專利名稱：一種快速鑒別牛羊肉的試劑盒與使用方法
技術領域：
本發明涉及ー種快速鑒別牛羊肉的試劑盒和使用方法，屬于食品檢測領域。
背景技術：
改革開放以來，我國的肉牛產業得到了迅速的發展，經過20多年的快速發展，從二十世紀九十年代開始，我國肉牛存欄數量躍居世界第一位，牛肉產肉躍居世界第三位。在這20多年里，我國的經濟也取得了年均9%以上的高速發展，人們生活水平迅速提高，對牛肉的需求快速増加。正是由于肉牛產業的這種快速發展，才滿足了國內對牛肉快速增長的需求，牛肉價格也穩步提高。1999年我國的肉牛數量到達了發展的頂峰，此后，由于受到農村機械化的推廣和普及，與外出打エ等相比肉牛養殖的比較效益下降，肉牛的存欄數量開始呈逐年下降的趨勢，但牛肉產量仍保持小幅上升的趨勢。同期，我國的經濟仍保持高速增加，人們生活越來越富裕，對牛肉的需求進一歩快速增長。此時，僅依靠國內的肉牛產業已經無法滿足對牛肉的需求，刺激牛肉價格進一歩上漲，2011年普通牛肉達到了 40-45元/千克的歷史最高點，優質牛肉價格普遍在200元/千克以上，最高價格達到了 1000-2000元/ 千克。牛肉價格的飛速上漲和短缺導致國外的牛肉大量通過走私等途徑進入中國，同吋，國內也出現了很多不和諧的現象，2011年4月份安徽首次曝光了利用牛肉膏等添加劑使豬肉變牛肉的事件，此后，在全國多個省市均發現了類似的產品。一時間，人們對牛肉等食品安全的關注成為了全社會的焦點。其實，牛肉市場面臨的豬肉變牛肉事件僅是冰山的一角。在社會上還大量存在著用雞肉、鴨肉等低價肉甚至是ー些病死肉加工冒充牛肉的現象。目前社會上銷售的低價牛肉和牛肉片，幾乎都是非牛肉加工而成。因為目前活牛的價格已經達到18-20元/千克，而每千克活牛只能出0. 4-0. 5千克牛肉，因此，每千克牛肉至少要達到36元以上才有可能盈利。屠宰場和銷售商不可能賠錢賺吆喝。羊肉由于其價格高于普通牛肉，其市場面臨著與普通牛肉完全一祥的情況。面對牛羊肉市場存在的亂象，人們只能從色澤、氣味、弾性等多個方面進行初步鑒別，但大多數消費者都不可能掌握這種專業知識，很難對生牛肉進行鑒別，對加工后的牛肉則更是難以鑒別。目前社會上缺乏牛羊肉的準確鑒別技木。通過現代化的DNA鑒定技木， 可以進行鑒別。早在2008年新華每日電訊就報道過杭州ー個市民買10元牛肉花觀00元進行DNA鑒定的事件，2010年中新網報道了寧波ー個消費者花1800元通過DNA親子鑒定技術鑒別牛肉真假的事件，表明這種方法雖然能夠鑒別，但所需時間長，費用高。因此，迫切需要建立一種簡單、快速、廉價的牛羊肉鑒別技木，以維護牛羊肉市場的安全，保護廣大消費者的身體健康。

發明內容
本發明的目的是針對國內外已有方法在檢測技術上存在著操作復雜、耗時、重復性低、檢測成本高等不足之處，在檢測技術上加以改迸。動物線粒體DNA編碼序列具有高度保守性，對于物種的鑒定具有很高的可信度和準確性。環介導等溫擴增技術(LAMP)是由日本學者Notomi T等0000)設計創立的，這種新型核酸擴增技術具有靈敏度高、反應迅速， 特異性強等優點。本發明利用LAMP技術和動物線粒體DNA相結合對牛羊肉進行鑒定，整個反應可在恒溫狀態下經過Ih就可完成，而且可以通過肉眼觀察到反應結果。本發明的技術方案是一種快速鑒別牛羊肉的試劑盒，包含以下組分(1)反應液每23yL的反應液中含有12. 5yL 2X等溫反應緩沖液、1 μ L5 μ M Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3>2μ L 20 μ M Primer FIP>2y L 20 μ M PrimerBIPU μ L Bst DNA聚合酶、3. 5μ L水，其中Prime μ F3(Forward Outer F3) :AACAGCTTAAAACTCAAAGGA(SEQ NO. 1)Primer B3 (Reverse Outer B3) :AGCCCATTTCTTCCCATT(SEQ NO. 2)Primer FIP (Forward Inner FIP) TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGG CGGTGCTTTATATCCTT(SEQ NO. 3)Primer BIP (Reverse Inner BIP) CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACA CCTTGACCTAACGT(SEQ NO. 4)2X等溫反應緩沖液含有40mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl (pH8. 8)、 20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜堿、2. 8mM dNTP。(2)染料每23 μ L的反應液加入染料1 μ L，所述染料優選為Loopamp Fluorescent Detection Reagent (Loopamp 焚光檢測試齊[J )。其使用方法為按照常規方法提取待測樣品的DNA，取IyL DNA加入試劑盒中， IOOOOrpm瞬時離心30秒混勻，60°C下恒溫水浴培養45min，根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成緑色，則說明待測樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測樣品中不存在牛羊肉。本發明的優點1、高特異性能準確的鑒別出是否是牛羊肉，準確率高達99%以上。2、高靈敏度僅需極微量樣品即可(所需模板達到10個拷貝或更少)。3、鑒定簡便只要將檢測樣品的DNA加入試劑盒中放入60°C恒溫水浴一定時間后，通過肉眼觀察即可判定結果。4、快速高效整個過程1小時之內就可完成。本發明的檢測體系可以在恒溫條件下，快速、方便、高效、高特異性、高靈敏地檢測到牛羊肉，不需要復雜的儀器，檢測成本大大低于現有技木，能滿足當前畜禽肉類市場摻假檢測的迫切需要，可廣泛用于進出口檢疫部門、食品衛生檢測部門等的現場快速檢測，易于大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。


圖1為本試劑盒對各種畜禽DNA進行檢測試驗圖。圖2中自左向右DNA順序為 陽性對照，陰性對照，豬肉、牛肉、鴨肉、羊肉、兔肉；結果顯示 第1、4、6管為綠色，其余的枯黃色。圖2為PCR檢測方法靈敏度示意圖，其中自左向右依次為以10人1(Γ2.........1(Γ7稀釋度的Positive Control DNA(PC DNA)為模板的樣品和標準品的PCR
檢測圖。
具體實施例方式實施例1 試劑盒的構建(1)從GenBank中檢索獲得牛452bp 12s RNA序列，并進行軟件比對分析，確定序列的準確性。(2)根據上述序列利用I^rimerExplore軟件設計，并篩選出最佳引物Primer F3 :AACAGCTTAAAACTCAAAGGA(SEQ NO. 1)Primer B3 :AGCCCATTTCTTCCCATT(SEQ NO. 2)Primer FIP :TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATC CTT(SEQ NO. 3)Primer BIP :CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAAC GT(SEQ NO. 4)(3)構建試劑盒試劑盒構成12. 5 μ L 2Χ等溫反應緩沖液、1 μ L 5 μ M Primer F3、l μ L 5 μ MPrimer Β3>2μ L 20 μ M Primer FIP>2y L 20 μ M Primer BIPU μ L Bst DNA
1 μ L 染料(Loopamp Fluorescent Detection Reagent)、3· 5 μ L 其中2X 等溫反應緩沖液由日本榮研化學株式會社提供，含有40mM的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8. 8)、 20mM的氯化鉀、16mM的硫酸鎂、20mM硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜堿、2. 8mM dNTP。(4)標本的采集嚴格無菌采集各種畜禽DNA的新鮮肌肉組織，采用酚仿提取法提取組織樣的基因組DNA。(5)取1 μ L DNA加入步驟(3)的試劑盒中，IOOOOrpm瞬時離心30秒混勻，60°C下恒溫水浴培養45min，根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成緑色，則說明待測樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測樣品中不存在牛羊肉。(6)靈敏度和特異性檢驗采用豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、兔肉來檢測特異性，結果顯示，該試劑盒的特異性測試良好(如圖1所示)。以 10人10づ.........1(Γ7 稀釋度的 Positive Control DNA (PC DNA)為模板分別
進行LAMP和PCR比較兩種檢測方法的靈敏度，結果顯示，LAMP法的擴增靈敏度比普通PCR 法要高。普通PCR可以檢測到7個稀釋梯度中的第三個梯度(如圖2所示)，而LAMP法可以檢測到第四個梯度。實施例2 樣品檢測(1)從山東省內屠宰廠生產線采集鮮牛肉樣品45個，鮮羊肉樣品32個，鮮雞肉樣品70個，鮮鴨肉樣品50個，鮮兔肉樣品30個，分別提取DNA，用試劑盒進行檢測。檢測結果如表1 表1山東省內屠宰廠生產線牛羊肉檢測結果
權利要求
1.ー種快速鑒別牛羊肉的試劑盒，其特征是，包含以下組分(1)反應液每23 μ L的反應液中含有12. 5 μ L2 X等溫反應緩沖液、IyL 5μΜ Primer F3U μ L 5μΜ Primer Β3>2μ L 20 μ M Primer FIP>2y L 20 μ M Primer BIPU μ L Bst 3. 5μ L水，其中Primer F3 :AACAGCTTAAAACTCAAAGGAPrimer B3 :AGCCCATTTCTTCCCATTPrimer FIP :TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTTPrimer BIP :CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT2 X等溫反應緩沖液含有40mM的pH8. 8的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、20mM的氯化鉀、 16mM的硫酸鎂、20mM的硫酸銨、20%的Tween20、l. 6M甜菜堿、2. 8mM dNTP ；(2)染料每23 μ L的反應液加入染料1 μし
2.如權利要求1所述的ー種快速鑒別牛羊肉的試劑盒，其特征是，所述染料為Loopamp 熒光檢測試劑。
3.權利要求1或2所述的試劑盒的使用方法，其特征是，按照常規方法提取待測樣品的 DNA，取1 μ L DNA加入試劑盒中，IOOOOrpm瞬時離心30秒混勻，60°C下恒溫水浴培養45min， 根據反應液顏色進行陰陽性判斷，若反應液變成緑色，則說明待測樣品存在牛羊肉，若為桔黃色，則待測樣品中不存在牛羊肉。
全文摘要
本發明公開了一種快速鑒別牛羊肉的試劑盒與使用方法，屬于食品檢測領域。本發明試劑盒由1組具有高特異性的引物、2×等溫反應緩沖液、Bst DNA聚合酶和染料共同組成。經檢測驗證，本發明試劑盒能快速、方便、高效、高特異性、高靈敏性的鑒別出牛羊肉與非牛羊肉。鑒別準確率高達99％以上，檢測過程不需特殊的儀器，結果通過肉眼即能判定，整個檢測不超過1小時，單個樣品檢測成本不超過100元，規模化生產后成本更低。本試劑盒廣泛適用于各檢測單位對牛羊肉的現場快速檢測和專業判定，普通消費者、專業檢測人員等均可輕松使用。本發明還包括牛羊肉快速鑒定試劑盒的構建方法，利用該方法，可快速構建特定的檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102534035SQ201210039640
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者萬發春, 劉曉牧, 劉桂芬, 宋恩亮, 成海建, 譚秀文 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所