專利名稱：一種柞蠶卵巢細胞培養基及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及昆蟲解剖學、昆蟲組織培養學等領域，具體涉及ー種柞蠶卵巢細胞培養基、及其在柞蠶卵巢細胞體外培養技術中的應用。
背景技術：
昆蟲細胞培養是從昆蟲體內取出細胞，模擬昆蟲體內的生理環境，在無菌、適溫和豐富的營養條件下，使細胞生存、生長并維持結構和功能的ー門技木。原代細胞因剛從組織中分離開，生物學特性未發生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也最接近和反映體內生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。20世紀初，許多昆蟲學家嘗試過使用體外培養的昆蟲細胞作為科學研究的工具。最早進行昆蟲組織體外培養的是德國Richard Goldschmiedt (1915),他使用惜比古天香(Hyalophora cecropia)蛾的精子進行體外培養，用來觀察精子的發育(Goldschmidt and Kaiser，1915)。在20世紀30年代，美國Trager進行了家蠶(Bombyx mori)細胞原代培養,首次研究了昆蟲細胞體外生長條件，家蠶細胞在培養基中的體外生存可維持3周。50年代，加拿大Wyatt改進了家蠶卵巢細胞培養條件，成功設計了昆蟲細胞培養基IPL-16。60年代，Grace等進ー步改良了昆蟲細胞培養基，至今已廣泛用于昆蟲細胞系的培養與研究。隨著細胞生物學和分子生物學的相互滲透，分子生物學實驗技術與細胞培養技術的結合，使細胞在闡明基因的結構與功能、基因在細胞生長和分化中的作用等方面發揮了重要的作用。同吋，昆蟲細胞培養和分子生物學的應用對于了解昆蟲的生理和發育機制，昆蟲與真菌、微孢子蟲、細菌和病毒在細胞和分子水平的相互作用方面也起了重要作用。2002年錢永華等利用家蠶細胞研究家蠶微孢子蟲的形成、生活史和侵染家蠶的過程等。2004年肖仕全利用家蠶胚胎細胞系對家蠶類濃核病毒毒理進行了研究，早在1995年鄧寧等利用昆蟲細胞大規模培養進行桿狀病毒殺蟲劑的生產。由此可見，建立昆蟲細胞培養方法，對了解昆蟲與微孢子蟲、細菌和病毒等相互作用關系的ー些理論問題提供了技術手段；同時也為生物防治エ廠化生產昆蟲病毒制劑開辟了新途徑。昨蠶(Antheraea pernyi)是我國重要的經濟昆蟲,遼寧是我國的主產區，姆年產量5萬噸左右。由于柞蠶以蛹滯育越冬，可長期保存。柞蠶絲除了可以織綢外，還可廣泛用于軍エ、化工、醫藥等方面；柞蠶蛹含有大量蛋白質和氨基酸，營養豐富，也是深受人們喜愛的昆蟲食品；另外，由于柞蠶蛹、蛾、卵、幼蟲等四個不同變態階段中含有多種生物活性物質，近年來又成為保健品、生物藥品等的重要原料；柞蠶蛹或細胞又是近年發展起來的基因工程中得重要的生物反應器，因此，人們對柞蠶的需求越來越多，其經濟價值和社會效益也在不斷提高。但由于柞蠶放養在野外，經受著各種病毒、細菌、微孢子蟲等病原微生物的侵襲，時有病害的發生，導致部分蠶農減產甚至絕收，影響了蠶農放養柞蠶的積極性，嚴重地阻礙了柞蠶生產的發展，而柞蠶細胞又是研究這些病害發病機理及病原侵染規律必要的工具與平臺，因此，開展柞蠶細胞培養方法研究，建立柞蠶卵巢細胞培養方法對發展柞蠶生產及相關研究具有重要意義。

發明內容
為了發展柞蠶生產及相關研究，本實驗室已對柞蠶蛹、幼蟲的卵巢細胞進行了大量的離體培養試驗，與此同時，研發了比較適合該細胞體外生長的培養基配方、培養條件和培養方法。本發明涉及的柞蠶卵巢細胞培養基的配制方法是，將配制好的氨基酸和糖混合貯藏液(MLM-AAS)、無機鹽貯藏液(MLM-Salt)、維生素貯藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例混合，并調PH制得MLM-45培養基，用于柞蠶卵巢細胞培養前，加入胎牛血清和青鏈霉素混合液。通過多種實驗確定該細胞體外生長條件為培養溫度，pH值及滲透壓值，本發明為進行柞蠶生物學、柞蠶病原微生物及相關領域研究提供技術服務。本發明的具體技術方案如下本發明的一方面在于提供一種柞蠶卵巢細胞培養基MLM-45的組成成分，每配制IOOOmL,其具體組成成分及用量如下
5 倍濃縮的 MLM-AAS200 mL
10 倍濃縮的 MLM-Salt100 mL
1000 倍濃縮的 MLM-Vit 1 mL
牛血清白蛋白5.Og
胎球蛋白0.02g分別稱取上述組分，加蒸餾水至IOOOmL,調pH6. 2-6. 4，過濾除菌，4°C保存；其中(a)每配制IOOOmL的5倍濃縮的氨基酸和糖混合貯藏液，其具體組成成分及用量
如下
權利要求
1.一種柞蠶卵巢細胞培養基MLM-45，每配制IOOOmL,其具體組成成分及用量如下 .5 倍濃縮的 MLM-AAS200 mL .1O 倍濃縮的 MLM-Salt100 mL .1000 倍濃縮的 MLM-Vit I mL 牛血清白蛋白5.Og 胎球蛋白0.02g分別稱取上述組分，加蒸餾水至IOOOmLdM PH6. 2-6. 4，過濾除菌，4°C保存；其中(a)每配制IOOOmL的5倍濃縮的MLM-AAS，其具體組成成分及用量如下5倍濃縮的MLM-AAS成分用量(單位g) L-Cystine0.28 L-Tyrosine0.425 a-Alanine1.55 β-Alanine1.05L-Arginine-HCl3.45 L-Aspartic acid3.75 L-Asparagine3.75 L-Glutamic acid4.5 L-Glutamine4.5 L-Glycine2.3 L-Histidine4.25 L-Isoleucine2.6 L-Leucine0.405 L-Lysine-HCl3.25 L-Methionine2.25L-Phenylalanine3.4 L-Proline1.95 DL-Serine2.65 L-Threonine0.8L-Tryptophan0.425 L-Valine2.5 Glucose12.5 Fructose2.5 Sucrose87.5分別稱取上述組分，加蒸餾水至lOOOmL，過濾除菌，_20°C保存；(b)每配制1OOOmL的10倍濃縮的MLM-Salt，其具體組成成分及用量如下
2.根據權利要求I所述的MLM-45培養基，其特征在于用10mol/LKOH調整pH。
3.根據權利要求I所述的MLM-45培養基，其特征在于用O.22 μ m或O. 45 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
4.如權利要求1、2或3中任一項所述的MLM-45培養基在培養細胞中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于培養柞蠶卵巢細胞的條件為 使用前，向MLM-45培養基中，按20 %的體積比加入胎牛血清，按I %的體積比加入青鏈霉素混合液；青鏈霉素混合液中青霉素、鏈霉素的濃度均為10，000單位/mL ； 細胞培養溫度為26 28°C ; 細胞培養pH為6. 2 6. 4 ; 細胞培養滲透壓值為315-350m0sm/kg。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于培養柞蠶卵巢細胞的條件為細胞培養溫度為27°C ；細胞培養PH為6. 3 ; 細胞培養滲透壓值為325mOsm/kg。
全文摘要
本發明公開一種柞蠶卵巢細胞培養基的組成成分、配制方法及其在柞蠶卵巢細胞培養中的應用。將配制好的氨基酸和糖混合貯藏液(MLM-AAS)、無機鹽貯藏液(MLM-Salt)、維生素貯藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例配制，并調pH為6.2-6.4，制得MLM-45培養基，用于柞蠶卵巢細胞培養前，按20％體積比加入胎牛血清和1％體積比的青鏈霉素混合液。通過多種實驗確定該細胞體外生長條件為培養溫度26-28℃，pH6.2～6.4；滲透壓315-350mOsm/kg。本發明為進行柞蠶生物學、柞蠶病原微生物及相關領域研究提供技術服務。
文檔編號C12N5/071GK102618487SQ20121002705
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月7日 優先權日2012年2月7日
發明者岳冬梅, 李樹英, 王林美, 范琦 申請人:遼寧省農業科學院大連生物技術研究所