專利名稱：假單胞菌低溫啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體地涉及ー個來源于低溫假單胞菌啟動子及其原核表達載體和應用。
背景技術：
啟動子是基因的一個組成部分，通常位于結構基因5’端上游，是RNA聚合酶識別、 結合和開始轉錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導RNA聚合酶同模板正確結合，活化RNA 聚合酶，啟動基因轉錄，從而控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達的程度。在微生物的異源蛋白表達中，啟動子是影響異源表達效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效率表達外源基因的關鍵。當前，由于尚缺乏低溫蛋白的高效表達系統，使得低溫蛋白尤其是低溫酶的生產遠遠不能滿足科學研究及エ業應用的需要。目前常用的蛋白表達系統多以大腸桿菌和酵母菌等中溫菌作為宿主細胞，但由于大部分的低溫酶熱穩定性差，即使在中溫宿主細胞中大量表達，也常會因熱變性而失活。因此以嗜冷菌為宿主菌、以嗜冷菌啟動子為啟動子構建表達載體的方法越來越引起人們的重視。低溫啟動子的研究屬于剛剛起步階段，目前僅有Duilio等人從分離自南極的海洋低溫假交替單胞菌屬菌株/^ei/i/oaheroffloaasA^o/ ムflAiむTAC125中，通過構建文庫的方式，利用啟動子探針質粒iPseudoalteromonashaloplanktis TAC125為宿主細胞)，篩選到了能在4°C啟動轉錄的低溫啟動子。對這些啟動子的結構和功能的解析，為我們認識低溫啟動子在低溫下啟動的機制提供了生動的材料。但是由于低溫啟動子的發展才剛剛起歩，文獻及資料相對較少，在當前還未形成完整的體系和理論。低溫啟動子在結構上不能與常溫啟動子明顯區分開。ー些具有低溫啟動活性的低溫啟動子的各功能調控區與常溫啟動子相同或相似。而還有ー些具有低溫啟動活性的低溫啟動子則沒有明顯的保守結構序列，無法以常溫啟動子的保守序列為標準去確定其 10區、35區等低溫啟動子特定的各功能區及保守結構序列。因此大量分離低溫啟動子并分析其序列已成為當務之急。此外，以低溫菌為宿主細胞、利用來源于低溫菌的啟動子構建低溫蛋白表達系統最近已有部分報道，研究表明在常溫蛋白表達系統所難以表達的蛋白，包括來源于常溫菌的甲苯、ニ甲苯單加氧酶，來源于人類的神經生長因子在這些表達系統中均獲得了有效表達。尤其值得關注的是在低溫蛋白表達系統表達的神經生長因子不但沒有形成包涵體，而且準確定位于細胞的周質空間，充分體現了低溫蛋白表達系統的優越性，為異源低溫蛋白和常溫蛋白的高效表達提供了新的有效方法，通過構建以低溫菌為宿主的低溫蛋白表達系統是解決高效、大量生產熱不穩定蛋白質的一條可行之路。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種DNA分子，其來源于低溫假單胞菌作洲ゐ·/ ^ sp.MY1402，并具有下列核苷酸序列之一
a、具有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；
b、可與SEQID NO. 1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
c、對上述a或b所示核苷酸序列進行ー個或多個堿基的取代、缺失、添加、修飾的核苷酸序列；
d、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。本發明中所述DNA分子具有啟動子活性，能夠使目的基因在大腸桿菌和假單胞菌等原核細胞中表達，特別是在低溫下能夠高效表達。本發明另一目的是提供一種原核表達載體，該載體含有前文所述的DNA分子。本發明另一目的是提供一種原核宿主細胞，該細胞含有前文所述的DNA分子或原核表達載體。本發明另一目的是將DNA分子應用于原核異源表達系統中。本發明中所述原核異源表達系統為常溫表達系統或低溫表達系統。在本發明中，將SEQ ID NO. 1所示的啟動子序列稱為pi。在本發明中，無啟動子探針質粒稱為pUE，將含有SEQ ID NO. 1所示的啟動子序列的探針質粒稱為PUE1。菌株Aewi/offloaas sp. MY1402由本實驗室從梅里雪山明永冰川地區土樣中分離得到。本發明通過構建啟動子探針質粒篩選到高活性的低溫啟動子核苷酸片段，利用已分離出的具有高活性的原核生物啟動子序列構建重組表達載體，并在低溫下異源表達目的基因，該啟動子和目的蛋白的結構基因連接，且該基因受啟動子調控，結果目的基因在啟動子的調控下高效表達，并且該啟動子在15°C的低溫下也具有較高的啟動活性；該啟動子在不同原核生物中具有通用性，可用于構建在低溫下多個原核生物之間能夠通用的表達載體，以省卻在不同原核生物中表達外源基因需要更換載體的麻煩，提高分子生物學實驗效率；該啟動子還能夠用于在低溫下啟動低溫蛋白和低溫酶基因的表達，提高低溫蛋白和低溫酶的生產效率。本發明能夠為發展和完善低溫啟動子的基礎研究提供ー些材料和借鑒，并且能夠為蛋白(酶)特別是低溫蛋白(酶)的エ業生產提供新異源表達載體及啟動子序列，本發明可以應用于分子生物學實驗和低溫蛋白(酶)的生產。


圖1為本發明重組探針質粒構建示意圖。圖2為本發明中菌株MY1402基因組DNA的電泳示意圖，其中M為DL2，000 marker, 1是菌株MY1402基因組DNA。圖3為本發明中5^3A I酶切MY1402基因組的回收結果示意圖，其中M為DL2，000 marker, 1是用限制性內切酶及 /7 /和細菌用堿性磷酸酶(BAP)處理探針質粒pUE后的回收結果示意圖，2是用限制性內切酶ぶ仙劃I也iPseudomorms sp. MY1402基因組DNA后的回收結果示意圖。圖4為本發明中及 H I酶切pUE的回收結果示意圖，其中M是DL2，000 marker,1是小量酶切電泳圖，2是用限制性內切酶I處理探針質粒pUE的回收結果示意圖。圖5為本發明中pUE插入片段菌落PCR結果示意圖，其中M是DL5，000 marker, 1 是 pUE，2 是 DH5a /pUEl。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進ー步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容，本發明中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1 啟動子的篩選
1、可能的啟動子片段的制備提取假單胞菌屬作洲ふ sp. MY1402菌株的基因組 DNA，用酶Sau3A I部分酶切，同時回收大小為100 2，000個堿基的不同片段。提取菌株MY1402的基因組，最終提取結果見圖2，經測定，所提取的MY1402基因組的OD26tl=O. 0478，OD280=O. 0267，則MY1402基因組的濃度為 50X0D_=50X0. 0478 X 100=239 μ g/ml=239ng/ μ 1, OD260/ OD280=L 79，純度滿足使用的要求；
酶I部分酶切Psewi/offloftas sp. MY1402基因組的具體方法 把酶5^3A I直接稀釋至0.125 u/μ ，通過限制酶切時間來獲得所需要的片段，這樣實施例的可控性增強，具體的反應體系和時間如下
權利要求
1.ー種DNA分子，來源于低溫假單胞菌，并具有下列核苷酸序列之一a、具有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；b、可與SEQID NO. 1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；c、對上述a或b所示核苷酸序列進行ー個或多個堿基的取代、缺失、添加、修飾的核苷酸序列；d、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的DNA分子，其特征在于該DNA分子具有啟動子活性。
3.ー種含有權利要求1或2所述DNA分子的原核表達載體。
4.一種原核宿主細胞，所述宿主細胞含有權利要求1或2所述的DNA分子或權利要求 3所述的表達載體。
5.權利要求1或2所述DNA分子在原核異源表達系統中的應用。
6.根據權利5所述DNA分子在原核異源表達系統中的應用，其特征在于原核異源表達系統為常溫表達系統或低溫表達系統。
全文摘要
本發明公開了一種假單胞菌低溫啟動子及其應用，具體涉及一種分離自云南梅里雪山明永冰川的耐低溫假單胞菌Pseudomonassp.MY1402的低溫啟動子的序列及應用，本發明采用構建啟動子探針質粒和建基因組文庫的方法篩選，含有該啟動子片段的重組質粒可以在原核細胞中、在低溫下啟動目標基因的表達；該啟動子在不同原核生物中具有通用性，可用于構建在低溫下多個原核生物之間能夠通用的表達載體，以省卻在不同原核生物中表達外源基因需要更換載體的麻煩，提高分子生物學實驗效率；該啟動子還能夠用于在低溫下啟動低溫蛋白和低溫酶基因的表達，提高低溫蛋白和低溫酶的生產效率。
文檔編號C12N15/78GK102533769SQ20121004724
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者馮強, 季秀玲, 張琦, 楊光富, 林連兵, 魏云林 申請人:昆明理工大學