專利名稱：棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因。
背景技術(shù)：
Mills最初發(fā)現(xiàn)動物細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化作用的GPX，其功能被認(rèn)為是防御紅血球氧化引起的溶血，并將其命名為谷胱甘肽過氧化物酶。過去一直認(rèn)為這是經(jīng)典的GPX，現(xiàn)在把具有這種功能的酶命名為GPX-1.后來，F(xiàn)lohe研究小組純化并分析了分布在細(xì)胞中并作用于各種有機過氧化物及H2O2的GPX，研究表明它是由4個蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成的四聚體，每個亞基各含1個硒半胱氨酸，并且它是以離子化硒醇(selenol)的形式形成酶的氧化還原活性中心。大量的研究表明，哺乳動物的GPXs有著較高的催化活性，可迅速清除體內(nèi)產(chǎn)生的多余的活性氧(R0S)，并且GPXs多數(shù)以谷胱甘肽GSH(glutathione)作為底物催化分解生物體內(nèi)產(chǎn)生的H202。目前，根據(jù)GPXs所包含的半胱氨酸殘基的不同，可簡單將其分為含硒和不含硒兩大類。植物中同樣也存在屬于GPX家族的酶類，直到最近幾年，在植物中也開展了 GPXs 的功能研究，最初的研究是從煙草的葉片里克隆了與動物依賴硒的GPXs有著較高同源性的cDNA。后來從柑橘、擬南芥、和中國大白菜等多種植物中分離得到了類似基因。研究發(fā)現(xiàn)，不同于動物基因組GPXs核苷酸UGA終止密碼子處插入的硒代半胱氨酸殘基，植物基因組GPXs核苷酸序列攜帶的是一個半胱氨酸殘基。動物中含硒代半胱氨酸殘基的GPXs有較強的催化活性，而植物中多數(shù)是半胱氨酸殘基，這就大大降低了 GPXs在植物中的催化作用。然而，也有人在研究柑橘的GPXs時，用硒代半胱氨酸殘基代替了半胱氨酸殘基，卻沒有出現(xiàn)類似于哺乳動物的GPXs的活性。植物中GPXs的結(jié)構(gòu)、對底物的特異性及在植物組織的分布上都不相同，它們對抵御外界脅迫起了很重要的作用，但我們對其功能及結(jié)構(gòu)特性的認(rèn)識仍很有限，還需要做大量的工作。因此，克隆和鑒定植物中GPXs，研究抗逆機制以及與逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、 表達、功能及調(diào)控，可為充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟鼓嫘裕M行植物品種改良。本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列。由所述的一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。由所述的一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
所述的棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明從山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心園藝作物生物技術(shù)研究室構(gòu)建壺瓶棗 iZiziphus jujuba Mill hupingzao)結(jié)果枝(即棗吊)cDNA文庫中篩選到棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因的全序列，將其命名為ZjGPXiZiziphus Jujuba glutathione neroxidase)。 生物信息學(xué)分析表明^ζ/β吁基因cDNA序列全長為510bp，編碼170個氨基酸，其中包含有 16個酸性氨基酸，19個堿性氨基酸，計算得知蛋白質(zhì)的相對分子量為19. ^KD,理論等電點為5. 00，脂肪指數(shù)為76. 69。根據(jù)棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因cDNA編碼的序列，設(shè)計帶有^I和5 I 酶切位點的特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其上游引物為 GYl的序列為5' —ACGAATTCTCATGACTAGCCAGC—3'，包含I限制性酶切位點(即有下劃線部分)，三個保護堿基ACG及此蛋白的起始密碼子ATG。下游引物為GY2的序列為5'— ATCCCGGGTTGAGATTCCCAAGA— 3',包含該Sim I限制性酶切位點(即下劃線部分)，兩個保護性堿基AT及谷胱甘肽過氧化物酶的終止密碼子TGA。經(jīng)限制性內(nèi)切酶^I和5 I修飾后連接于植物表達載體PES (K) -LNY上，然后再經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子、PCR 鑒定、酶切鑒定、測序證明植物表達載體PES (K)-LNY-ZjiKT構(gòu)建成功。通過凍融法將攜帶目的基因的植物表達載體PES (K) -\m-ZjGPX轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子、PCR鑒定、酶切鑒定、測序證明工程菌PES (K)-LNY-ZjiKT 構(gòu)建成功。農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)含卡那霉素的V2MS培養(yǎng)基篩選獲得含有目的基因ZjGPX的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株Ttl代，經(jīng)PCR鑒定目的基因證實Zj^KT成功轉(zhuǎn)入擬南芥。將轉(zhuǎn)基因的T2代擬南芥種子和野生型(WT)擬南芥種子均播種在加不同濃度 NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，對轉(zhuǎn)吁基因植株及其T2代進行耐鹽性評價，觀察其生長狀況， 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)^ζ/β吁基因擬南芥植株在鹽脅迫處理下長勢和根系明顯好于野生型(WT)擬南芥植株。將長出2片真葉的轉(zhuǎn)Zj^KT基因的T2代擬南芥植株和野生型(WT)擬南芥植株進行耐鹽、耐旱脅迫處理，15天后觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Zj^KT基因的擬南芥耐鹽性明顯提高， 轉(zhuǎn)Zj^KT基因的擬南芥耐旱性明顯提高。本發(fā)明為了進一步研究Zj^KT基因在棗樹體內(nèi)的表達，分別對辣椒棗組培苗進行干旱、NaCl脅迫處理，研究逆境因素對Zj^KT基因表達的影響。CTAB法提取所辣椒棗組培苗的總RNA，經(jīng)OD26tl值測定、甲醛變性膠電泳等方法檢測證明所提RNA濃度和純度都符合標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量合格。反轉(zhuǎn)錄所提總RNA，定量PCR檢測結(jié)果分析證實Zj^KT可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導(dǎo)表達。此外，本發(fā)明為了進一步研究棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因Zj^KT及編碼蛋白 ZjGPX,本發(fā)明構(gòu)建了重組原核表達載體pGEX-4T-2-ZjGPX，實現(xiàn)其在大腸桿菌(五colO BL21 (DE3)中的原核表達，為該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控等方面研究提供了一定的實驗數(shù)據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次從棗樹中分離出棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因 ZjGPX，該基因作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟鼓嫘裕瑢τ谥参锲贩N改良具有重要的現(xiàn)實意義，對于具有優(yōu)良抗性的植物的抗逆機制的深入研究，有助于明確逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達、功能及調(diào)控，為進一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因來提高植物的抗逆性提供一定的實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)，同時有助于了解GPXs在植物活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，促進人們對活性氧作為信號分子的了解。


圖1為Zj^KT與已知基因氨基酸同源性對比樹狀圖。圖2為棗樹谷胱甘肽過氧化物酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。圖3為PCR目的基因產(chǎn)物圖譜。圖4為pGEX-4T-2及目的基因ZjGPX酶切圖譜。圖5為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖。圖 6 為工程菌 ρ6ΕΧ-4Τ-2-Ζ7·β°/"Β 的 PCR 鑒定圖。圖 7 為誘導(dǎo)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析。圖8為IPTG對蛋白表達量的影響與融合蛋白的純化。圖9為PCR目的基因產(chǎn)物圖譜。圖10為PEZR⑷-LNY及目的基因的酶切圖譜。圖11為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜。圖12為篩選出的轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥Ttl代幼苗。圖13為篩選出的轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥Ttl代植株。圖14為轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥T1不同株系擬南芥基因檢測。圖15為轉(zhuǎn)ZjK吁基因擬南芥和WT擬南芥種子在不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況。圖16為轉(zhuǎn)ZjK吁基因擬南芥和WT擬南芥植株在不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上根系的生長情況。圖17為轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥和WT擬南芥植株鹽脅迫后生長情況的對比圖。圖18為轉(zhuǎn)Zj^KT基因擬南芥和WT擬南芥植株干旱脅迫后生長情況的對比圖。圖19為RNA甲醛變性膠電泳圖譜。圖20為辣椒棗組培苗經(jīng)不同濃度的NaCl脅迫后的Zj^KT相對表達量的對比表。圖21為辣椒棗組培苗經(jīng)PEG-6000脅迫(模擬干旱處理)后的Zj^KT相對表達量的對比表。
具體實施例方式實施例1 棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因ZjGPX的生物信息學(xué)分析
本發(fā)明從山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心園藝作物生物技術(shù)研究室構(gòu)建壺瓶棗 (Mziphus jujuba Mill hupingzao)結(jié)果枝(即棗吊、落性枝)cDNA文庫中篩選到棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因ZjGPX的全序列。將所測定Zj^KT基因序列通過Blastx搜索NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫，進行序列相似性分析；用DNAMar進行氨基酸序列比對并做此蛋白的進化樹；用ProtParam計算蛋白質(zhì)的相對分子量和理論等電點；連接至http://WWW. expasy. org/prosite進行保守序列分析；將此蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析表明棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因cDNA序列為全長510bp的開放讀碼框(0RF)，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫Blastx搜索進行序列相似性分析表明，該蛋白與已知的其它植物谷胱甘肽過氧化物酶具有極高的同源性，與蓖麻的同源性為95%，楊樹的同源性為93%，擬南芥的同源性為93% ；對Zj^KT蛋白的氨基酸序列與其它屬的物種的谷胱甘肽過氧化物酶用DNAMar構(gòu)建進化樹，如圖1所示，棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因的氨基酸序列和蓖麻的GPX親緣關(guān)系最近，7個物種的谷胱甘肽過氧化物酶被聚為5個類群，擬南芥和楊樹聚為一類；玉米和高粱聚為一類；棗、葡萄、蓖麻單獨聚為一類；聚類分析還表明棗谷胱甘肽過氧化物酶和6物種GPX的氨基酸同源性均達到73. 8%以上；ZjK吁基因cDNA序列全長為510bp，用ProtParam分析該序列得，它編碼170個氨基酸，其中包含有16個酸性氨基酸，19個堿性氨基酸，計算得知蛋白質(zhì)的相對分子量為19. ^KD,理論等電點為5. 00， 脂肪指數(shù)為76. 69 ；連接至http://WWW. expasy. org/prosite進行保守序列分析，結(jié)果表明該基因編碼的蛋白具有一個谷胱甘肽過氧化物酶活性位點，其氨基酸序列為第31個氨基酸到第46個氨基酸“GKvLLIvNVaSkCGmT”，還有一個谷胱甘肽過氧化物酶保守肽段，其氨基酸序列為“LAFPCNQF”，即第68個氨基酸到第75個氨基酸；在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中搜索到 ^ζ/β吁同源模型 2p5rA，用 Swiss Model 程序(http//au. expasy. org/tools/)進行同源建模(homology modeling)，推測ZjK吁基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖2所示，棗樹谷胱甘肽過氧化物酶與白楊樹谷胱甘肽過氧化物酶有極高的相似性，推測其可能與白楊樹谷胱甘肽過氧化物酶有著相似的功能。上述生物信息學(xué)分析方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)手段。實施例2 =Zj^KT基因原核表達載體的構(gòu)建 1.材料、試劑及儀器
1.1載體和菌株
大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a菌株；克隆載體pSPORTl-ZjGPX、原核表達載體 PGEX-4T-2均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心園藝作物研究室保存。1. 2酶與試劑盒
DNA回收試劑盒QIAquick 購自QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶及油辦I ,Sma I ,Sal I、 T4DNA 連接酶、DNA Marker (15000bp、2000 bp ladder)等均購自大連 TaKaRa (寶生物)工程有限公司。1.3試劑及儀器設(shè)備
抗生素氨芐青霉素購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。質(zhì)粒提取、瓊脂糖凝膠電泳中所用的其他試劑均購自天津天大化工。主要的儀器設(shè)備有電子天平(Sarorius BS200s_WEl)、超凈工作臺(上海迅博醫(yī)療設(shè)備廠Vs-840-2)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進醫(yī)療器械一廠Ρ -DHS)、高壓滅菌鍋 (Τ0ΜΥ SS-325)、高速冷凍離心機(Thero HP-62)、高速臺式冷凍離心機(Beck man J-25)、 PCR擴增儀(Eppendorf AG)、UVP凝膠成像分析儀(美國BioSpectrum 600)、真空干燥箱 (ΗΕΤ0 VR-I )、水浴恒溫振蕩器(國華企業(yè)SHZ-82A)、電熱恒溫水浴鍋(天津市華北實驗儀器有限公司)、恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)、恒溫磁力攪拌器(江蘇金城國勝實驗儀器廠79W-1)、DYY-6B型電泳儀(北京市六一儀器廠)、JY-DF系列電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、Saritorius PH計、分光光度計(印pendorf BioPhotometer)。2.實驗方法
2.1大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制作用CaCl2法制備大腸桿菌(五C07i)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，具體方法見精編分子生物學(xué)實驗指南，與細(xì)菌接觸的液體及容器都需經(jīng)過滅菌處理。2.2 PCR引物的設(shè)計與合成
根據(jù)棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因cDNA編碼的序列，設(shè)計帶有ife // I和5 I酶切位點的特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因的上游引物Gl序列為5’—— TATGGATCCATGACTAGCCAGCCCA——3’，包含BamH I限制性酶切位點(即有下劃線部分)，三個保護堿基TAT，及谷胱甘肽過氧化物酶Zj^KT基因的起始密碼子ATG。下游引物G2的序列為5’——ATCCCGGGTCATGAGATTCCCAAGA——3’，包含fe I限制性酶切位點(即有下劃線部分)，兩個保護堿基AT，及谷胱甘肽過氧化物酶Zj^KT基因的終止密碼子TCA。2. 3載體pGEX-4T-2的制備及目的基因ZjGPX的擴增 2. 3. 1堿裂解法快速提取質(zhì)粒pGEX-4T-2和pSPORTl-Zj^KT
堿裂解法快速提取質(zhì)粒PGEX-4T-2和pSPORTl-Zj^KT，具體步驟見精編分子生物學(xué)實驗指南。2. 3.2目的基因序列的擴增
以克隆載體PSP0RT1 (攜帶目的片段)為模板，用設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增。先利用梯度PCR技術(shù)設(shè)置不同的溫度，找出最佳退火溫度為61°C。PCR 反應(yīng)體系=IOXPCR buffer 5μ1 (含 Mg2+離子)，dNTP μ ，上下游引物各 μ (20pmol/L)，rTaq聚合酶0. 3μ1，模板DNA Ιμ1(2. 3μβ/μ1 )，滅菌超純水加至總體積為50μ1。 擴增條件為95°C預(yù)變性5 min，94°C變性1 min，61°C退火1 min，72°C延伸2 min，共40個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。2. 4目的基因ZjGPX和載體pGEX_4T_2的BatnH I和Sma I酶切
利用BamH I和Sma I分別酶切目的基因ZjGPX的PCR產(chǎn)物和載體pGEX_4T_2。目的基因ZjGPX的PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體系如下
注PCR產(chǎn)物的體積依據(jù)其濃度而定，最少酶切1 目的基因片段。最后加超純水至總體積為50μ1。 載體pGEX-4T-2的酶切反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，其特征是該基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，其特征是該基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列是如SEQ ID N0:2所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，其特征是該基因的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，其特征在于，該基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因，該基因的核苷酸序列以及氨基酸序列是如序列表中所示SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，本發(fā)明構(gòu)建植物表達載體，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，對其進行耐鹽性和耐旱性評價，證明該基因作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锟鼓嫘裕瑢τ谥参锲贩N改良具有重要的現(xiàn)實意義，對于具有優(yōu)良抗性的植物的抗逆機制的深入研究，有助于明確逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達、功能及調(diào)控，為進一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因來提高植物的抗逆性提供一定的實驗數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)，同時有助于了解GPXs在植物活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，促進人們對活性氧作為信號分子的了解。
文檔編號C12N9/08GK102533809SQ20121004213
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月23日
發(fā)明者孟玉平, 張春芬, 張曉娟, 曹尚銀, 曹秋芬, 薛華柏 申請人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心, 山西維民生科技有限公司