專利名稱：糧食與甘蔗汁發酵的非蒸餾酒及其工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于發酵技術和釀酒技術領域，具體而言，本發明涉及用糧食和甘蔗汁為原料發酵的非蒸餾酒及其工藝。
背景技術：
以果品為原料發酵釀酒，會帶來濃郁的果香等各種私人有好感的香氣。例如，本發明人的中國專利200910114150公開了以桂圓和甘蔗汁為原料生產白酒的方法，該酒可以帶有桂圓和甘蔗的清香。又如，本發明人的中國專利200910114151公開了以桂圓和甘蔗汁為原料生產白蘭地酒的方法，該酒也可以帶有桂圓和甘蔗的清香。然而，這些酒使用的原料較糧食昂貴，造成成本較高。盡管有些釀酒酵母本身能夠給酒帶來一些獨特的風味，但是這類酵母往往卻失釀酒產業中所需的一些優良工藝特性， 如絮凝性。以這些酵母出發進行誘變篩選，盡管可以改善工藝特性，但是風味特性往往會在誘變中失去。為此，本發明人經過長期而艱苦的研究，開發了新的用糧食和甘蔗汁為原料發酵非蒸餾酒的工藝。該工藝制備的酒不但能夠保持釀酒酵母所帶來的獨特風味，從而減少甚至無需較為昂貴的原料的使用，而且具有優良的工藝特性，方便釀造過程，進一步節約了成本。更為令人意外的是，該工藝中所使用的酵母的絮凝性隨著發酵酒液中含糖量的變化而變化，而且在含糖量高的時候絮凝率低，有益于充分發酵，而在含糖量低的時候絮凝率高， 便于發酵結束后酒液的分離。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供新的用糧食和甘蔗汁為原料發酵非蒸餾酒的工藝。另外，本發明還提供了用該工藝生產的非蒸餾酒以及該工藝中所使用的酵母和基因。具體而言，在第一方面，本發明提供了用糧食和甘蔗汁為原料發酵制備非蒸餾酒的方法，其包括
(1)取大米粉碎后，加水浸泡并煮熟，然后加入α淀粉酶進行液化，得到液化料；
(2)將步驟(I)獲得的液化料調節成酸性，加入糖化酶進行糖化，得到糖化液；
(3)向步驟(2)獲得的糖化液加入具有絮凝優化特性的酵母和發酵助劑，于23 35°C 密封發酵12 60小時，得到初步發酵液；
(4)向步驟(3)獲得的初步發酵液加入甘蔗汁，密封發酵至殘糖含量<4克/L時，得到酒液；和
(5)過濾步驟(4)獲得的酒液的上清液，任選進一步對所述上清液進行滅菌和/或勾兌所述上清液，得到非蒸餾酒。在本文中，絮凝優化特性指的是酵母在含糖環境下絮凝率低，而在無糖環境下絮凝率高。這種特性對于釀酒過程是尤其有益的。因為，在發酵初期，發酵液中含糖量高，此時不具有絮凝性質或絮凝率低的酵母，將盡量使其在發酵液中保持懸浮狀態，從而使得發酵更為充分，提高發酵效率；在發酵結束時，發酵液中含糖量低，此時具有絮凝性質或絮凝率高的酵母，將容易沉淀到發酵罐底部，便于發酵終止后收集酒體。優選在本發明第一方面的方法中，大米和甘蔗汁的重量體積比(kg/L)為I 10 I 10，優選為3 8 3 8，更優選為I : I。在本發明中，大米和甘蔗汁分別在不同的步驟加入。優選在本發明第一方面的方法中，甘蔗汁的糖度為5 20° Bx，優選為10 18° Bx，更優選為15° Bx。甘蔗汁的糖度可以通過新鮮榨出的甘蔗汁加水稀釋調節。在本發明中，液化和糖化可以按照本領域常規的糧食液化和糖化過程進行。其中所用的試劑，如淀粉酶和糖化酶都已經是很成熟的商品了。優選在本發明第一方面的方法中，液化的條件是α淀粉酶用量為5 15U/克大米原料，于50 60°C攪拌15 60分鐘，然后升溫至85 97°C繼續攪拌20 60分鐘。也優選在本發明第一方面的方法中，糖化的條件是于50 65°C加入糖化酶100 300U/克大米原料，保溫45 120分鐘。 優選在本發明第一方面的方法中，調節成酸性是乳酸調節pH至4. O 4. 8，優選調節pH至4. I 4. 5,更優選調節pH至4. 2。優選在本發明第一方面的方法中，具有絮凝優化特性的酵母是包含絮凝蛋白變體基因的酵母，所述絮凝蛋白變體基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。野生型絮凝蛋白的氨基酸序列如GenBank登錄號CAA55024. I所示，其能賦予不具有絮凝性質的酵母以絮凝性質。盡管野生型絮凝蛋白給酵母賦予的絮凝性質較強，但是這種性質在含糖環境下也很強，這樣造成了發酵過程中酵母也容易沉淀在發酵罐底部，造成發酵效率低下，因此實踐中并沒有得到推廣。本發明人經過長期研究，偶然在我們的發酵中發現了一株具有絮凝優化特性的酵母，經過委托研究，發現其是絮凝蛋白相對于野生型絮凝蛋白發生了至少三處氨基酸位點的突變。將該絮凝蛋白變體基因導入其他現有酵母，如不具有絮凝性質的酵母，能夠賦予該酵母絮凝優化特性，而且不改變該酵母原有發酵風味。因此，使得具有發酵風味但不具有絮凝優化特性的現有酵母能夠得以重新利用。優選在本發明第一方面的方法中，發酵助劑是Fermaid K。這是對酵母發酵很有益的發酵助劑，目前已經商品化。在本發明第一方面的方法中，密封發酵至殘糖含量< 4克/L，通常需要在18 22°C，密封發酵9 12天。在第二方面，本發明提供了本發明第一方面的方法制備的非蒸餾酒。這種酒能夠保留原有酵母的發酵風味，而且便于酒液的后期純化，由于酵母主要沉積在發酵罐底部，只需要取酒液的上清，經過簡單的過濾即可獲得澄清的酒體。在第三方面，本發明提供了絮凝蛋白變體，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。本領域技術人員可以根據絮凝蛋白變體的氨基酸序列推導出其編碼核苷酸序列，優選是密碼子優化的核苷酸序列，如針對發酵所用的菌密碼子使用情況優化的。在第四方面，本發明提供了編碼本發明第三方面的絮凝蛋白變體的基因。該基因通過常規的DNA重組技術，可以導入質粒和菌體(如，酵母)，表達本發明第三方面的絮凝蛋白變體。優選本發明第四方面的基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。該優選的基因核苷酸序列的密碼子針對釀酒酵母宿主優化，而且密碼子優化表不是根據現有公開的優化表進行的，而是根據我們長期研究發現的，在除了對單個密碼子優化之外，還兼顧了 CG含量的優化。在第五方面，本發明提供了本發明第四方面的基因在發酵制備非蒸餾酒的方法中的應用。該基因可以賦予酵母以絮凝優化特性，因而對發酵制備非蒸餾酒而言是非常有益的。優選在本發明第五方面的應用中，所述方法是本發明第一方面的方法。本發明具有下列優點和效果在發酵初期發酵液中含糖量高時，酵母將盡量使其在發酵液中保持懸浮狀態，從而使得發酵更為充分，提高發酵效率；在發酵結束發酵液中含糖量低時，酵母將容易沉淀到發酵罐底部，便于發酵終止后收集酒體；能夠賦予酵母以絮凝優化特性，從而可以利用原有發酵特性優良而絮凝性質不佳的酵母，充分利用目前發酵廠和酒廠的酵母資源；本發明的酒帶有甘蔗清香并能繼承原有發酵特性優良的酵母的特性， 香味吸引人，能夠達到與加入唱本昂貴的原料相似的效果；本發明的酒使用了糧食作為發酵原料，降低了生產成本。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例僅是為了說明，并不構成對本發明范圍的限制。顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本發明進行參考，就好像它們的全文已經在本發明說明書中重復敘述過一樣。
具體實施例方式以下本文將通過具體的實施例來描述發明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的釀酒技術和基因重組技術手冊以及本文所引用的參考文獻中所列的方法來實施。另外，實施例中所使用的材料和設備均可從市場上購買。實施例I絮凝性質優化的酵母的獲得
根據我們設計的基因序列(SEQ ID No :1，其編碼的蛋白變體的氨基酸序列為SEQ IDNo :2)，通過商業途徑委托廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司合成我們發現的絮凝蛋白變體基因并構建入釀酒酵母中。克隆過程參照《分子克隆實驗指南》以及所用商品化試劑的操作指南進行，簡要過程如下
通過DNA自動合成儀，合成絮凝蛋白變體基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(購自 TaKaRa公司)將這些核酸片段的5’端進行磷酸化，然后等摩爾比混合這些核酸片段后于 75°C變性5分鐘，然后退火降溫至12°C，加入T4DNA連接酶(購自TaKaRa公司)連接12小時。然后，取I μ L上述連接產物在50 μ L反應體積中進行PCR擴增，其中正向引物如序列表的SEQID No 3所示(引入了 EcoR I內切酶位點)、反向引物如序列表的SEQ ID No 4所示(引入了 Xba I內切酶位點)，反應條件為以94°C變性2分鐘，然后以94°C變性30秒、 63°C退火60秒并72°C延伸90秒進行30個循環，最后以72°C延伸12分鐘并降溫至4°C。瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產物，回收約4. 5kb大小的片段，用EcoR I和Xba I雙酶切該片段，并與經這兩個內切酶酶切的PYESS2/CT質粒(可購自Invitrogen公司)用T4DNA 連接酶進行連接，電轉化法將pYESS-fIn質粒轉入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) QN732株(購自廣西易多收生物科技有限公司，其為非凝絮性酵母，但是發酵產生的酒中有淡淡巧克力香味)中，涂布在選擇性培養基上培養，取生長出的酵母提取總DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳發現有約4. 5kb大小的片段，表明已經將如序列表的SEQ ID No :1所示的基因導入了釀酒酵母中了。同時，將pYESS2/CT空質粒和克隆有野生型絮凝蛋白基因的PYESS2/CT質粒電轉化入該非凝絮性酵母，分別作為陰性對照和陽性對照。我們將20mL 絮凝檢測液(50mmol/L 檸檬酸鈉，5mmol/LEDTA，20mmol/L CaCl2, pH 4. 5 ;并分別加入以下終濃度的物質不加入(無糖)，1M葡萄糖)置于50mL搖瓶中，分別加入上述各酵母細胞I克(濕重)，以30°C、100r/min振蕩培養2小時。然后，取5mL細胞懸浮液至IOmL試管中，立刻在液面取樣200 μ L，垂直靜置5分鐘，然后在液面取樣200 μ L，分別測定垂直靜置前后的0D600值，計算絮凝率(絮凝率=(I-垂直靜置后的0D600值/垂直靜置前的0D600值)*100% )。結果如表I所示，釀酒酵母QN732基本不具有絮凝性質；克隆了野生型絮凝蛋白基因后，無論在無糖還是在含糖環境下，酵母都將具有絮凝性質；本發明的絮凝蛋白變體基因轉入的酵母在含糖環境下不具有絮凝性質，將保持懸浮狀態發酵， 而在無糖環境下將具有絮凝性質，容易沉淀到發酵罐底部，便于發酵終止后收集。表I各酵母在含糖或不含糖條件下的絮凝率
絮凝檢測液\酵母的基因空載體絮凝蛋白變體基因野生型絮凝蛋白基因無糖7%66%73%含葡萄糖6%12%58%
實施例2非蒸餾酒的制備
將500克大米磨碎，加700克水浸泡I小時，然后煮熟，加2公斤水和α淀粉酶(可購自南寧賽華發酵制品有限公司)IOU/克大米原料，于55°C攪拌30分鐘，然后升溫至95°C繼續攪拌30分鐘，使大米液化。然后加入乳酸調節pH至4. 2，于58°C加入糖化酶(可購自南寧賽華發酵制品有限公司)150U/克大米原料，保溫90分鐘，去除糟渣后得到糖化液。將上述糖化液裝入滅菌的發酵罐，加入實施例I的克隆有絮凝蛋白變體基因的酵母2克(干重)和發酵助劑Fermaid K(可購自上海杰兔工貿有限公司)5克，于28°C發酵 48小時，然后加入O. 5L 15° Bx的甘蔗汁(新榨甘蔗汁用水稀釋到15° Bx，然后高溫滅菌， 即成)，溫度控制在18 22°C，密封發酵9 12天。當殘糖< 4克/L時，發酵結束，由于此時酵母基本沉積在罐底，因此將上清液部分簡單過濾即可取得澄清的酒體，經巴氏滅菌， 加水稀釋至含酒精12% (體積比)即可裝瓶。多批次釀造后，經檢測，各批次酒理化指標穩定(見表2)，符合國家酒類的標準；該酒香味中帶有甘蔗汁的清香和巧克力的清香，口感豐滿。表2理化指標
項目酒精含量％ (vol)甲醇含量/(g/L)銅含量(mg/L)指標12^ I. 5^ 5. O
序列表
〈110〉長東，葉
〈120〉糧食與甘蔗汁發酵的非蒸餾酒及其工藝
<130>CN
<160>4
<170>PatentIn version 3. 3<210>1 <211>4614 <212>DNA 〈213〉釀酒酵母 <400>1
atgaccatgccgcatcgctatatgtttctggcggtgtttaccctgctggcgctgaccagc60gtggcgagcggcgcgaccgaagcgtgcctgCCggCgggCCagcgcaaaagcggcatgaac120attaacttttatcagtatagcctgaaagatagcagcacctatagcaacgcggcgtatatg180gcgtatggctatgcgagcaaaaccaaactgggcaacgtgggcggccagaccgatattagc240attgattataacattccgtgcgtgagcagcagcggcacctttccgtgcccgcaggaagat300agctatggcaactggggctgcaaaggcatgggcgcgtgcagcaacagccagggcattgcg360tattggagcaccgatctgtttggcttttataccaccccgaccaacgtgaccctggaaatg420accggctattttctgccgccgcagaccggcagctatacctttaaatttgcgaccgtggat480gatagcgcgattctgagtgtgggcggcgcgaccgcgtttaactgctgcgcgcagcagcag540ccgccgattaccagcaccaactttaccattgatggcattaaaccgtggggcggcagcctg600ccgccgaacattgaaggcaccgtgtatatgtatgcgggctattattatccgatgaaagtg660gtgtatagcaacgcggtgagctggggcaccctgccgattagcgtgaccctgccggatggc720accaccgtgagcgatgattttgaaggctatgtgtatagctttgatgatgatctgagccag780agcaactgcaccgtgccggatccgagcaaccatgcggtgagcaccaccaccaccaccacc840gaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc900aacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccaccgcgagcacc960attattaccaccaccgaaccgtggaacagcaccttgaccagcaccagcaccgaactgacc1020accgtgaccggcaccaacggcgtgcgcaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccg1080accaccgcgaccaccgcgattaccaccaccgaaccgtggaacagcacctttaccagcacc1140agcaccgaactgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattatt1200gtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgatgaccaccacccagccgtggaacgat1260acctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgacc1320gatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgatgaccaccacc1380cagccgtgggatgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc1440aacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccacc1500gcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgacc1560accgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccg1620accaccgcgaccaccgcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcacc1680agcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattatt1740gtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgattaccaccaccgaaccgtggaacagc1800acctttaccagcaccagcaccgaactgaccaccgtgaccggcaccaacggcctgccgacc1860gatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccaccgcgatgaccaccacc1920cagccgtggaacgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc1980aacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccgaccaccgcgaccacc2040gcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcaccagcaccgaaatgacc2100accgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccattattgtgattcgcaccccg2160accaccgcgaccaccgcgatgaccaccacccagccgtggaacgatacctttaccagcacc2220agcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgatt2280gtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctgattagcaccaccaccgaaccgtggaccggc2340acctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggccagccgacc2400gatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctggtgaccaccaccacc2460gaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccattaccggcacc2520aacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctg2580attagcaccaccaccgaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgacc2640accattaccggcaccaacggccagccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccg2700accagcgaaggcctgattagcaccaccaccgaaccgtggaccggcacctttaccagcacc2760agcaccgaaatgaccaccgtgaccggcaccaacggcgtgccgaccgatgaaaccgtgatt2820gtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctgattagcaccaccaccgaaccgtggaccggc2880acctttaccagcaccagcaccgaagtgaccaccattaccggcaccaacggccagccgacc2940gatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctgattagcaccaccacc3000gaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgaccaccgtgaccggcacc3060aacggccagccgaccgatgaaaccgtgattgtgattcgcaccccgaccagcgaaggcctg3120gtgaccaccaccaccgaaccgtggaccggcacctttaccagcaccagcaccgaaatgagc3180accgtgaccggcaccaacggcctgccgaccgatgaaaccgtgattgtggtgaaaaccccg3240accaccgcgattagcagcagcctgagcagcagcagcagcggccagattaccagcagcatt3300accagcagccgcccgattattaccccgttttatccgagcaacggcaccagcgtgattagc3360agcagcgtgattagcagcagcgtgaccagcagcctgtttaccagcagcccggtgattagc3420agcagcgtgattagcagcagcaccaccaccagcaccagcatttttagcgaaagcagcaaa3480agcagcgtgattccgaccagcagcagcaccagcggcagcagcgaaagcgaaaccagcagc3540gcgggcagcgtgagcagcagcagctttattagcagcgaaagcagcaaaagcccgacctat3600agcagcagcagcctgccgctggtgaccagcgcgaccaccagccaggaaaccgcgagcagc3660CtgCCgCCggcgaccaccaccaaaaccagcgaacagaccaccctggtgaccgtgaccagc3720tgcgaaagccatgtgtgcaccgaaagcattagcccggcgattgtgagcaccgcgaccgtg3780accgtgagcggcgtgaccaccgaatataccacctggtgcccgattagcaccaccgaaacc3840accaaacagaccaaaggcaccaccgaacagaccaccgaaaCCBCCBBBCBgaccaccgtg3900gtgaccattagcagctgcgaaagcgatgtgtgcagcaaaaccgcgagcccggcgattgtg3960agcaccagcaccgcgaccattaacggcgtgaccaccgaatataccacctggtgcccgatt4020agcaccaccgaaagccgccagcagaccaccctggtgaccgtgaccagctgcgaaagcggc4080gtgtgcagcgaaaccgcgagcccggcgattgtgagcaccgcgaccgcgaccgtgaacgat4140gtggtgaccgtgtatccgacCtggCgCCCgcagaccgcgaacgaagaaagcgtgagcagc4200aaaatgaacagcgcgaccggcgaaaccaccaccaacaccctggcggcggaaaccaccacc4260aacaccgtggcggcggaaaccattaccaacaccggcgcggcggaaaccaaaaccgtggtg4320accagcagcctgagccgcagcaaccatgcggaaacccagaccgcgagcgcgaccgatgtg4380Met
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<211>1537
<212>PRT
〈213〉釀酒酵母
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Cys
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190
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4440
4500
4560
4614
75
95
155
17權利要求
1.用糧食和甘蔗汁為原料發酵制備非蒸餾酒的方法，其包括(1)取大米粉碎后，加水浸泡并煮熟，然后加入α淀粉酶進行液化，得到液化料；(2)將步驟(I)獲得的液化料調節成酸性，加入糖化酶進行糖化，得到糖化液；(3)向步驟(2)獲得的糖化液加入具有絮凝優化特性的酵母和發酵助劑，于23 35°C 密封發酵12 60小時，得到初步發酵液；(4)向步驟(3)獲得的初步發酵液加入甘蔗汁，密封發酵至殘糖含量<4克/L時，得到酒液；和(5)過濾步驟(4)獲得的酒液的上清液，任選進一步對所述上清液進行滅菌和/或勾兌所述上清液，得到非蒸餾酒。
2.權利要求I所述的方法,其中大米和甘蔗汁的重量體積比(kg/L)為I 10:1 10， 優選為3 8 :3 :8，更優選為I :1。
3.權利要求I或2所述的方法，其中甘蔗汁的糖度為5 20°Bx，優選為10 18° Bx， 更優選為15° Bx。
4.權利要求I所述的方法，其中調節成酸性是乳酸調節pH至4.O 4. 8，優選調節pH 至4. I 4. 5,更優選調節pH至4. 2。
5.權利要求I所述的方法，其中具有絮凝優化特性的酵母是包含絮凝蛋白變體基因的酵母，所述絮凝蛋白變體基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。
6.權利要求I所述的方法，其中發酵助劑是FermaidK。
7.權利要求I 6之任一所述的方法制備的非蒸餾酒。
8.絮凝蛋白變體，其氨基酸序列如SEQID No:2所示。
9.編碼權利要求8所述的絮凝蛋白變體的基因，優選其核苷酸序列如SEQID No:l所/Jn ο
10.權利要求9所述的基因在發酵制備非蒸餾酒的方法中的應用，優選所述方法是權利要求I 6之任一所述的方法。
全文摘要
本發明提供了用糧食和甘蔗汁為原料發酵制備非蒸餾酒的方法，其包括取大米加入α淀粉酶進行液化，加入糖化酶進行糖化，加入具有絮凝優化特性的酵母和發酵助劑進行初步發酵，加入甘蔗汁，密封發酵，得到非蒸餾酒。另外本發明還提供了制備得到的非蒸餾酒和酵母以及絮凝蛋白變體和基因。
文檔編號C12G3/02GK102586049SQ20121002741
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月8日 優先權日2012年2月8日
發明者葉長東 申請人:葉長東