專利名稱：提取堆肥宏基因組dna的方法及其在鑒定反硝化細菌中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種提取堆肥宏基因組DNA的方法及其在鑒定反硝化細菌中的應用。
背景技術：
堆肥本身含有較多的抑制因子，且堆肥過程中產生大量腐植酸，這些物質會對總 DNA(宏基因組DNA)的提取產生強烈的影響，很難提取到可以作為PCR擴增模板的總DNA。反硝化細菌(denitrifying bacteria)，是硝化和反硝化研究中非常重要的一種細菌。傳統的反硝化細菌篩選方法是使用培養基進行培養接種，單培養周期就要14天，整個篩選過程一般需要兩周以上，耗時太長，且準確性很差。而且環境中的微生物99%是不可培養的，傳統的篩選方法大大限制了人們對土壤微生物資源及其基因資源的研究與利用。對反硝化細菌的研究可有助于堆肥過程中反硝化菌的衍替情況進行研究，進一步了解堆肥過程中硝化和反硝化的過程，有助于更深入地了解堆肥發生的機理，從而更好地實現對其技術的控制和優化。

發明內容
本發明的目的是提供一種提取堆肥宏基因組DNA的方法及其在鑒定反硝化細菌中的應用。本發明提供的提取堆肥宏基因組DNA的方法，包括如下步驟(1)將堆肥樣品和DNA提取液置于離心管中進行物理裂解；所述物理裂解包括2-4 次如下步驟液氮處理10-20min (如10_15min或15_20min)，然后63-67°C (如63_65°C或 65-67 0C )水浴融化；(2)在完成步驟(1)的離心管中加入溶菌酶，36-380C (如36-37°C或37-38°C )水浴 25-35min (如 25_30min 或 30_35min)；(3)在完成步驟(2)的離心管中加入蛋白酶K, 36-380C (如36_37°C或37-38°C ) 水浴 25-35min (如 25_30min 或 30_35min)；(4)在完成步驟(3)的離心管中加入18-22g/100ml (如18_20g/100ml或 20-22g/100ml)的 SDS 水溶液，63-67 "C (如 63-65 "C 或 65-67 "C )水浴 100_140min (如 100-120min 或 120_140min)；(5)將完成步驟(4)的離心管 18-22°C (如 18_20°C或20_22°C )、12000_14000g (如 12000-13000g 或 13000-14000g)離心 13_17min (如 13_15min 或 15_17min)，收集上清液；(6)在完成步驟(5)的離心管中加入DNA提取液和18_22g/100ml (如 18-20g/100ml 或 20_22g/100ml)的 SDS 水溶液，63-67 "C (如 63-65 "C 或 65-67 "C ) 水浴 8-12min(如 8-lOmin 或 10_12min)，然后 18-22 "C (如 18-20 "C 或 20-22 "C )、 12000-14000g(如 12000-13000g 或 13000_14000g)離心 13_17min(如 13_15min 或 15-17min)，收集上清液；
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(7)將步驟(5)的上清液和步驟(6)的上清液合并；(8)將步驟(7)的上清液和酚-氯仿-異戊醇混合液等體積混合，混勻后 18-220C (如 18-20°C或 20-22°C )、12000_14000g(如 12000_13000g 或 13000_14000g)離心8-iaiiin (如8-lOmin或10-iaiiin)，收集上清液；所述酚-氯仿-異戊醇混合液是將25 體積份苯酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇混合得到的；(9)將步驟(8)的上清液和異丙醇混勻，18-220C (如18_20°C或20_22°C )沉淀 50-70min(如50-60min或60-70min)，收集沉淀，即為堆肥宏基因組DNA ；步驟⑶的上清液和異丙醇的體積比為1 0.5-0.7(1 0.5-0. 6或1 0.6-0.7)。所述步驟(1)中，所述物理裂解可包括3次如下步驟液氮處理15min，然后65°C 水浴融化。所述步驟O)中，所述36-38°C水浴25-35min具體可為37°C水浴30min。所述步驟(3)中，所述36-38°C水浴25-35min具體可為37°C水浴30min。所述步驟中，所述SDS水溶液的濃度具體可為20g/100ml，所述63_67°C水浴 100-140min 具體可為 65°C水浴 120min。所述步驟(5)中，所述18-22 °C、12000-14000g 離心 13_17min 具體可為 20°C、 13000g 離心 15min。所述步驟(6)中，所述SDS水溶液的濃度具體可為20g/100ml，所述63_67°C水浴 8-12min 具體可為 65°C水浴 IOminJjfi^ 18-22°C、12000_14000g 離心 13_17min 具體可為 20°C、13000g 離心 15min。所述步驟(8)中，所述18-22 "C、12000-14000g 離心 8_12min 具體可為 20 °C、 13000g 離心 IOmin0所述步驟(9)中，所述18-22°C沉淀50-70min具體可為20°C沉淀60min，步驟(8) 的上清液和異丙醇的體積比具體可為1 0.6。所述步驟(1)中，所述堆肥樣品的質量具體可為4g，所述DNA提取液的體積為 10-15ml。所述步驟⑵中，所述溶菌酶的加入量為1. 6-2. 4mg (如1. 6_2mg或2-2. 4mg)。所述步驟(3)中，所述蛋白酶K的加入量為0. 8-1. 2mg(如0. 8_lmg或1-1. 2mg)。所述步驟中，所述SDS水溶液的加入量為2-3ml (如2-2. 5ml或2. 5-3ml)。所述步驟(6)中，所述DNA提取液的加入量為4_5ml (如4-4. 5ml或4. 5_5ml)，所述SDS水溶液的加入量為0. 3-0. 7ml (如0. 3-0. 5ml或0. 5-0. 7ml)。所述步驟(1)中，所述堆肥樣品的質量具體可為4g，所述DNA提取液的體積具體可為 13. 5ml ο所述步驟O)中，所述溶菌酶的加入量具體可為ang。所述步驟(3)中，所述蛋白酶K的加入量具體可為lmg。所述步驟中，所述SDS水溶液的加入量具體可為2. 5ml。所述步驟(6)中，所述DNA提取液的加入量具體可為4. 5ml，所述SDS水溶液的加入量具體可為0. 5ml。所述DNA提取液的具體配方如下含0. IM Tris-HCUO. IM EDTAU. 64g/100ml的 Na3PO4,8. 775g/100ml的NaCl和lg/100ml的CTAB,其余為水。所述DNA提取液的pH具體可為8. 0。本發明提供的方法可以高效提取堆肥樣本的宏基因組DNA，且用時較短G小時內)。采用本發明的方法從堆肥樣本中提取得到的宏基因組DNA可以作為PCR擴增的模板進行有效擴增。本發明還保護所述方法在鑒定堆肥樣本中的反硝化細菌中的應用。本發明同時保護一種鑒定堆肥樣本中的反硝化細菌的方法，包括如下步驟以堆肥樣本的宏基因組DNA為模板，用序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物并測序，根據測序結果鑒定堆肥樣本中的反硝化細菌；所述堆肥樣本的宏基因組DNA是采用上述任一方法提取得到的。每50 μ L 所述 PCR 擴增的反應體系中含有 IO-IOOpmol (10_50pmol 或 50-100pmol) 序列表的序列1所示的DNA片段、IO-IOOpmol (10-50pmol或50_100pmol)序列表的序列2 所示的DNA片段。每50 μ L所述PCR擴增的反應體系具體包括2 μ L所述模板、 IO-IOOpmol (10-50pmol或50_100pmol)序列表的序列1所示的DNA片段、 IO-IOOpmol (10-50pmol 或 50_100pmol)序列表的序列 2 所示的 DNA 片段、4 μ L dNTP、2. 5U Taq 酶、5 μ g BSA，其余為 IXPCR buffer 所述PCR擴增的程序具體可為94°C預變性^iin ；94°C變性30s、52°C退火30s、 72°C延伸90s, 30個循環；72°C延伸IOmin0以上任一所述堆肥可為畜禽糞便堆肥，具體可為雞糞、豬糞等畜禽糞便與鋸末混合發酵得到的堆肥。本發明對于研究不同發酵時間的堆肥樣本中的細菌種類(特別是反硝化細菌種類)具有很高的應用價值。本發明為堆肥的研究和應用，以及微生物分子生態學研究提供了有效的技術支撐。


圖1為雞糞堆肥提取的宏基因組DNA的電泳照片。圖2為雞糞堆肥提取的宏基因組DNA純化回收后的電泳照片。圖3為以雞糞堆肥提取的宏基因組DNA為模板的PCR擴增產物的電泳照片。圖4為豬糞堆肥提取的宏基因組DNA的電泳照片。圖5為豬糞堆肥提取的宏基因組DNA純化回收后的電泳照片。圖6為以豬糞堆肥提取的宏基因組DNA為模板的PCR擴增產物的電泳照片。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。蛋白酶K=Sigma公司，產品號為P6556。溶菌酶Sigma公司，產品號為L6875。DNA 提取液(100ml 體系)含 0. IM Tris-HCl (pH8. 0),0. IM EDTA(pH8.0)、1. 64g/100ml 的 Na3PO4,8. 775g/100ml 的 NaCl 和 lg/100ml 的 CTAB，其余為水。實施例1、堆肥宏基因組DNA的提取及其在鑒定反硝化細菌中的應用一、雞糞堆肥的制作將25kg雞糞、12. 3kg鋸末與13kg水混合，該混合物的C/N為25_30、水分含量為 55-60%，將該混合物室溫(23°C左右)發酵20天。雞糞取自中國農業大學雞場，鋸末取自北京市海淀區永豐木器廠，物料性質見表 1。表1堆肥原料的基本性質
權利要求
1.一種提取堆肥宏基因組DNA的方法，包括如下步驟(1)將堆肥樣品和DNA提取液置于離心管中進行物理裂解；所述物理裂解包括2-4次如下步驟液氮處理10-20min，然后63_67°C水浴融化；(2)在完成步驟(1)的離心管中加入溶菌酶，36-38°C水浴25-35min；(3)在完成步驟O)的離心管中加入蛋白酶K，36-38°C水浴25-35min;(4)在完成步驟(3)的離心管中加入18-22g/100ml的SDS水溶液，63-67V水浴 100-140min ；(5)將完成步驟(4)的離心管18-22°C、12000-14000g離心13-17min，收集上清液；(6)在完成步驟(5)的離心管中加入DNA提取液和18-22g/100ml的SDS水溶液， 63-67°C水浴 8-12min，然后 18_22°C、12000-14000g 離心 13_17min，收集上清液；(7)將步驟(5)的上清液和步驟(6)的上清液合并；(8)將步驟(7)的上清液和酚-氯仿-異戊醇混合液等體積混合，混勻后18-22°C、 12000-14000g離心8-12min，收集上清液；所述酚-氯仿-異戊醇混合液是將25體積份苯酚、M體積份氯仿和1體積份異戊醇混合得到的；(9)將步驟(8)的上清液和異丙醇混勻，18-22°C沉淀50-70min，收集沉淀，即為堆肥宏基因組DNA;步驟(8)的上清液和異丙醇的體積比為1 0.5-0.7。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述物理裂解包括3次如下步驟液氮處理15min，然后65°C水浴融化；所述步驟⑵中，所述36-38 °C水浴25-35min為37°C水浴30min ；所述步驟⑶中，所述36-38 °C水浴25-35min為37°C水浴30min ；所述步驟(4)中，所述SDS水溶液的濃度為20g/100ml，所述63_67°C水浴100-140min 為 65 °C 水浴 120min ；所述步驟(5)中，所述 18-22 °C、12000-14000g 離心 13_17min 為 20°C、13000g 離心 15min ；所述步驟(6)中，所述SDS水溶液的濃度為20g/100ml，所述63_67°C水浴8-12min為 65°C水浴 IOminJjfii 18_22°C、12000_14000g 離心 13_17min 為 20°C、13000g 離心 15min ；所述步驟(8)中，所述 18-22 "C、12000-14000g 離心 8_12min 為 20 °C、13000g 離心 IOmin ；所述步驟(9)中，所述18-22°C沉淀50-70min為20°C沉淀60min，步驟(8)的上清液和異丙醇的體積比為1 0.6。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述堆肥樣品的質量為4g，所述DNA提取液的體積為10-15ml ；所述步驟O)中，所述溶菌酶的加入量為1. 6-2. 4mg ；所述步驟(3)中，所述蛋白酶K的加入量為0.8-l.aiig;所述步驟(4)中，所述SDS水溶液的加入量為2-3ml ；所述步驟(6)中，所述DNA提取液的加入量為4-5ml，所述SDS水溶液的加入量為 0. 3-0. 7ml。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述堆肥樣品的質量為4g，所述DNA提取液的體積為13. 5ml ； 所述步驟O)中，所述溶菌酶的加入量為2mg ； 所述步驟(3)中，所述蛋白酶K的加入量為Img ； 所述步驟(4)中，所述SDS水溶液的加入量為2. 5ml ；所述步驟(6)中，所述DNA提取液的加入量為4. 5ml,所述SDS水溶液的加入量為 0. 5ml。
5.權利要求1至4中任一所述方法在鑒定堆肥樣本中的反硝化細菌中的應用。
6.一種鑒定堆肥樣本中的反硝化細菌的方法，包括如下步驟以權利要求1至4中任一所述方法提取得到的堆肥樣本的宏基因組DNA為模板，用序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物并測序，根據測序結果鑒定堆肥樣本中的反硝化細菌。
全文摘要
本發明公開了一種提取堆肥宏基因組DNA的方法及其在鑒定反硝化細菌中的應用。本發明的方法包括如下步驟(1)將堆肥樣品在DNA提取液中進行物理裂解；(2)加入溶菌酶；(3)加入蛋白酶K；(4)加入SDS水溶液；(5)離心收集上清液；(6)在步驟(5)的沉淀中加入DNA提取液和SDS水溶液，離心收集上清液；(7)將步驟(5)和步驟(6)的上清液合并；(8)酚-氯仿-異戊醇抽提；(9)將步驟(8)的上清液和異丙醇混勻，收集沉淀，即為堆肥宏基因組DNA。本發明對于研究不同發酵時間的堆肥樣本中的細菌種類(特別是反硝化細菌種類)具有很高的應用價值。本發明為堆肥的研究和應用，以及微生物分子生態學研究提供了有效的技術支撐。
文檔編號C12N15/10GK102533736SQ20121005202
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者李季, 陳雅娟, 霍培書 申請人:中國農業大學