專利名稱：轉基因大豆bps-cv127-9轉化事件外源插入載體旁側基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因及其應用。
背景技術：
隨著轉基因作物的大量種植及應用，轉基因產品開始大量進入我們的生活。轉基因產品潛在的食品安全、生態安全問題日益引起人們的關注，各國紛紛制定相應的法律法規對轉基因產品進行監管。許多國家以立法或者其他形式要求對轉基因產品進行標記。除美國、加拿大、阿根廷和中國香港特區實行自愿標識制度外，國際上的大多數國家如歐盟各國、日本、韓國等國均制定了一系列強制性的標識標準。我國分別于2001年、2002年頒布實施《農業轉基因生物安全管理條例》及《農業轉基因生物標識管理辦法》，并啟動了農業轉基因生物的監督監管機制，要求在食品中只要含有轉基因成分就必須進行標識。各國轉基因標識制度的相繼建立，對轉基因檢測技術的靈敏度和準確性提出了嚴格的要求，各種轉基因檢測技術也成為研究熱點。常用的轉基因檢測方法有外源蛋白檢測法、聚合酶鏈式反應(PCR)法、基因芯片檢測技術、分子雜交方法等。雖然國外對轉基因作物檢測方法研究已有十幾年，但由于轉基因作物的種類多、數量大，一些轉基因產品經過深加工、各種條件處理與保存后，轉基因成分部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要根據科學技術的發展不斷更新檢測方法。根據不同轉基因植物及其產品檢測目的的不同，鑒定轉基因植物主要包括檢測篩選基因、目的基因、不同基因間的交聯結構基因、和轉入基因與受體植物間的轉化體特異結構基因。簡介如下I、篩選型檢測方法篩選檢測通常是檢測轉基因植物中CaMV35S啟動子和NOS終止子，因為外源基因在轉入作物中為了加強其表達通常會攜帶35S啟動子和NOS終止子。但是35S啟動子存在天然的花椰菜花葉病毒，NOS終止子存在于植物病毒Ti質粒中，抗生素類報告基因自然界中也普遍存在，因而僅是檢測轉基因植物的篩選基因，極易出現假陽性的結果，同時也達不到鑒定轉基因植物的目的。2、基因特異性檢測方法基因特異性檢測就是檢測轉入轉基因植物中的外源目的基因。目前人們檢測的目的基因如CP4-EPSPS，BAR, CrylA(b)基因，但是由于一種作物中可能轉入了幾種目的基因或一種目的基因已轉入到幾種作物中，在檢測時很容易出現假陰性。3、構建特異性檢測方法構建特異性檢測是利用基因元件之間的邊界序列特征，能夠有效鑒定使用類似基因元件的不同構建體，而且存在序列信息容易獲得的特點，因此被很多研究者所使用。如 Btl76 的 CDPK-CryIA (b)，BtlI 的 IVS6_CryIA (b)，Roundup Ready 大豆的交聯結構 35S-CTP，CP4-CTP等結構基因。但是，由同一個構建體可能獲得不止一個不同特性的轉化株，甚至可能被轉化到不同的物種中，而這些轉化株未必全部經過了安全評估。因此構建特異性檢測芯片檢測方法不能識別不同的轉基因品系，檢測結果也很容易出現假陽性，也不能判斷該轉基因品系是否經過了安全評估。4、轉化體特異性檢測方法轉化體特異性檢測芯片的基礎是轉基因構建體在基因組DNA序列上的整合位點具有高度特異性，即使是相同的載體多次轉化，整合的位置和整合位點特征也是不可能重復的。因此根據不可重復的整合位點特征序列，開發出了轉化體特異性檢測芯片。與前三種方法相比，轉化體特異性檢測具有最高的特異性，最適合做轉基因產品的定性和定量檢測。 轉化事件特異性檢測是轉基因作物及其產品檢測的發展趨勢，必將在轉基因檢測中發揮重要的作用。經過對現有的專利檢索和其他文獻的檢索，尚未發現任何關于轉基因大豆 BPS-CV127-9外源插入旁側序列和利用此序列建立轉化體特異性定性、定量PCR檢測的報道。

發明內容
針對上述現有技術，本發明的目的在于克服現有技術在檢測轉基因大豆 BPS-CV127-9中存在的不足，提供一種轉基因大豆BPS-CV127-9外源插入載體旁側序列基因，及其應用。本發明是通過以下技術方案實現的轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因，其序列如序列表中I 所示，總長544bp (順序5’ 3，)，為aaagttgcatccaacattctctttaattcagtacaagagctccttcgccgtttagtgtat60
aggaaagcgcaaactgatgtttggaagcttgaaacggcaatCBaaatctttat120
attaaagctgaacaaaaggggccctccttatttatccccttagtttttattttcatttct180
ggggcaaactagtctcgtaatatattagaggttaattaaatttatattcc240
cccaattttcatccttaaacgaacctgctgBBBCCCtBBtttcgattacc300
aattccgatctaaaaagaagtcatggaagccattgattccgcaatcgatcctctcagaga360
tttcgctaagagcagtgttcgtctcgtccagcgctgtcacaaacccgatcgcaagggtaa420
cgccttttcttcatttccgatttttgatctgtagattagggttttctgaa480
attttgatat catttgtaattgaattggttatcagaattcacgaaagtagctgtgcgtac540 544 。
ggcg所述轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因的提取方法，步驟為(I)提取轉基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA:采用4種限制性內切酶Dral、 EcoRV、PvuII、StuI充分酶切，對酶切產物進行純化；(2)引物設計利用clontech GenomeWalker試劑盒提供的接頭引物APl和AP2, 其序列分別為APl :5’ -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ ；
AP2 :5’ -ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’ ；另外，參照BPS-CV127-9插入載體結構序列設計引物序列如下ATl :5’ -CCAACGATGATGTTGTTGATTGGGATG-3’ ；AT2 :5， -AACGAATCCCATCACCACAAATCCAAT-3，；(3)以轉基因大豆BPS-CV127-9基因組酶切產物為模板進行兩輪PCR擴增，引物對APl和ATl用于第一輪PCR反應，擴增體系20iiL，PCR程序為94°C 25s，72°C 3min，6個循環；94°C 25s，64°C 30s, 36個循環；64°C延伸7min，I個循環；引物對AP2和AT2用于第二輪PCR，在第二輪PCR中用I y L第一輪擴增產物的50倍稀釋液作為模板，PCR擴增體系和反應程序與第一輪PCR相同；第二輪PCR產物即為轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因，將擴增出的清晰條帶進行切割、純化，克隆到TA載體上測序，測序所得序列為轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因。所述的轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因可以用于特異性定性檢測大豆及相關產品是否含有BPS-CV127-9轉化事件，具體應用時，步驟如下(I)首先，根據轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因的序列設計引物，引物序列如下CV127-F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5，-AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3J ；(2)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用CV127-F/CV127-R引物組合進行PCR擴增；(3)上述PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物； 若存在擴增產物，則待檢測樣品含有BPS-CV127-9轉化事件；若不存在擴增產物，則待檢測樣品不含有BPS-CV127-9轉化事件。所述步驟(2)中的PCR 程序為95°C 5min 預變性；94°C 30s，56°C 30s, 72°C 30s， 35個循環；72°C延伸7min。所述的轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因可以用于定量檢測大豆及相關產品是否含有BPS-CV127-9轉化事件及其含量，具體應用時，步驟如下(I)建立BPS-CV127-9轉化體特異性引物的定量PCR標準曲線和lectin基因的定量PCR標準曲線①提取轉基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA，并用紫外分光光度計測定其OD值，計算出來濃度，計算出相應的拷貝數；②對基因組DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入BPS-CV127-9轉化事件的特異性引物和熒光標記探針，以及lectin基因的引物及探針，并進行擴增；③擴增后，測定各稀釋液的中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值遇拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制BPS-CV127-9轉化事件的定量PCR標準曲線和lectin基因的定量 PCR標準曲線；(2)提取純化待檢測樣品基因組DNA，然后向基因組DNA提取液中分別加入 BPS-CV127-9的特異性引物和熒光標記探針，以及lectin基因的引物和探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值，然后根據上述繪制的BPS-CV127-9 基因的定量PCR標準曲線和Iectin基因的定量PCR標準曲線，計算出相對應的拷貝數，則轉基因大豆BPS-CV127-9基因拷貝數與大豆內標準基因lectin基因的拷貝數之比，即為待檢測樣品中轉基因大豆BPS-CV127-9的百分含量。所述步驟(2)②中，BPS-CV127-9基因的特異性引物和熒光標記探針是根據轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因序列設計的；lectin基因的特異性引物和熒光標記探針是根據大豆內標準基因lectin基因序列設計的，具體如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5， -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3，；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；Lectin-IF :5’ -GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；Lectin-IR :5，-TCCACCCCCATCCACATTT-3，；Lectin-P : 5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。所述步驟⑵②中，擴增的參數如下擴增反應體積為20ii L，2XPremix Ex Taq 10 u L, forward primer(10 u moI L-l)Iu L, reverse primer(10 u mol L-l)Iu L, TaqMan-MGB Probe (10 U mo I L~l) 0. 5 U L, 50 X ROX Reference Dye 0. 4 U L, DNA 模板 I U L， ddH20 6. IuL ;擴增反應條件:95°C預變性30S ;95°C變性5S，60°C退火/延伸30S ;共計40 個循環。與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下I.本發明首次測序公布了轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體序旁側序列。2.利用本發明發現的序列特征，建立了轉基因大豆BPS-CV127-9轉化體特異性定性、定量PCR檢測方法，該方法靈敏，準確，簡單，可靠，具有廣闊的市場前景。


圖I為轉基因大豆BPS-CV127-9轉化體定性PCR擴增結果電泳示意圖其中M MarkDL2000 ；1 BPS-CV127-9 ；2 =Conquista ;3 :轉基因大豆 GTS40-3-2 ；4 Mon87701 ；5 A5547-127 ；6 A5547 ；7 :轉基因大豆305423 ；8 :轉基因玉米Mon810 ；9 :非轉基因玉米鄭單 958 ；10 :轉基因棉花M0N531 ；11 :非轉基因大豆1138-2 ；12 :空白對照。圖2為實施例2中內標準(lectin基因)定量PCR標準曲線。圖3為實施例3中轉基因大豆BPS-CV127-9轉化體定量PCR標準曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例I轉基因大豆BPS-CV127-9轉化體外源插入序列的PCR擴增提取轉基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA :采用4種限制性內切酶Dral、EcoRV、 PvuII、StuI充分酶切，對酶切產物進行純化。合成引物序列如下ATl :5’ -CCAACGATGATGTTGTTGATTGGGATG-3’ ；AT2 :5， -AACGAATCCCATCACCACAAATCCAAT-3，。根據clontech GenomeWalker試劑盒提供的方法，利用接頭引物APl和AP2,和BPS-CV127-9插入載體結構序列設計引物進行實驗。以轉基因大豆BPS-CV127-9基因組酶切產物為模板進行兩輪PCR擴增，引物對APl 和ATl用于第一輪PCR反應，擴增體系20 iiL。PCR程序為94°C 25s，72°C 3min，6個循環； 94°C 25s, 64°C 30s，36個循環；64°C延伸7min，I個循環。引物對AP2和AT2用于第二輪 PCR,在第二輪PCR中用I y L第一輪擴增產物的50倍稀釋液作為模板，PCR擴增體系和反應程序與第一輪PCR相同；用瓊脂糖凝膠電泳檢測第二輪PCR產物，將擴增出的清晰條帶進行切割、純化，克隆到TA載體上測序。利用NCBI提供的blast分析工具，分析序列，判斷基因組和載體結合位點。結果如下以引物對APl和ATl用于第一輪PCR反應，引物對AP2和AT2用于第二輪PCR后，成功擴增獲得544bp產物。對PCR產物測序，經過blast分析，Ibp到242bp為大豆基因組序列，243bp到544bp為擬南芥序列。由來源于大豆基因組的序列和來源于擬南芥的序列共同組成轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因，其序列如序列表中I所示。實施例2轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因的應用I)利用本發明中所提供序列設計轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件轉化體特異性定性PCR檢測方法引物由上海博尚生物公司合成，合成的引物序列如下CV127-F:5， -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3，；CV127-R:5，-AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3J ；分別取BPS-CV127-9、Conquista、轉基因大豆 GTS40-3-2、Mon87701、A5547-127、 A5547、轉基因大豆305423、轉基因玉米Mon810、非轉基因玉米鄭單958、轉基因棉花 M0N531、非轉基因大豆1138-2基因組為模板，分別利用CV127-F/CV127-R引物組進行PCR 擴增。PCR 程序為95°C 5min 預變性；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，35 個循環;72°C延伸 7min。上述PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物。結果利用所設計的引物以植物基因組為模板進行PCR擴增，結果如圖I所示，由圖I可見，只有BPS-CV127-9基因組成功的擴增出特異性的147bp產物，而其他轉基因和非轉基因樣品作為模板都沒有觀察到擴增產物。這表明，該引物有良好的特異性，適合用于轉化體特異性的檢測。2)利用本發明中所提供序列設計轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件轉化體特異性定量PCR檢測方法提取轉基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA，并用紫外分光光度計測定其OD值，計算出來濃度，計算出相應的拷貝數；對基因組DNA進行梯度稀釋，梯度稀釋得到I. OX 105、 I. OXlO4U. OXlO3U. OXlO2U. OXlO1 拷貝 u I71 做為實驗的標準品。通過Primer Express軟件設計適合BPS-CV127-9和lectin基因的定量PCR檢測用的特異性引物和TaqMan探針。BPS-CV127-9引物和探針序列如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5， -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3，；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；
8
lectin基因引物和探針序列如下Lectin-IF :5’ -GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3’ ；Lectin-IR :5，-TCCACCCCCATCCACATTT-3，；Lectin-P : 5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。反應體系(20U L) 2 X Premix Ex Taq IOuL, forward primer (10 U mo I L-l)Iu L, reverse primer(10 u moI L-l) Iu L, TaqMan-MGB Probe(10 u moI L-l)0. 5 u L, 50 X ROX Reference Dye 0. 4u L, DNA 模板 I y L, ddH20 6. I u L0 擴增反應條件95°C預變性30S ;95°C變性5S，60°C退火/延伸30S ;共計40個循環。每個樣品重復3次，同時設置空白和陰性對照。結果通過不同拷貝數的基因組DNA為標準品進行實時熒光定量PCR擴增，計算機自動生成標準曲線，縱坐標為Ct，橫坐標為起始拷貝數的自然對數。根據標準曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉基因含量的轉基因大豆BPS-CV127-9標準品(0.05%、0. 1%, 0.5%,1% )、陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值帶入公式，即可得到待測樣品中BPS-CV127-9的百分含量。對大豆內標準基因lectin和轉基因大豆BPS_CV127_9的轉化體特異性引物對同一組不同濃度的植物基因組DNA和不同百分含量的轉基因大豆DNA進行實時熒光定量PCR 擴增，分別得到PCR擴增曲線，并由系統自動生成標準曲線。大豆內標準基因lectin的標準曲線如圖2所示，該曲線斜率為-3. 269，相關系數R2 = 0. 999。基因大豆BPS-CV127-9的轉化體特異性引物的標準曲線如圖3所示，該曲線斜率為-39. 097，相關系數R2 = 0. 998。 因此，只要獲得未知樣品的Ct值，既可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。然后利用轉基因大豆的拷貝數與大豆內標準基因的拷貝數之比，就可以得到該樣品中轉基因大豆 BPS-CV127-9的百分含量。以上結果可以看出，本發明為轉基因大豆BPS-CV127-9的定向和定量PCR檢測提供了簡單、可靠的測定方法，可以用于轉基因大豆BPS-CV127-9的檢測。本發明為轉基因標識提供了一種有用的參考，為轉基因產品的控制提供了必要的手段。
權利要求
1.轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因，其特征在于其序列如序列表中I所示，為aaagttgcatccaacattctctttaattcagtacaagagctccttcgccgtttagtgtat60aggaaagcgcaaactgatgtttggaagcttgaaacggcaaCBaaatctttat120attaaagctgaacaaaaggggccctccttatttatccccttagtttttattttcatttct180ttct&&t&&&ggggcaaactagtctcgtaatatattagaggttaattaaatttatattcc240tCBBBtBBBBcccaattttcatccttaaacgaacctgctgBBBCCCttcgattacc300aattccgatctaaaaagaagtcatggaagccattgattccgcaatcgatcctctcagaga360tttcgctaagagcagtgttcgtctcgtccagcgctgtcacaaacccgatcgcaagggtaa420cgccttttcttcatttccgatttttgatctgtagattagggttttctgaa480attttgatatcatttgtaattgaattggttatcagaattcacgaaagtagctgtgcgtac540ggcg5440
2.權利要求I所述的轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因的提取方法，其特征在于步驟為(1)提取轉基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA:采用4種限制性內切酶DraI、EcoRV、 PvuII, StuI充分酶切，對酶切產物進行純化；(2)引物設計利用clontechGenomeWalker試劑盒提供的接頭引物APl和AP2,其序列分別為APl :5’ -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ ；AP2 :5’ -ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’ ；另外，參照BPS-CV127-9插入載體結構序列設計引物序列如下ATl :5’ -CCAACGATGATGTTGTTGATTGGGATG-3’ ；AT2 :5， -AACGAATCCCATCACCACAAATCCAAT-3，；(3)以轉基因大豆BPS-CV127-9基因組酶切產物為模板進行兩輪PCR擴增，引物對APl 和ATl用于第一輪PCR反應，擴增體系20iiL，PCR程序為94°C 25s，72°C 3min，6個循環； 94°C25s，64°C 30s，36個循環;64°C延伸7min，l個循環;引物對AP2和AT2用于第二輪PCR， 在第二輪PCR中用I ii L第一輪擴增產物的50倍稀釋液作為模板，PCR擴增體系和反應程序與第一輪PCR相同；第二輪PCR產物即為轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因。
3.權利要求I所述的轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因在特異性定性檢測大豆及相關產品是否含有BPS-CV127-9轉化事件中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于定性檢測時，方法如下(1)首先，根據轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因的序列設計引物，引物序列如下CV127-F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-R:5’ -AGGGTTTCAGCAGGTTCGTT-3’ ；(2)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用CV127-F/CV127-R引物組合進行PCR擴增；(3)上述PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物；若存在擴增產物，則待檢測樣品含有BPS-CV127-9轉化事件；若不存在擴增產物，則待檢測樣品不含有BPS-CV127-9轉化事件。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(2)中的PCR程序為95°C5min 預變性；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，35 個循環;72°C延伸 7min。
6.權利要求I所述的轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因在定量檢測大豆及相關產品是否含有BPS-CV127-9轉化事件中的應用。
7.根據權利6要求所述的應用，其特征在于定量檢測時，方法如下(1)建立BPS-CV127-9轉化體特異性引物的定量PCR標準曲線和lectin基因的定量 PCR標準曲線①提取轉基因大豆BPS-CV127-9基因組DNA，并用紫外分光光度計測定其OD值，計算出來濃度，計算出相應的拷貝數；②對基因組DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入BPS-CV127-9轉化事件的特異性引物和熒光標記探針，以及lectin基因的引物及探針，并進行擴增；③擴增后，測定各稀釋液的中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值遇拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制BPS-CV127-9轉化事件的定量PCR標準曲線和lectin基因的定量PCR 標準曲線；(2)提取純化待檢測樣品基因組DNA，然后向基因組DNA提取液中分別加入 BPS-CV127-9的特異性引物和熒光標記探針，以及lectin基因的引物和探針，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值，然后根據上述繪制的BPS-CV127-9 基因的定量PCR標準曲線和lectin基因的定量PCR標準曲線，計算出相對應的拷貝數，則轉基因大豆BPS-CV127-9基因拷貝數與大豆內標準基因lectin基因的拷貝數之比，即為待檢測樣品中轉基因大豆BPS-CV127-9的百分含量。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述步驟(2)②中，BPS-CV127-9基因的特異性引物和熒光標記探針是根據轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因序列設計的；lectin基因的特異性引物和熒光標記探針是根據大豆內標準基因 lectin基因序列設計的,具體如下CV127-1F:5’ -GCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGT-3’ ；CV127-1R:5’ -GCAGGTTCGTTTAAGGATGAAAA-3’ ；CV127-P :5’ -FAM-TATTCCTCAAATAAAACCC-MGB-3’ ；Lectin-IF :5，-GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3，；Lectin-IR :5’ -TCCACCCCCATCCACATTT-3’ ；Lectin-P :5，-FAM-ACAAAGAAACCGGTAGCG-MGB-3，。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述步驟(2)②中，擴增的參數如下 擴增反應體積為 20 u L, 2 XPremix Ex Taq 10 u L, forward primer (10 u mo I L-l) I u L, reverse primer(10 u moI L-l)Iu L, TaqMan-MGB Probe (10 u moI L-l)0.5 u L,50 X ROX Reference Dye 0. 4u L, DNA 模板 I y L, ddH20 6. I u L ;擴增反應條件95°C預變性 30S ； 95°C變性5S，60°C退火/延伸30S ;共計40個循環。
全文摘要
本發明公開了轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因，其序列如序列表中1所示。本發明的轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體旁側基因可以用于特異性定性檢測大豆及相關產品是否含有BPS-CV127-9轉化事件，以及定量檢測大豆及相關產品是否含有BPS-CV127-9轉化事件。本發明首次測序公布了轉基因大豆BPS-CV127-9轉化事件外源插入載體序旁側序列，建立了轉基因大豆BPS-CV127-9轉化體特異性定性、定量PCR檢測方法，該方法靈敏，準確，簡單，可靠，具有廣闊的市場前景。
文檔編號C12N15/11GK102586242SQ20121005353
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者孫紅煒, 李凡, 李寧, 楊淑珂, 路興波 申請人:山東省農業科學院植物保護研究所