。實施例下面通過實施例來進一步詳細說明本發明。這些實施例僅是為了舉例說明本發 明，這些實施例并不能夠限制本發明的范圍，這是具有本領域公知常識的技術人員所公知 的。實施例1 飼養細胞的制備及自然殺傷細胞(NK細胞)的分離
(1)制備飼養細胞取健康人的外周血20ml，將采集的5ml血放入15ml體積容量的錐形管中。在血液 中追加加入5ml生理鹽水，用吸液管攪拌均勻。在新的15ml體積容量的錐形管中加入5ml 淋巴細胞分離液(ficoll) (GE healthcare，Uppsala，17-1440-03)，在裝有淋巴細胞分離液 的15ml錐形管上小心地加上上述經過攪拌的(稀釋的)血液后，以2000rpm的轉速在常溫 下進行30分鐘離心分離(韓一集團，韓國，Uni0n32-R)。取出淋巴細胞分離液和血漿之間生成的免疫細胞層并移至新的15ml體積容量的 錐形管中后，添加HBSS至10ml，將細胞混合均勻后以1200rpm的轉速進行10分鐘的離心 分離。上層液經真空抽吸被去除干凈。然后再加入IOml的HBSS反復進行離心分離操作過程。加入Iml的含有5 %細胞培養液hAB血清(Sigma，H4522)的AIM-V培養基 (Invitrogen, 12055091)使細胞散開，將IOul上述細胞溶液移到微管，加入90ul臺盼藍 (Gibco)后用吸液管混合均勻，用臺盼藍(Gibco，15250-061)染色劑進行染色后，利用倒置 顯微鏡(Olympus，CK2-TRC-2)觀察并加入細胞培養液稀釋至細胞數達到5X IO6細胞/ml。為了進行FACS分析，將Iml的細胞移入5ml的試管中，剩余的細胞用2000cGy的 伽馬射線(Y-發射儀，MDS Nordion, Gammacel 13000Elan)照射，進行失活處理來制備飼養 細胞。(2) NK細胞的分離在之前從健康人體內采集的15ml血液移至新的50ml的錐形管中，加入750ul的 Rosettesep NK細胞富集混合物(Stemcell technologies, 15065)后，在常溫下緩慢地旋轉 20分鐘進行反應。在結束了上述反應的血液中追加15ml生理鹽水，并混合均勻。分別在3個新的15ml錐形管中各加入淋巴細胞分離液5ml，往加入了淋巴細胞 分離液的15ml錐形管中分別小心地加入混有上述生理鹽水的IOml血液后，在常溫下以 2000rpm的轉速進行30分鐘離心分離。離心分離結束后，取出淋巴細胞分離液和自體血漿 液之間的所有的自然殺傷細胞并移入新的15ml錐形管中，加入HBSS至10ml，以1500rpm的 轉速追加進行10分鐘離心分離。徹底去除上層溶液，再加入HBSS至10ml，以使細胞完全散 開，以1200rpm的轉速進行10分鐘離心分離。用真空去除上層溶液，加入Iml細胞培養液 使細胞充分散開。從細胞稀釋液中取IOul移入微管中，加入40ul的臺盼藍后，用吸液管混合均勻 后，用臺盼藍進行染色并測定細胞數量，同時用細胞培養液進行稀釋至細胞數達到IXlO6 細胞/ml。(3)分離的初期NK-細胞的特性對上述分離的NK細胞中的抗-人⑶3-FITC和抗-人⑶56-APC抗體進行染色并 分析了表面形態。結果為，如從圖1可知，初期分離的90%以上的細胞為CD3-/CD56+的NK 細胞。實施例2 對已分離的自然殺傷細胞的培養在12-孔板(Falcon)上培養初期細胞。將實施例1_(1)中準備的500ul飼養細 胞放入孔中，將通過實施例1-O)中分離的500ul自然殺傷細胞追加地加入到裝有飼養細 胞的孔中。
在裝有細胞的各個孔中加入500U/ml濃度的IL_2 (Norvatis)的細胞因子和IOng/ ml的0KT-3抗體(ebioscience，16-0037)后，小心地搖晃孔板，以使細胞和細胞因子混合均勻。將孔板放入含有5%二氧化碳的37°C的濕潤培養箱內進行5天培養，這時，沒有添 加任何的培養液或細胞因子。從培養日開始算起，到第5天時，吸取裝有細胞的孔中的所有細胞至15ml的錐形 管內。在去除了細胞的各個孔中分別加入Iml的細胞培養液，將剩余的細胞收取干凈，將收 得的細胞以1200rpm的轉速進行10分鐘離心分離。將上層液真空抽吸干凈，去除了 0KT-3 抗體。往剩余的細胞中加入2ml的細胞培養液進行稀釋，取稀釋了的IOul細胞放入微管 中，與90ul臺盼藍溶液混合均勻后用臺盼藍進行染色測定細胞數量。加入細胞培養液稀釋 至2X105細胞/孔。然后加入IL-2至500U/ml，與細胞均勻混合后，在12-孔板上以2 X IO5細胞/ml/ 孔接種細胞。將上述孔板放入含有5%二氧化碳的37°C的濕潤培養箱內再進行12天培養。這時，從去除了 0KT-3抗體之后的下一天開始，即從最初培養日至10天期間分別 加入Iml含有500U/ml的IL-2的細胞培養液。從最初培養日開始至第10天的時候，收取細胞并測定細胞數量，將收得的細胞在 T75燒瓶(flask)內重新移植1 X IO7細胞數后加入5ml含有500U/ml IL-2的細胞培養液。 關于細胞培養液，直至移入下一個燒瓶為止，每天加入5ml細胞培養液。直至不能夠再增殖細胞時，移植到新的燒瓶內，每天加入5ml的含有IL_2(500U/ ml)的細胞培養液，直至第17天為止。實施例3 對獲得的NK-細胞的表面形態的分析去除0KT-3后，僅單獨處理IL-2，在第7天和第10天時，收取一部分細胞進行了表 面形態的分析。收取培養之前階段、中間階段、或培養結束后的細胞，以12000rpm的轉速進行5分 鐘離心分離，通過真空抽吸去除培養溶液。用Iml的FACS緩沖液(2. 5% FBS+PBS)稀釋后， 測定了細胞數量，用FACS緩沖液稀釋至5X IO6細胞/ml。在FACS試管(Falcon)中加入 IOOul的稀釋的細胞溶液，按照下述內容加入了抗體。試管1 沒有染色試管2 抗-人 CD3-FITC(BD Pharmingen,5555339)+ 抗-人 CD56_APC(BD Pharmingen, 555518) + 抗-人 CD16—PE (BD Pharmingen, 555407)試管3 抗-CD16-FITC (顏色對照)(BD Pharmingen, 555406)試管4 抗-CD56-PE (顏色對照)(BD Pharmingen, 555516)試管5 抗-CD56-APC (顏色對照)將上述各試管放置于冷藏溫度下進行30分鐘染色處理，染色后在細胞中加入2ml 的FACS緩沖液，以1500rpm的轉速進行5分鐘離心分離。去除上層液后再加入2ml的FACS 緩沖液，以1500rpm的轉速進行5分鐘離心分離。再次去除上層液，加入300ul的FACS緩 沖液，利用渦流使細胞散開，并利用FACSCalibur (Becton Dickinson)對表面形態進行了分析。
如圖2所示，結果為，第7天時對0KT-3進行處理的情況與沒有進行處理就培養的 情況相比，⑶3+T細胞相對減少，⑶3-⑶56+NK細胞更多。⑶3+細胞還沒有死掉，而是被推 定為是剩下的被輻射的外周血單核細胞。從培養日起第10天的時候，同時使用0KT-3和飼 養外周血單核細胞進行培養時，幾乎所有的CD3+T細胞都消失了，并且確認95%以上的細 胞為NK細胞。即增殖的NK細胞都是表達CD16的活化了的NK細胞。實施例4 對培養的NK-細胞的細胞殺傷能力的評價(Cr-釋放法)(1)制備效應細胞在培養自然殺傷細胞第14天時，收得一部分細胞，以1200rpm的轉速進行5分鐘 離心分離后去除上層液，加入2ml細胞培養液進行稀釋。加入細胞培養液使細胞數量達到 3X IO6細胞/ml后，調節為效應細胞靶細胞(E T)比=30 1。從上述制備的細胞中取Iml放入新的試管中，再加入2ml的細胞培養液混合均勻， 調節為效應細胞靶細胞(E T)比=10 1。并且，在細胞中取500ul放入新的試管中， 再加入4.5ml的細胞培養液進行充分混合，調節為效應細胞靶細胞(E T)比=3 1。在96孔板上，分別加入按上述特定比率調節好的自然殺傷細胞IOOul，使針對各 個靶的比率達到3孔/比率。(2)制備靶細胞制備好80 %培養融匯率的急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)細胞系 CEM 和慢性髓細胞性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)細 胞系K562，獲得上述兩個細胞系后，裝入15ml的錐形管中，以1200rpm的轉速進行5分鐘離 心分離。去除上層液，加入5ml細胞培養液稀釋細胞。測定細胞數量并將IX IO6的細胞移 入新的15ml試管中。在被移入的細胞中加入細胞培養液至10ml，以1200rpm的轉速進行 5分鐘離心分離。去除上層液，加入25ul的胎牛血清(FBS)稀釋細胞后，各加入IOOul的 Cr-51 (Perkin Elmer)。將試管在含有5% 二氧化碳的37°C的濕潤培養箱內放置一個小時后，將細胞取 出，加入細胞培養液至10ml，以1200rpm的轉速進行5分鐘離心分離。去除上層液，用同樣 的方法再洗滌兩次。在洗滌后的細胞中再放入IOml的細胞培養液，用吸液管進行稀釋。(3)殺害能力測試將稀釋了的細胞以每種靶細胞各為IOOul的量追加加入到之前準備好的裝 有效應細胞的板底呈圓形的(U型-底部)96孔板(FALCON)中，以各靶的自發性控制 (spontaneous control)，在沒有效應細胞的3個孔中加入IOOul靶細胞，加入IOOul細胞 培養液。以各靶的最佳控制(maximum control)，在沒有效應細胞的3個孔中加入IOOul的 靶細胞，加入IOOul含有1 %氚核X-100 (triton X-100)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，培養4小 時。然后，以2000rpm的轉速進行3分鐘離心分離并使細胞沉淀，往5ml的測試管中移 入IOOul的上層液，利用伽馬計數器(Y-計數器；COBRA)測定伽馬射線。然后利用下列公
式計算細胞毒性。效應+靴cpm-自發性cpm
-X 100,細胞毒性
最大cpm_自發性cpm如圖3所示，結果為雖然兩個細胞株之間的細胞毒性不同，但在兩種靶細胞中均 顯示出了 70%以上的高細胞毒性。實施例5 對培養的NK-細胞的增殖能力的評價(CFSE-增殖法)如實施例1所述，利用Rossets印從健康人體內的15ml外周血中分離NK細胞，將 自體外周血液細胞用放射線進行照射，抑制增殖后，用作飼養細胞。通過外周血淋巴細胞的 刺激，將抗-CD3抗體(0KT-3)以低濃度刺激5天，然后用添加有IL-2的培養基培養17天， 確認了最大達到600倍的NK細胞增殖。如從圖4能夠看出，結果顯示當沒有0KT-3抗體的刺激時，培養10天后只達到20 倍的增殖后即停止，相反，通過0KT-3的刺激培養10天后卻達到了 112倍，培養17天后最 大達到了 600倍的增殖。比較例1 對培養的NK-細胞的細胞增殖能力的比較為了對NK-細胞增殖能力進行評價比較，按照下述條件各自進行了培養。a、NK 細胞 +IL-2 (500U/ml)b、NK 細胞 +IL-2 (500U/ml) +0KT-3 (10ng/ml)c、NK 細胞 +IL-2 (500U/ml) + 經輻射的 PBMCd、NK 細胞 +IL-2 (500U/ml) + 經輻射的 PBMC+OKT-3 (10ng/ml)所有的NK細胞如實施例1，同樣是利用Rosettes印進行分離，被輻射的外周血單 核細胞接種量為NK細胞的5倍數量。從培養日起至5天時，收取各細胞測定了細胞數量。分別按照上述條件準備了 IXlO6的細胞移入5ml的試管中，使細胞培養液加至最 終為500ul，加入5uM的CFSE溶液后，在細胞培養箱中放置30分鐘。利用磷酸鹽緩沖液洗 滌3次后，用FACS Calibure分析了在530nm下的波長。結果為，如圖5所示，與單獨培養NK細胞相比，和飼養細胞一起培養會促進細胞增 殖，與飼養細胞一起對0KT-3進行處理時，對細胞增殖更為有效。并且發揮了最為顯著效果 的是d條件中將IL-2和0KT-3同時進行處理的時候，當培養至14天時增殖達到了 200倍 左右，當培養至17天時顯示出了約600倍以上的增殖能力。實施例7 培養的NK-細胞各濃度下的細胞增殖能力評價如實施例2所示，同時進行初期培養和0KT-3去除，測定NK-細胞數量并按照下述 不同濃度稀釋細胞后，接種于12-孔板上，在細胞培養箱中再培養9天后測定了細胞數量。a、IX IO5 細胞/ml/孔b、2X105 細胞/ml/孔c、5X105 細胞/ml/孔(1、1\105細胞/1111/孔根據上述不同條件，對細胞增殖進行比較的結果，如圖6所示，以2X105細胞/ml 進行接種時，14天顯示出了約900倍的最大增殖，以1 X IO6細胞/ml進行接種時，14天顯 示出了約為100倍的最低的增殖程度。并且可確認當去除了 0KT-3后，接種濃度對自然殺 傷細胞增殖起到了很大的作用。
以上詳細地說明了本發明的內容，對于本領域具有基本知識的技術人員來說，應 當知道這些具體技術只是優選的實施形態，但并不因此而限制本發明的范圍。并且本發明 的實質范圍由附加的權利要求及其等同要求定義。工業實用性本發明的自然殺傷細胞的增殖方法與現有的方法相比較，在維持自然殺傷細胞的 殺傷能力的同時，是可以達到最大增殖的具有突破意義的方法，因此可通過采少量血來獲 得大量的自然殺傷細胞，因此對于細胞治療劑的商業化來說是有用的。通過上述內容，對本發明內容的特定部分詳細地進行了敘述，對于具有本領域公 知常識的人應該知道這些具體的技術只是優選的實施形態，而并不能限定本發明的范圍。 并且本發明的實質范圍由附加的權利要求及其等同要求定義。
權利要求
1.一種自然殺傷細胞的增殖方法，該方法包括在外周血淋巴細胞存在的條件下，在含 有抗-CD3抗體及白介素蛋白的培養基中培養自然殺傷細胞的步驟。
2.如權利要求1所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，抗-CD3抗體選自 0KT-3、UCHTl 及 HIT3a。
3.如權利要求2所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，抗-CD3抗體為0KT-3 抗體。
4.如權利要求1所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，所述白介素蛋白選自 IL-2、IL-15、IL-12、IL-18 及 IL-21。
5.如權利要求4所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，所述白介素蛋白為白 介素-2(IL-2)。
6.如權利要求1所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，所述外周血淋巴細胞 為經過失活的外周血淋巴細胞。
7.如權利要求6所述的自然殺傷細胞的增殖方法，所述經過失活的外周血淋巴細胞為 經純化的T細胞。
8.如權利要求1所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，所述外周血淋巴細胞 為自體外周血淋巴細胞。
9.如權利要求1所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，包括在外周血淋巴細 胞存在的條件下、在含有抗-CD3抗體及白介素蛋白的培養基中培養自然殺傷細胞的步驟； 在所述培養物中除去抗-CD3抗體的步驟；及在含有白介素蛋白的培養基內加入所述除去 了抗-CD3的培養液來進行追加培養的步驟。
10.如權利要求9所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，所述抗-CD3抗體為 0KT-3抗體，所述白介素蛋白為白介素-2(IL-2)。
11.如權利要求9所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，以1X IO5至1 X IO6細 胞/孔的濃度加入所述去除了抗-CD3抗體的培養液。
12.如權利要求11所述的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，以1X IO5至3X IO6 細胞/孔的濃度加入所述去除了抗-CD3抗體的培養液。
全文摘要
本發明涉及提高自然殺傷細胞(Natural Killer cell，NK細胞)增殖的方法，具體地涉及包括在外周血淋巴細胞存在的條件下，在含有抗-CD3抗體及白介素蛋白的培養基中培養自然殺傷細胞的步驟的有關自然殺傷細胞的增殖方法。本發明提供了一種能夠顯著增殖自然殺傷細胞的方法，該方法可通過與現有的自然殺傷細胞增殖方法相比顯著提高了增殖率來獲得大量的自然殺傷細胞。
文檔編號C12N5/0783GK102112600SQ200980130121
公開日2011年6月29日 申請日期2009年7月29日 優先權日2008年7月29日
發明者安龍云, 許大錫, 鄭美英, 黃琉炅 申請人:株式會社綠十字, 首爾大學醫院