專利名稱：一種回收片狀載體的方法
技術領域：
本發明涉及一種回收片狀載體的方法。
背景技術：
片狀載體，例如，美國NBS公司生產的Fibra disk載體，臺灣賽宇潮汐式反應器應用的紙片載體，杭州安普公司激流式反應器應用的紙片載體，山東省濱州貝爾凱瑞生物工程有限公司生產的Cephodisk載體等。片狀載體多為圓片狀、小平行四邊形、“N”形等，采用聚酯纖維、納米合成纖維等纖維材料制成，其內部具有網格狀結構，這些網格狀結構構成片狀載體的親水性三維多孔隙，可以為細胞生長提供很高的比表面積(如IgFibra disk載體可提供1200cm2的生長面積)，增強細胞的貼附能力，促進細胞快速擴增。正因為如此，在細胞反應器進行大規模培養動物細胞的工藝中，片狀載體的應用已非常普遍。在大規模細胞發酵過程中，片狀載體的使用量會隨著細胞反應器規模的增大而增加，因而在細胞反應器發酵過程中占據了主要的成本。而片狀載體是一次性耗材，且價格又非常昂貴，導致細胞反應器發酵的成本非常高，例如，美國NBS公司的籃式反應器，5L反應器需添加片狀載體150g，40L反應器需添加片狀載體1200g，使用量很大，而其市場價格在 5(Γ60元人民幣/g左右。片狀載體作為一種昂貴的一次性耗材，在該種細胞反應器發酵過程中占據了主要的成本,因而,細胞發酵的生產成本較高。不僅如此,若將大量的片狀載體隨意丟棄堆放，易對環境造成污染，增加環境壓力。而片狀載體經使用后，細胞碎片與蛋白雜質殘留在在片狀載體三維網狀結構內部，貼附在纖維束上，難以分離，因而難以清洗干凈，若不經謹慎處理將其循環利用，極易對新的細胞生長造成不利影響，造成生長狀態不佳，甚至死亡，進而降低目標產物的產量和質量，故目前行業內少有人對片狀載體進行二次使用。

發明內容
為克服現有技術中存在的技術問題，本發明的目的提供一種回收片狀載體的方法，該方法簡單易行，回收成本低廉，且對環境保護有積極作用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種回收片狀載體的方法，其包括以下步驟
(1)純水清洗用溫熱純水浸泡細胞發酵結束后所取出的片狀載體，然后清洗，直至清洗片狀載體的純水用肉眼觀察為無色且無雜質，浙干；
(2)堿液浸泡經步驟(I)處理后的片狀載體置于堿液中浸泡，然后用純水清洗至清洗后倒出的水無肉眼可見雜質，浙干；
(3)胰蛋白酶溶液消化經步驟(2)處理后的片狀載體置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后再用純水清洗至清洗后倒出的水中無肉眼可見雜質，浙干；
(4)酸液浸泡步驟(3)處理后的片狀載體置于酸性溶液中浸泡以恢復其功能性，然后用超純水清洗干凈，至PH值為中性，清洗后倒出的水中無肉眼可見雜質，浙干；
(5)干燥對步驟(4)處理后的片狀載體進行干燥處理，去除水分使之干燥。本發明先用溫熱純水除去粘附在片狀載體上大部分的細胞碎片與可溶于水的蛋白雜質，因為溫熱水相對冷水更容易將細胞碎片與蛋白雜質從載體上清洗下來；然后用堿液浸泡，使殘留的蛋白變性、溶解；而堿液沒有除去的剩余的小部分細胞碎片與蛋白雜質通過胰蛋白酶的消化作用除去。而后，再用酸性溶液浸泡所述片狀載體材料以恢復其功能性， 使其再次使用時利于細胞貼附，此外酸液浸泡也有再次去除片狀載體中雜質的作用，以盡可能將載體中的雜質去除干凈。本發明推薦的實施方式是所述的步驟(I)中片狀載體在熱純水中的浸泡時間可以是1(Γ20分鐘，所述的清洗可以采用反復輕柔搓洗的方式，直至浸泡片狀載體的純水用肉眼觀察為無色且無雜質。本發明所述步驟(I)中浸泡片狀載體的溫熱純水應沒過所有片狀載體為佳，所述溫熱純水優選采用4(Γ60 V純水即可,該溫度范圍的純水不僅容易將細胞碎片與蛋白雜質從載體上清洗下來，而且溫度溫和適中不劇烈，便于操作人員手動處理。本發明所述步驟(2)浸泡時堿液應沒過所有片狀載體為佳。優選地，所述的堿液與片狀載體比例為l(T20ml/g，既可以完全浸泡載體，還不會造成堿液的浪費。由于堿液濃度過低，浸泡達不到去除載體中雜質的目的，濃度過高，會對載體的內部結構造成不必要的破壞，因此，所述的堿液采用優選濃度為O. Γ0. 5mol/L的分析純氫氧化鈉(NaOH)溶液或分析純氫氧化鉀(KOH)溶液，能夠在達到最大程度去除載體中雜質的同時，又保證載體內部結構的完整性。本發明更優選O. 4^0. 5mol/L的分析純氫氧化鈉或分析純氫氧化鉀。本發明所述步驟(2)中堿液浸泡應盡可能使片狀載體中的殘留的蛋白變性及溶解，本發明中堿液浸泡時間優選O. 5 4h，在此時間范圍內已能使載體中殘留的蛋白變性，時間過長，堿液浸泡的效果已無實際意義，且會延長處理時間，不利于提高處理效率。胰蛋白酶溶液消化的最佳PH值在7到8之間，此時消化力較強，故作為本發明的一種優選實施方式，所述步驟(2)中，可以對經過堿液處理后的片狀載體用清水清洗至呈弱堿性，這樣可以利于步驟(3)中胰蛋白酶消化。本發明所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的用量應以沒過所有片狀載體為佳，所述胰蛋白酶溶液與片狀載體間的比例優選在l(T20ml/g范圍內，既可以使片狀載體完全浸泡在胰蛋白酶溶液中，而且不會造成胰蛋白酶溶液的浪費，有利于節約載體回收成本。本發明所述步驟(3)中胰蛋白酶溶液浸泡應盡可能將堿液沒有除去的剩余的小部分細胞碎片與蛋白雜質消化作用除去。而本發明中所述的胰蛋白酶溶液浸泡時間優選 O. 5 2h，在該時間范圍內胰蛋白酶已能充分消化貼附在載體中的殘余蛋白雜質。本發明所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的濃度應以能將片狀載體中的細胞碎片與蛋白雜質消化完全為佳。本發明的胰蛋白酶溶液的質量體積濃度優選在O. 0259Γ0. 25% 范圍內可以達到消化雜質蛋白的效果，又不造成胰蛋白酶的浪費，其具體配方為
O.025 O. 25g胰蛋白酶，IOOml PBS溶液。本發明所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的質量體積濃度更優選在O. 159ΓΟ. 25%范圍內，可以達到消化雜質蛋白的最佳效果，同時不造成胰蛋白酶的富余浪費。而胰蛋白酶液最佳的消化條件是37 38°C，因而，所述步驟(3)中的消化溫度可以控制在37 38°C范圍內。
本發明所述步驟(4)的酸性溶液的用量應以沒過所有片狀載體為佳，優選地，所述的酸性溶液與片狀載體間的比例在l(T20ml/g范圍內，不僅可以使片狀載體完全浸泡在酸性溶液中，而且不會造成酸性溶液的浪費,有利于節約載體回收成本。酸性溶液濃度過低，不利于片狀載體的功能性恢復，濃度過高則對片狀載體的功能性恢復起反作用，因此，所述步驟(4)的酸性溶液的PH范圍優選為(Γ5，可以采用 O. Γ0. 5mol/L鹽酸溶液，優選O. 3^0. 4mol/L的鹽酸溶液，另外采用上述濃度的酸性溶液還可對經過步驟(2)和(3)處理后繼續殘留在片狀載體中的極少量蛋白雜質起到再次清除的作用。本發明所述步驟(4)中酸性溶液浸泡應充分恢復片狀載體功能性，浸泡時間過短，載體的功能性恢復不完全，時間過長增長回收的時間，因此，所述步驟(4)中酸性溶液浸泡時間優選是O. 5 lh。本發明所述步驟(5)的干燥溫度不宜過高，應控制在能干燥片狀載體又不破壞片狀載體的材質和結構的范圍內，避免片狀載體的材質和結構因干燥高溫而破壞。本發明的干燥溫度優選控制在4(T50°C范圍內，干燥時間優選在8 10小時范圍內。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
I.本發明提供的方法簡單易行，回收成本低廉，且在處理的過程中，堿性溶液、酸性溶液的濃度以及干燥溫度適中，不易對片狀載體的材質和結構造成破壞，可使片狀載體的回收率達到100%，可重復利用4至5次以上，回收后的應用效率可達到回收前應用效果的90% 以上。2.經本發明回收的片狀載體在重新使用前最好再用較多的細胞培養級的超純水侵泡I小時以上，若和新片狀載體混合使用，效果會更加理想。3.本發明的方法回收的片狀載體可以二次利用，不僅降低了細胞發酵的生產成本，而且減少了丟棄的片狀載體的堆積，減少環境污染緩解環境壓力，因此本發明對環境保護就有積極作用。
具體實施例方式實施例一回收NBS公司Fibra disk載體
(I)純水清洗上一批次細胞發酵結束后，從細胞反應器中取出片狀載體，用40°C的溫熱純水浸泡20分鐘后，反復輕柔的搓洗片狀載體，中間不斷換水，直至浸泡片狀載體的純水用肉眼觀察為無色，看不到雜質，用漏盆浙干。(2)堿液浸泡用純水和分析純NaOH配制O. 5mol/L的NaOH (分析純)溶液，將經步驟(I)處理并浙干后的片狀載體按比例10ml/g的比例浸入該NaOH (分析純)溶液中，浸泡I小時后用純水反復清洗，用PH試紙測定為至弱堿性為止，用漏盆浙干。(3)胰酶消化用O. 25g胰蛋白酶，IOOmlPBS配制濃度為O. 25%的胰蛋白酶溶液，將經步驟⑵處理并浙干后的片狀載體按比例10ml/g的比例浸入胰蛋白酶溶液中在 37 38°C下消化2小時后用純水反復清洗干凈，用漏盆浙干。(4)酸液浸泡用純水和濃鹽酸配制O. 5mol/L鹽酸溶液，將經步驟(3)處理并浙干后的片狀載體按比例10ml/g的比例浸入該鹽酸溶液中，浸泡O. 5小時后用純水反復清洗，用PH試紙測定至PH值在中性附近，再用超純水反復清洗3到6遍，清洗后倒出的水中無雜質，用漏盆浙干。(5)烘干放入電烘箱內在40°C下干燥10小時，去除片狀載體上的水分，使之干燥。將回收的片狀載體在用較多的細胞培養級的超純水侵泡I小時以上，然后按以下方法進行細胞發酵，然后測試細胞耗糖量、耗氧量、病毒收獲量、病毒滴度參數，結果參見表 I。將新NBS公司Fibra disk片狀載體與本實施例回收一次的載體進行參數對比實驗，其中所用反應器型號為NBS 510型40L反應器，添加載體1200g，細胞株為PK-15細胞， 接種總量為5*109個、接毒豬圓環2型病毒(PCV2)，接毒MOI相同。
表權利要求
1.一種回收片狀載體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)純水清洗用溫熱純水浸泡細胞發酵結束后所取出的片狀載體，然后清洗，直至清洗片狀載體的純水用肉眼觀察為無色且無雜質，浙干；(2)堿液浸泡經步驟(I)處理后的片狀載體置于堿液中浸泡，然后用純水清洗至清洗后倒出的水無肉眼可見雜質，浙干；(3)胰蛋白酶溶液消化經步驟(2)處理后的片狀載體置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后再用純水清洗至清洗后倒出的水中無肉眼可見雜質，浙干；(4)酸液浸泡步驟(3)處理后的片狀載體置于酸性溶液中浸泡以恢復其功能，然后用超純水清洗干凈，至PH值為中性，清洗后倒出的水中無肉眼可見雜質，浙干；(5)干燥對步驟(4)處理后的片狀載體進行干燥處理，去除水分使之干燥。
2.根據權利要求I所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對經過堿液處理后的片狀載體用純水清洗至呈弱堿性。
3.根據權利要求I或2所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(2)所述的堿液與片狀載體比例為l(T20ml/g ;所述的堿液采用濃度為O. Γ0. 5mol/L的分析純氫氧化鈉溶液或分析純氫氧化鉀溶液；所述堿液浸泡時間為O. 5 4h。
4.根據權利要求3所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述胰蛋白酶溶液與片狀載體間的比例在l(T20ml/g范圍內。
5.根據權利要求4所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)中胰蛋白酶溶液浸泡時間為O. 5^2h ;所述的胰蛋白酶溶液的質量體積濃度在O. 0259Γ0. 25%范圍內。
6.根據權利要求5所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)的胰蛋白酶溶液的質量體積濃度在O. 159ΓΟ. 25%范圍內。
7.根據權利要求6所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(4)的酸性溶液與片狀載體間的比例在l(T20ml/g范圍內。
8.根據權利要求7所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述的酸性溶液采用O.Γ0. 5mol/L鹽酸溶液。
9.根據權利要求8所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(4)中酸性溶液浸泡時間為O. 5 lh。
10.根據權利要求9所述的回收片狀載體的方法，其特征在于，所述步驟(5)的干燥溫度在4(T50°C范圍內，干燥時間在8 10小時范圍內。
全文摘要
本發明公開了一種回收片狀載體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用溫熱純水浸泡細胞發酵結束后所取出的片狀載體，然后清洗；(2)堿液浸泡經步驟(1)處理后的片狀載體置于堿液中浸泡，然后清洗；(3)胰蛋白酶溶液消化經步驟(2)處理后的片狀載體置于胰蛋白酶溶液中浸泡消化，然后清洗；(4)酸液浸泡步驟(3)處理后的片狀載體置于酸性溶液中浸泡，以恢復其功能性；(5)干燥對步驟(4)處理后的片狀載體進行干燥處理，去除水分使之干燥。該方法簡單易行，回收成本低廉，且對環境保護有積極作用。
文檔編號C12M3/00GK102586107SQ20121003868
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者羅乃杰, 蔣天華, 趙立民 申請人:廣東溫氏食品集團有限公司