專利名稱：脊索瘤細胞株及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及脊索瘤細胞株及其用途，屬于腫瘤生物學領域，更具體地，涉及ー種人腦脊索瘤細胞系(BHC2)的建立及其用途
背景技術：
脊索瘤來源于脊索胚胎殘余組織產生的原發性骨性腫瘤，是ー種少見的慢性進展的惡性腫瘤，占全部原發惡性腫瘤的3% 4%，居原發性惡性骨腫瘤第4位。有約1/3起源于顱底部，其余可起源于脊柱、骶尾部或中線以外的位置。該腫瘤發展緩慢且具有惡性腫瘤的生長方式，常生長于斜坡骨質，部位深在，且常呈廣泛性生長，部分還有分隔，并毗鄰重要的血管和神經，徹底切除非常困難，而且該腫瘤對放、化療不敏感，因此顱底脊索瘤治療極其困難，復發率高且預后相對較差，中位生存期約為6年，10年生存率僅為40%，大約50-70%的患者無治而終，對患者及其家庭乃至社會都造成一定程度的危害。因此，開發更為有效的腫瘤治療方案和治療藥物是非常重要的。脊索瘤從組織形態學將其分為普通型脊索瘤、軟骨樣脊索瘤和低分化型脊索瘤。光鏡下呈條索狀排列的空泡細胞。脊索瘤的確診依賴免疫組織化學染色。目前常用的標志蛋白有S-100、上皮細胞膜抗原(Epithelial Membrane Antigen, EMA)、細胞角蛋白(Cytokeratin, CK)以及vmientin蛋白。Vujovic等人對胚胎脊索組織、53例脊索瘤及其它323例腫瘤組織(包括163例軟骨腫瘤)進行了 Brachyury蛋白的免疫組化研究，發現胚胎脊索組織和所有脊索瘤細胞均Brachyury蛋白(+)，而所有其它腫瘤及正常組織均為(_)。這個研究表明脊索瘤組織中的軟骨樣細胞和脊索樣細胞都是來源于脊索細胞，所以Brachyury蛋白可作為鑒別脊索組織及脊索組織來源的腫瘤特異性標志物。Schwab等人比較了 6例經典脊索瘤和14例原發脊索肉瘤，發現Brachury和⑶24只在脊索瘤中表達。Brachury是新近發現的ー種脊索瘤相關分子標志物,其它的生物標志蛋白還有癌胚抗原(Carcino Embryonic Antigen,CEA)、半乳糖苷酶結合蛋白(Galenctin-3)、Fascin_l、生長因子類(Growth factors,GFs)、基質金屬蛋白酶類(Matrix Metalloproteinase,MMPs)等。脊索瘤細胞系是研究腫瘤生物學特性的重要工具，并且是研究抗腫瘤藥物的有用工具。將來的治療策略應該是靶向清除脊索瘤細胞，從而獲得對腫瘤的有效治療。開發靶向藥物首先需要一個性質穩定的脊索瘤細胞系，以此脊索瘤細胞系為基礎才可能研發出特異性靶向脊索瘤的藥物，但目前這種細胞系國內尚未見報道。

發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供一株能夠在體外長期傳代培養的、性質穩定的脊索瘤細胞系(BHC2)。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案人腦脊索瘤細胞系(BHC2)，其特征在于所述細胞系在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC NO :5321。
所述的人脊索瘤細胞系，生物學特性為細胞呈長梭型，貼壁生長，胞漿存在大量空泡。所述的人脊索瘤細胞系，有Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-I多種脊索來源細胞特異性標志蛋白的表達。所述細胞系的染色體為異倍體核型。所述的人脊索瘤細胞系，該細胞周期各時相的細胞百分率分別Gl期51. 3%、S期23. 6%、G2-M期25%、G2/G1 ^ 2，表現出腫瘤細胞增殖特性。本發明提供一種人脊索瘤細胞系，該人脊索瘤細胞系HBC2已于2011年9月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(其簡稱為CGMCC)，其保藏編號為 CGMCC No. 5321，建議的分類名為人脊索瘤細胞。保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。本發明所述的人腦脊索瘤細胞系HBC2是發明人從顱底腦脊索瘤患者的腫瘤組織中分離培養獲得，該細胞通過細胞因子依賴法和反復貼壁法篩選純化后獲得增殖能力很強的HBC2細胞，在體外經過超過14次的傳代培養，細胞仍保持脊索腫瘤特性。該細胞具有脊索細胞的超微結構，并表達多種脊索來源組織的標志蛋白，同時也具有腫瘤特性和成瘤能力。通過光學顯微鏡和電子顯微鏡方法證實，本發明所述的人脊索瘤細胞系在胞漿中存在特征性空泡結構。通過免疫組織化學方法證實，本發明所述的人脊索瘤細胞系表達多種脊索來源組織的標志蛋白 Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-1。通過流式細胞術方法證實，本發明所述的人脊索瘤細胞系細胞周期各時相的細胞百分率G1 期 51. 3%、S 期 23. 6%、G2-M 期 25%、G2/G1 ^ 2。本發明所述的人脊索瘤細胞系染色體呈多倍體核型，而且接種BALB/C免疫缺陷鼠后具有成瘤能力。本發明所要解決的另一個技術問題是提供人脊索瘤細胞系在制備或篩選靶向腫瘤細胞藥物中的應用。將本發明所述的人脊索瘤細胞系用于研發靶向脊索瘤的藥物，例如，制備并篩選出HBC2特異抗體，通過體外實驗挑選出具有抑制和殺傷HBC2細胞的抗體，可以將此抗體作為抗脊索瘤藥物的主要成份；或挑選出特異識別HBC2的抗體并作為靶向工具，制備抗脊索瘤的靶向藥物。人脊索瘤細胞系(BHC2)的用途，包括但不限于以下用途用于制備腫瘤診斷試劑。 用于篩選和/或制備抗腫瘤藥物。用于制備腫瘤動物模型。用于開發腫瘤藥物靶點。用于腫瘤的體外研究。本發明所述的人脊索瘤細胞系主要優勢在于I.本發明所述的人脊索瘤細胞系既具有胞漿空泡結構，表達多種脊索來源組織的標志蛋白；同時也具有染色體呈多倍體核型、細胞周期中S期細胞百分率大于14%和成瘤能力的腫瘤細胞特性。
2.本發明所述的人脊索瘤細胞系可以體外傳代培養14代而保持脊索瘤性質不變，適合作為研發脊索瘤相關藥物的細胞材料。以下通過附圖和具體實施例詳細說明本發明技術方案，并不以此限定本發明的實施范圍。


圖1為病人病理診斷細胞片狀樣排列，核圓形或橢圓形，胞質略透明，含大量皂泡樣結構0 ，X 200)圖2為培養第14代的HBC2.細胞呈多角形，有長短不等的突起；胞核圓形，位于中央，見明顯的核仁，偶見雙核；胞漿內見大量大小不等的空泡和黑色顆粒(相差顯微鏡，X 400)圖3為透射電鏡檢測HBC2超微結構.胞膜表面大量微絨毛，胞核形態不規則，核膜凹陷，核仁大、明顯，胞漿內大量低電子密度的粘液空泡(X 6000)圖4 為免疫組織化學染色檢測 HBC2S100、Galectin-3、Fascin-1> Brachyury標志蛋白的表達.陽性細胞為胞漿中充滿致密的棕褐色顆粒，SlOO蛋白表達呈強陽性，Galectin-3蛋白表達呈弱陽性，Fascin-I蛋白中等表達，Brachyury蛋白表達呈強陽性(DAB, X200)圖5為HBC2染色體核型分析 染色體為84條異倍染色體核型(油鏡，X 1000)圖6為流式細胞術分析HBC2細胞周期圖7為HBC2體內成瘤實驗.I. 8X IO7個細胞注射到裸鼠腋下皮下，第4周時見裸鼠腋下有2厘米大小的腫瘤
具體實施例方式實施例1 :人脊索瘤細胞系的建立HBC2原代培養本發明所述細胞系是從手術病人顱底腦脊索瘤組織分離培養獲得。腫瘤組織取自首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科中心的一位患者手術標本，病理診斷為腦脊索瘤，顯微鏡下細胞片狀樣排列，核圓形或橢圓形，胞質略透明，含大量皂泡樣結構(圖I)。具體方法如下無菌超凈臺內用含破紅液的Hank’ s(l I)將組織塊洗2次，去除血管和壞死組織，用組織剪將組織塊剪成約Imm3大小，加入3ml 0. 04%EDTA/0. 5%胰蛋白酶，37°C水浴消化10分鐘，顯微鏡下觀察，待消化成單細胞后，加入300ul胎牛血清終止消化。用200目的金屬篩網過濾，去除未消化的組織。過濾后的細胞懸液在無血清DMEM溶液中通過離心(800rpm/分，10分鐘)洗滌2次，收集離心管底部的沉淀細胞，將細胞懸浮于含有生長因子的培養液(培養液的配制90% Neurocult NS-ABasal Medium(Human), 10% Neurocult NS-A proliferation supplement (Human),終濃度為lOng/ml的喊性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF),終濃度為20ng/ml的表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)中，接種于T25培養瓶內，置于37°C、5% CO2培養箱中培養。細胞純化細胞培養24h后棄懸浮細胞，貼壁細胞換含20%胎牛血清的DMEM/F12繼續培養，待細胞生長接近90%匯合時，Hank’ s洗2次，加入0. 4ml 0. 04% EDTA/0. 5%胰蛋白酶消化3分鐘，加上述培養液吹打分瓶，37°C培養30分鐘，收集懸浮細胞，棄貼壁細胞，懸浮細胞37°C培養30分鐘，待細胞再次貼壁后，收集懸浮細胞，棄貼壁細胞，懸浮細胞再37°C培養30分鐘，通過反復貼壁法，最終去除成纖維細胞。傳代培養純化后的細胞生長達90%匯合時，加入0.4ml 0. 04% EDTA/0. 5%胰蛋 白酶消化2分鐘，加上述培養液吹打、分瓶，37°C、5% CO2培養箱中傳代培養。重復上述過程，直至傳14代，行以下各項檢測。相差顯微鏡下第14代HBC2細胞生長特性細胞呈多角形，有長短不等的突起；胞核圓形，位于中央，見明顯的核仁，偶見雙核；胞漿內見大量大小不等的空泡和黑色顆粒(圖 2)。實施例2 :透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結構HBC2細胞傳代培養14代時，待細胞生長達90%匯合時，棄培養液，加入3ml 0. IMPBS (PH7. 4)，用橡皮細胞刮刮取細胞，收集細胞，離心(800rpm/分，10分鐘)，棄上清，戊二醛/四氧化鋨前固定2小時，0. IM PBS (PH7. 4)洗3次，10分鐘/次。然后行標本的后固定、脫水、浸透、包埋、切超薄切片和重金屬染色(北京市神經外科研究所電鏡室完成)。透射電鏡觀察HBC2超微結構，可見胞膜表面大量微絨毛，胞核形態不規則，核膜凹陷，核仁大、明顯，胞漿內大量低電子密度的粘液空泡(圖3)。實施例3 :免疫組織化學染色檢測脊索組織來源的標志蛋白HBC2細胞傳代培養14代時，待細胞生長達90%匯合后，用Hank’ s洗2次。力口A 3ml 0. 04% EDTA/0. 5%胰蛋白酶消化約2分鐘，加2ml含血清培養基終止反應，離心(800rpm/分，10分鐘)洗滌I次，收集離心管底部的沉淀細胞。將細胞重懸于5ml含20%血清的DMEM/F12培養液中，接種于鋪有蓋玻片的培養皿中培養，待細胞生長90%匯合后棄培養液，0. IM PBS (PH7. 4)洗3次，加入冷丙酮4°C固定10分鐘，0. IM PBS (PH7. 4)洗3次，5分鐘/次，3 %過氧化氫室溫10分鐘(消除內源性過氧化物酶)。0. IMPBS (PH7. 4)洗3次，5分鐘/次，封閉液(1%羊血清，0. 5%血清白蛋白，0. 1% TritonX-100，0. 1MPBS)封閉30分鐘,37。。,棄封閉液，加Brachyury、S100、Galectin-3和Fascin-I單克隆抗體(I 100稀釋)，4°C過夜，對照培養皿加0. IM PBS (PH7. 4)。次日用含Tween-20的PBS洗3 次，分別加 I 滴鼠 Polymer Helper (即用型)(S100、Galectin-3、Fascin-1)和 I 滴兔Polymer Helper (即用型)(Brachyury) 37°C孵育 30 分鐘，用含 Tween-20 的 PBS 洗 3 次，分別加 Poly-HRP anti-mouse IgG(S100、Galectin-3、Fascin-1)和 Poly-HRP anti-rabbitIgG (Brachyury) 37°C孵育30分鐘，用含Tween-20的PBS洗3次，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察，陽性細胞的特點為胞漿中充滿致密的棕褐色顆粒，SlOO蛋白表達呈強陽性，Galectin-3蛋白表達呈弱陽性,Fascin-I蛋白中等表達,Brachyury蛋白表達呈強陽性(圖4)。實施例4 HBC2細胞的腫瘤特性分析(I)染色體核型分析HBC2細胞傳代培養14代時，待細胞生長達90%匯合后，換液并加入終濃度為0. 5ug/ml的秋水仙素工作液使細胞停止在分裂中期，4h后收獲細胞，KCl (0. 075M)低滲處理30分鐘，37°C，新鮮配置的甲醇冰醋酸(3 I)預固定細胞30分鐘，離心(SOOrpm/分，10分鐘)棄上清，再加新鮮配置的甲醇冰醋酸(3 I)固定細胞30分鐘，離心(800rpm/分，10分鐘)棄上清，留300ul固定液吹打、滴片，80°C烤片2小時，吉姆薩染色。顯微鏡(Nikon 80i型，日本)和PCI圖像采集系統采集圖像，行染色體核型分析。油鏡下觀察并染色體計數，見染色體為異倍體核型,84條染色體(圖5)。(2)流式細胞術檢測細胞周期HBC2細胞傳代培養14代時，取對數生長期細胞，棄培養液，胰酶消化細胞，加培養液，離心(800rpm/分，14分鐘)，去上清。PBS洗2次，0. 5mlPBS吹打，用5ml注射器吸 取細胞，然后用力打入5ml 70% (預冷)乙醇中，封口膜封口，4°C固定過夜。離心(800rpm/分，14分鐘)，收集固定細胞，PBS洗2次，0. 4ml PBS重懸細胞并輕輕吹打(防止細胞破碎)。加RNase-A約3 yl (終濃度為50 u g/ml)，37°C水浴消化30分鐘，加50 ill PI(終濃度為65 u g/ml)，冰浴中避光染色30分鐘，300目(孔徑40 50微米)尼龍網過濾，上機檢測(圖6)。HBC2細胞周期各時相的細胞百分率為G1期51. 3%、S期23. 6%、G2-M期25%、G2/G1 ^ 2。(3)成瘤能力檢測為了檢測細胞的成瘤能力，將1.8X107個HBC2細胞接種于N0D/SCID裸鼠腋下皮下，接種后每天觀察腫瘤的生長情況，記錄成瘤潛伏期和腫瘤大小。結果發現在第10天時裸鼠腋下有腫瘤出現，第4周時腫瘤大小達2厘米(圖7)。
權利要求
1.人脊索瘤細胞系(BHC2)，其特征在于所述細胞系在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC NO 53210
2.根據權利要求I所述的人脊索瘤細胞系，其特征在于所述細胞系的生物學特性為細胞呈長梭型，貼壁生長，胞漿存在大量空泡。
3.根據權利要求I所述的人脊索瘤細胞系，其特征在于所述細胞系有Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-I多種脊索來源細胞特異性標志蛋白的表達。
4.根據權利要求I所述的人脊索瘤細胞系，其特征在于所述細胞系的染色體為異倍體核型。
5.根據權利要求I所述的人脊索瘤細胞系，其特征在于，該細胞周期各時相的細胞百分率分別Gl期51. 3%、S期23.6%, G2-M期25%、G2/G1 ^ 2，表現出腫瘤細胞增殖特性。
6.權利要求I所述的人脊索瘤細胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于制備腫瘤診斷試劑。
7.權利要求I所述的人脊索瘤細胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于篩選和/或制備抗腫瘤藥物。
8.權利要求I所述的人脊索瘤細胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于制備腫瘤動物模型。
9.權利要求I所述的人脊索瘤細胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于開發腫瘤藥物革巴點。
10.權利要求I所述的人脊索瘤細胞系(BHC2)的用途，其特征在于用于腫瘤的體外研究。
全文摘要
本發明公開了一株脊索瘤細胞株及其用途，屬于腫瘤生物學領域。人脊索瘤細胞系(BHC2)，保藏號為CGMCC NO5321。該細胞系從顱底腦脊索瘤患者手術切除的脊索瘤組織中分離培養獲得，在體外傳代培養超過14代。該細胞具有脊索來源細胞的生物學特性光學顯微鏡下呈條索狀排列的空泡細胞，透射電子顯微鏡下胞漿中存在大量的空泡結構，表達多種脊索來源細胞的標志蛋白Brachyury、S100、Galectin-3、Fascin-1。該細胞具有染色體為異倍體核型的腫瘤特性；細胞周期各時相的百分率分別為G1期51.3％、S期23.6％、G2-M期25％、G2/G1≈2，表現出腫瘤細胞增殖特征；細胞注入裸鼠體內后有成瘤能力。由于其在體外可長期培養并保持細胞特性不變，是研制靶向脊索瘤腫瘤藥物的有力工具。
文檔編號C12Q1/02GK102618499SQ20121005296
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者萬虹, 馮潔, 歷俊華, 吳震, 孫異臨, 張俊廷, 李德志, 王亮, 郝淑煜 申請人:北京市神經外科研究所