專利名稱：一組肝癌血清核酸適配子的制作方法
技術領域：
本項發明屬生物醫學檢測分析技術領域。
背景技術：
核酸適配子(aptamer)是一種生物祀分子的人工單鏈寡核苷酸配體,通過SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術從隨機單鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。核酸適配子篩選的基本步驟如下設計并合成隨機單鏈寡核苷酸文庫；將文庫與靶標共孵育，使文庫中能與靶標特異性結合的寡核酸與靶標形成復合物，分離復合物并洗脫寡核酸，以洗脫的寡核酸為模板進行PCR擴增，制備成新的單鏈隨機寡核苷酸文庫，開始下一輪篩選；重復數輪孵育-洗脫-擴增，與靶標高特異性和高親和力結合的核酸序列將從文庫中篩選出來并被指數富集；對最后一輪篩選后制備的文庫進行克隆、測 序，其中長度及兩端序列與文庫相符者即為核酸適配子；測定各核酸適配子與靶標結合的特異性和親和力，選出能高特異性和高親和力結合靶標者，即可應用于靶標的檢測分析。核酸適配子的功能與抗體類似，但與抗體相比具有許多優點①高特異性和高親和力核酸適配子能夠分辨出靶分子結構上細微的差別，親和力甚至強于天然配體；②靶標廣泛從有機小分子、生物大分子到病毒顆粒、完整細胞等均可作為篩選核酸適配子的靶標；③穩定性好核酸適配子可長期保存，通過人工合成而無批間差異，可在常溫下運輸；④改建和修飾容易可在核酸適配子的特定部位進行精確的標記、修飾或核苷酸替換
應用優勢核酸適配子無免疫原性，可在體內反復使用；分子小，方便于體內影像診斷和治療。核酸適配子在人類疾病的診斷方面顯示出良好的應用前景。Golden等用核酸適配子檢測堿性成纖維生長因子(bFGF)，其敏感性高于商業化ELISA試劑盒近20倍，且特異性良好。Liu等用核酸適配子納米傳感器可以快速、敏感、特異地檢出循環血液中的腫瘤細胞。McCauley等研制出核酸適配子型生物傳感器陣列，能特異且定量檢測出與血清或細胞提取物混合的3種腫瘤標記物。Hicke等用放射性核素標記黏韌素-C的核酸適配子，成功應用于人膠質母細胞瘤和乳腺癌動物模型的腫瘤顯像。原發性肝癌(下稱肝癌)是常見惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢。近年來肝癌的治療手段有了長足的進步，但是5年生存率仍不理想。據國內大樣本多中心臨床資料統計顯示，住院肝癌患者的5年生存率只有32. 5%，晚期肝癌I年生存率僅14. 7%，3年生存率為0. 3%，5年生存率為0，而早期肝癌患者及時治療后，1、3、5年生存率分別達到93. 5%、70. I %和59. I %。因此，盡早診斷與盡早治療是目前改善肝癌患者預后最有效的手段，探索與建立有效的肝癌診斷新方法具有十分重要的意義。目前影像學檢查是肝癌定位診斷的主要依據，血清標志物檢測是肝癌定性診斷主要的依據。影像學診斷肝癌后，還需要進一步檢測肝癌血清標志物進行印證，對于影像學診斷困難的小肝癌，標志物檢測是唯一的無創性診斷手段。血清標志物具有易檢測、可重復、侵入少的特點，在肝癌的診斷中占有重要的地位。甲胎蛋白(AFP)是目前全世界應用最廣泛的肝癌血清標志物，已經用了數十年，但其敏感性(40%飛5%)、特異性(769Γ9690并不理想。因此，尋找更加特異、更加靈敏的肝癌血清標志物一直是各國學者的研究熱點。篩選肝癌特異的核酸適配子，籍于其在診斷應用方面的優勢，為肝癌診斷建立更為特異和敏感的方法，對于提高肝癌的診療水平具有十分重要的價值。

發明內容
本發明的目的尋找一組具有應用價值的肝癌血清核酸適配子，可作為分子探針應用于肝癌的檢測分析，為肝癌的臨床診斷、治療和預后判斷提供有重要價值的生物信息。本發明采用的技術方案采用常規聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度測定技術，對通過SELEX技術篩選并初步鑒定價值較大的一批肝癌血清核酸適配子進行分析，評估它們對肝 癌的診斷效率，確定其中有重要應用價值的核酸適配子。本組肝癌血清核酸適配子應用價值分析的步驟和主要結果如下。a.收集受試者的血清標本收集診斷明確的肝癌、肝硬化、乙型肝炎及正常人的非抗凝外周血標本并分離血清。隨機選取1(Γ20例肝癌血清標本等量混合制備肝癌混合血清，同法制備正常混合血清。b.篩選肝癌血清核酸適配子設計并合成隨機單鏈寡核酸文庫[5' -ACCGACCGT GCT GGA CTC T (N40) ACT ATG AGC GAG CCT GGC G-3/ ]及其配套的引物(上游引物5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3';下游引物5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAGT-3');將文庫與正常混合血清孵育，分離純化不與血清結合的核酸并進行不對稱PCR擴增，制備出新的文庫用于下一輪篩選；將第3輪篩選后制備的文庫與肝癌混合血清孵育，分離純化與血清結合的核酸并進行不對稱PCR擴增，制備出新文庫用于一下輪篩選；以第9輪篩選后制備的文庫為模板進行對稱PCR擴增，將擴增產物送生物工程公司克隆、測序，分離出單個核酸適配子；應用RNA Structure 4. 6軟件模擬分析各核酸適配子的二級結構,應用Clustal X軟件對各核酸適配子進行同源性分析和家族劃分，從各家族中選出代表性核酸適配子；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度分析技術分別測定各代表性適配子與肝癌混合血清和正常混合血清的結合程度，優選出能與肝癌混合血清特異性結合的核酸適配子。c.合成肝癌血清核酸適配子將步驟b優選出的能特異性結合肝癌混合血清的核酸適配子，送生物工程公司合成，用結合緩沖液配制成核酸適配子溶液。d.確定核酸適配子用量取最小量為2pmol的等差梯度量的步驟c配制的核酸適配子溶液，進行常規凝膠電泳和核酸染色，采集紫外濾光圖像并使用凝膠分析軟件測定核酸適配子帶的灰度值，以灰度值保持在線性范圍內的最大摩爾量確定為核酸適配子用量。e.確定血清標本用量以步驟d確定的核酸適配子用量與最小量為2 μ I的等差梯度體積的肝癌混合血清混合孵育，然后進行常規凝膠電泳和核酸染色，并采集紫外濾光圖像。凝膠圖像上可見結合核酸適配子帶和游離核酸適配子帶，使用凝膠分析軟件測定游離核酸適配子帶的灰度值，以灰度值保持在線性范圍內的最小灰度值者所對應的標本體積確定為標本用量。f.標本檢測及灰度測定以步驟d確定的核酸適配子用量和步驟e確定的血清標本用量為條件，將核酸適配子分別與肝癌、肝硬化、乙型肝炎、正常人的血清標本混勻后孵育，然后進行常規凝膠電泳和核酸染色，采集紫外濾光圖像并使用凝膠分析軟件測定各標本的游離核酸適配子帶的灰度相關指標。同時每塊凝膠均以結合緩沖液代替標本做一孔適配子對照。g.核酸適配子與血清的結合程度分析導出步驟f測定的各標本核酸適配子游離帶的灰度值(INT)、平均灰度值(INT/mm2)及其標準差3個指標的數據，并進行統計分析。在所分析的12個核酸適配子中，肝癌組灰度值明顯小于非肝癌組的核酸適配子見表I。表I 肝癌血清核酸適配子與肝癌和非肝癌血清標本的結合情況
權利要求
1.一組肝癌血清核酸適配子，其特征在于具有下列核苷酸序列(1)AP-HCS-9-10 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTATGGGCCTGGGCCGTGCAGTTAG CTCGGCGGTGTATTGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(2)AP-HCS-9-74 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTTGACCTAAGTTAGTGGTCCTGTT GATGGTTCGTGTGGTTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(3)AP-HCS-9-89 :5’ - ACCGACCGTGCTGGACTCTACAGAGTGCTTGATCTCGGGTT GTCGGTGTCGGTGGACTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(4)AP-HCS-9-132 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTAGGAGGGTGATGCAAATGGAC GTTCAGATTAGTGTGGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(5)AP-HCS-11-3 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTATGGAATGGATCGTTCTGTGTCG GGTCGTACGGGAGTGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(6)AP-HCS-11-4 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTATAGGCCGTTGATGCGCGGGAG GGTCGTTCGTAATGATTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(7)AP-HCS-11-5 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTATGAGCAGGGACATAGGGACGG TGTTTGGGAGTGGATTACAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(8)AP-HCS-11-6 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTTACACGCATTTGGTGATGTGTCA AGGTCAGTTCTGTGGGTAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(9 ) AP-HCS-11-10 :5 ’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTAGGGCGTGATCAGACGGTAGTT GGCGCTGAATTCGCGTTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’。
2.根據權利要求I所述的肝癌血清核酸適配子，其特征是通過核苷酸替換、顛倒、移位，或對核苷酸進行化學修飾，或延長或縮短序列所得到的核苷酸序列。
3.權利要求I或2所述的肝癌血清核酸適配子在肝癌患者標本的檢測分析中的應用。
全文摘要
一組肝癌血清核酸適配子，屬生物醫學檢測分析技術領域。本發明公開了9個以肝癌血清為靶標篩選出的肝癌血清核酸適配子的核酸序列，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度測定方法分析了它們與肝癌和非肝癌血清標本的結合程度，顯示每個核酸適配子對肝癌均具有良好的診斷價值，受試者工作特征曲線下面積達0.894~0.949，鑒別肝癌與非肝癌患者的準確度達84.4%~91.4%。這些核酸適配子可直接或修飾后應用于肝癌血清標本的分析，為肝癌的臨床診斷、治療和預后判斷提供實驗依據，也可應用于建立基于核酸適配子的肝癌檢測新技術，具有良好的應用價值。
文檔編號C12N15/115GK102732522SQ20121004527
公開日2012年10月17日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者呂農華, 張吉翔, 張焜和, 徐國峰, 李璇, 王婷, 陳文學, 魏淑琴 申請人:南昌大學