專利名稱：一種新型抗病毒分子drp的抗病毒作用、實施方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及死亡抵抗蛋白(Death Resistant Protein, DRP)在病毒感染性疾病中的效應、作用機制、實施方法和用途。
背景技術：
病毒是由一種以核酸(核糖核酸RNA或脫氧核糖核酸DNA)為核心，以蛋白質 為外殼(衣殼capsid)而組成的微小顆粒，其核酸可分為單股或雙股，線形或球形。病 毒是最小的生物病原體，從20nm到300nm不等其中最大的是痘類病毒，例如痘苗病毒 為300nmX200nm，在普通光學顯微鏡下勉強可見；中等大小的如流行性感冒病毒，直徑為 80 IOOnm ；小型病毒如流行性乙型腦炎病毒，直徑為20nm，必須在電子顯微鏡下才能見到基礎病毒學，莽克強等著，化學工業出版社，2005年第一版；分子病毒學，黃文林等著，人民 衛生出版社，2001年第一版。隨著病毒學和免疫學研究的進展，人們對病毒性疾病(Viral diseases)的認識也 逐漸發展。最常用的病毒分類方式是根據核酸的性質(RNA或DNA)來對病毒進行分類，一 般將病毒分為DNA病毒和RNA病毒。常見的致病性DNA病毒主要有人乳頭狀瘤病毒(HPV)、 乙肝病毒(HBV)、EB病毒等，常見的致病性RNA病毒包括流行性出血熱病毒、人獲得性免疫 缺陷病毒(HIV)、嚴重急性呼吸綜合征(SARS)病毒以及流感病毒等基礎病毒學，莽克強等 著，化學工業出版社，2005年第一版；分子病毒學，黃文林等著，人民衛生出版社，2001年第 一版。病毒性疾病根據臨床表現及傳染方式，可以分為呼吸道病毒、蟲媒病毒、出疹性病 毒、腸道病毒所致感染等。病毒性疾病往往引起比較嚴重的臨床表現，每每引起暴發流行。病毒感染后除了 短期內引起感染所引起的局部炎癥外，長期的病毒感染可以導致腫瘤以及器官功能衰竭等 嚴重的疾病，如HPV感染引起的宮頸癌、HBV感染引起的肝癌、肝硬化和肝功能衰竭、EB病毒 引起的鼻咽癌、HIV引起的免疫功能缺陷和卡波濟氏肉瘤、SARS引起的呼吸功能衰竭以及 流感病毒引起的呼吸功能障礙等基礎病毒學，莽克強等著，化學工業出版社，2005年第一 版；分子病毒學，黃文林等著，人民衛生出版社，2001年第一版。我國是一個病毒性疾病高發的大國，如我國HBV感染患者估計有感染者1. 2億，是 世界上最多的HBV大國；不能忘記的是2002年SARS在我國的大流行；另外，HIV以及可能 的流感病毒爆發也時刻威脅著國民的身體健康。每一種流行性病毒感染都可以造成極大的人體健康和國民經濟的損失，然而至今 對抗病毒尚無特效藥，臨床治療重點就在對癥和保守治療，因此病毒性疾病的發病的分子 和免疫學機理的研究和治療策略的研究具有重大的科學意義和顯示意義。干擾素(interferon，IFN)是一組體內存在的、有廣泛生物活性的微量調節蛋白， 具有廣譜抗病毒、抗細胞增殖和免疫調節活性，已被廣泛用于臨床。干擾素是病毒感染后宿 主細胞釋放的具有抗病毒特性的糖蛋白。根據其生物學、生物化學、基因特征及細胞來源， 可分為四種類型，S卩α、β、Y、ω型干擾素，分別來源于白細胞(單核/巨噬細胞)、成纖維細胞、淋巴細胞(T-cell和滋養層細胞)。干擾素具有抗病毒、抗增殖和免疫調節3種功 能。其中α、β型IFN又稱為I型干擾素，在病毒性疾病的治療中具有重要地位。干擾素已經廣泛應用于病毒性疾病的治療，如帶狀皰疹、皰疹性口咽、小兒病毒性 肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS等，可以抑制病毒的復制并調 節病毒特異性免疫反應的產生，是目前已經得以證明并商業化應用于臨床病毒性治療的有 效生物制劑。人們對于機體識別外來病毒的分子機制并不完全了解，但是隨著Toll樣分子 的發現，機體針對病毒所產生的IFN的產生機制和作用機制逐步得到了認識。研究發現 TLR3 主要識別病毒分子中雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)Takeuchi，0.等， Immunity. 1999 ；11 443-451 ；Ozinsky, A.等,Proc Natl Acad Sci USA. 2000 ；97 13766-13771 ；Alexopoulou, L.等，Nature. 2001 ；413 :732_738；人類 TLR7 和 TLR8 基因 定位于染色體Xp22，識別病毒分子中的單鏈RNA(single-stranded RNA, ssRNAs)Heil， F.等，Science. 2004 ；303 1526-1529；人類TLR9定位于染色體3ρ21· 3，識別細菌和病毒 DNA中的CpG基序或人工合成的CpG寡核昔酸(CpG oligodeoxynucleotides, CpG 0DN) [Hemmi,H.等，Nature. 2000 ;408 :740_745。另外，病毒還可以通過TLR非依賴方式產生I 型干擾素Baccala，R.等，Nat. Med. 13，543-551 (2007)。其中，TLR3 可以通過 TRIF-TBK1/ IKK ε -IRF3信號傳導通路誘導I型干擾素的產生；TLR7/8/9可以通過MyD88_IRF7信號通 路活化誘導I型干擾素的產生；另外，一些進入細胞內的病毒可以通過RIG-I/MDA-5介導 的TBK1/IKK ε -IRF3信號通路活化通過TLR非依賴方式誘導I型干擾素的產生Baccala， R.等，Nat. Med. 13，543-551 (2007)。能否誘導I型干擾素的產生以及能否抑制病毒的復 制和擴增是檢驗藥物治療病毒性疾病的非常有效的標準。死亡抵抗蛋白(DRP)是第二軍醫大學免疫學研究所于1998年利用大規模測序的 方法，從健康成年人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞的cDNA文庫進行基因表達分析后 于1998年發現的，并已經在基因數據庫GenBank中登錄(GenBank No. AF077599)。DRP,又稱Nrdpl、FLRF或者RBCC，已有研究表明DRP是E3泛素連接酶的一種， 可以泛素化并降解表皮生長因子家族成員ErbB3和BRUCEAbdullah，J. Μ.等Blood Cells Mol. Dis. 27，320-333 (2001) ；Diamonti, Α. J.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 2866-2871(2002) ；Qiu, X. B.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99，14843-14848(2002) ；Qiu, X. B.等 EMBO J. 23，800-810(2004) ；Cao，Z.等 Mol. Cell Biol.27，2180-2188(2007) ；Yen, L.等Cancer Res. 66，11279-11286 (2006)。DRP是一個317個氨基酸組成的蛋白，包括4個 功能域RING finger功能域(l_57aa)，B_box功能域(2個TRAF樣鋅指功能域，58_134aa)， 卷曲螺旋(coiled-coil)功能域(CC，135_178aa)和 C 端的 ErbB3 結合區域(179_317aa)。雖然已有的研究揭示了 DRP/Nrdpl在調節細胞生長、凋亡等方面的作用，但是對 于其免疫功能的研究還沒有。綜上所述，本領域迫切需要開發出一種可有效抵抗病毒感染、抑制炎性因子產生 的免疫學活性物質。

發明內容
本發明正是提供了 DRP蛋白或其編碼序列在有效抵抗病毒感染、抑制病毒復制、促進I型干擾素產生中的新用途。在本發明的第一方面中，提供了死亡抵抗蛋白及其編碼序列在制備用于預防或治 療病毒感染相關疾病和/或征狀的藥物中的用途。在本發明的一個實施方式中，所述病毒感染相關疾病和/或征狀為選自下組的一 種或多種因病毒感染引起的疾病和/或征狀病毒感染后的復制；病毒感染局部的細胞和 組織損傷；或病毒感染造成的器官功能損傷。在一個優選例中，所述病毒感染局部的細胞選自皮膚的上皮細胞、外周血的免疫 細胞、免疫器官中的免疫細胞以及實體器官的組成細胞。在另一優選例中，所述病毒感染的組織選自皮膚、肝臟、腎臟、腦或肺臟。在另一優選例中，所述病毒感染造成的器官功能損傷選自皮膚、肝臟、腎臟、腦或 肺臟的功能損傷。在另一個優選例中，所述病毒感染相關疾病和/或征狀選自帶狀皰疹、皰疹性口 咽、小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS。在本發明的另一個實施方式中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引 起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴 重急性呼吸綜合征病毒或流感病毒。在另一優選例中，所述死亡抵抗蛋白及其編碼序列誘導I型干擾素的產生，從而 預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀。在另一個優選例中，所述I型干擾素選自IFN- α和IFN- β，優選為IFN- β。在另一優選例中，所述器官選自肝臟、脾臟、腦、腎臟或皮膚。在本發明的另一個實施方式中，所述死亡抵抗蛋白選自(a) SEQ ID NO 2 的氨基酸序列；(b)與SEQ ID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制病毒感染相關疾病和/或征狀 活性的蛋白；(c) (a)或(b)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸、且具有 預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質或多肽。在一個優選例中，死亡抵抗蛋白是天然純化的蛋白、化學合成的產物、或使用重 組技術從原核或真核宿主中產生，優選為人死亡抵抗蛋白。在一個優選例中，所述宿主選自細菌、酵母、高等動物、昆蟲和哺乳動物細胞。在本發明的另一個實施方式中，所述死亡抵抗蛋白的編碼基因選自(i)SEQ ID NO 1 的序列；或(ii)在嚴格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預防或治療病毒感染相關疾病 和/或征狀的分子。在本發明的另一個實施方式中，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射法、脂 質體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法、復制 缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質。在本發明的第二方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。
在一個優選例中，在給予本發明的藥物組合物之前、同時或之后，給予具有預防或 治療病毒感染相關疾病和/或征狀活性的其它活性物質。所述具有預防或治療病毒感染相 關疾病和/或征狀活性的其它活性物質選自臨床常用抗病毒藥物，優選為選自下組的一 種或多種抗甲型流感病毒表面M2受體、抗神經氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫 酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發明的一個實施方式中，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及其編碼序列占藥 物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%o在一個優選例中，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及其編碼序列占藥物組合物總 重量的1 95wt%，優選為5 90wt%，更優選10 80wt%。在本發明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；(B)預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀活性的其它活性物質；以及(C)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。在一個優選例中，所述具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀活性的其它 活性物質選自臨床常用抗病毒藥物，優選為選自下組的一種或多種包括抗甲型流感病 毒表面M2受體、抗神經氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗 HIV逆轉錄酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶或抗解旋酶。在本發明的第四方面中，提供了一種預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀的 方法，所述方法包括給予需要預防或治療的對象有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列。在一個優選例中，所述病毒感染相關疾病和/或征狀選自病毒感染后的復制；病 毒感染后的復制；病毒感染局部的細胞(皮膚的上皮細胞、外周血的免疫細胞、免疫器官中 的免疫細胞以及實體器官的組成細胞)和組織(包括皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺臟)損傷；病 毒感染造成的器官(包括皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺、脾臟)功能損傷。在另一個優選例中，所述病毒感染相關疾病和/或征狀選自帶狀皰疹、皰疹性口 咽、小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS。在另一個優選例中，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳 頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴重急性呼吸 綜合征病毒或流感病毒。在另一優選例中，所述死亡抵抗蛋白及其編碼序列誘導I型干擾素的產生，從而 預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀。在另一個優選例中，所述I型干擾素選自IFN-α和IFN-β，優選為IFN-β。在另一優選例中，所述器官選自皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺或脾臟。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖1 :DRP真核表達載體穩定轉染RAW264. 7細胞對LPS誘導的IFN-β產生的促 進效果。其中，圖IA為定量RT-PCR分析結果；圖IB為ELISA分析結果(“**”，Ρ < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。
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圖2 穩定干擾DRP在RAW264. 7細胞的表達對LPS、CpG、Poly(I:C)誘導的IFN-β、 CXCLlO和CCL5產生的抑制效果。其中，圖2a為DRP干擾細胞系的鑒定；圖2b為定量RT-PCR 分析；圖2c為ELISA分析。“M”代表分子量標記；“Ctrl RNAi"代表表達亂序對照干擾 RNA (scrambled control RNA interference)的干擾載體；"DRP RNAi，，代表表達 DRP 特異 性的干擾RNA的干擾載體。圖3 過表達DRP對VSV病毒在RAW264. 7細胞內復制與擴增的抑制效果。其中， 圖3a為培養上清的PFU分析；圖3b為RAW264. 7細胞的VSV L基因的定量RT-PCR分析 (“**”，P < 0. 01)。圖4 :DRP腺病毒靜脈注射對VSV病毒在肝臟的擴增的抑制效果(“#”，P < 0. 01)。圖5 :DRP轉基因對小鼠來源的腹腔巨噬細胞IFN-β的產生的促進效果。其中，圖 5a為DRP轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞DRP的表達鑒定；圖5b為DRP轉基因小鼠的腹腔巨 噬細胞IFN- β定量RT-PCR分析；圖5c為DRP轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞IFN- β ELISA分 析("Dn-DRP"為功能缺陷型 DRP，‘‘*，，，P < 0. 05 ；“**，，，P < 0. 01)。圖6 :DRP轉基因對小鼠來源腹腔巨噬細胞IFN-β和IRF3報告基因的活化的促進 效果(“▲”，P > 0. 05 ；“*”，P < 0. 05 ;“**”，P < 0. 01 ；“***”，P < 0. 001)。圖7 :DRP轉基因對VSV病毒在腹腔巨噬細胞內的復制和擴增的抑制效果。其中， 圖7a為培養上清的PFU分析；圖7b為VSV L基因的定量RT-PCR分析(“#”，P < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。圖8 :DRP轉基因對VSV感染后血清中IFN-β的產生的促進效果(“#”，Ρ < 0. 01 ； “***”，P < 0. 001)。圖9 =DRP轉基因對VSV感染后所導致的肝臟損傷的抑制效果(“**”，Ρ < 0. 01)。圖10 :DRP轉基因對VSV感染后在肝臟的復制和擴增的抑制效果(“**”，P < 0. 01)。實施方式本發明人通過大量的研究和動物模型試驗，發現DRP在病毒感染性疾病中，具有 促進I型干擾素的產生、抑制病毒的復制以及病毒在體內復制導致的器官功能損傷的功 能。在此，基礎上本發明人完成了本發明。具體而言，針對IFN調節相關基因進行應用研究是病毒分子生物學和細胞生物學 研究的熱點，將IFN促進基因的核苷酸和蛋白質應用于病毒性疾病的預防和治療是人工干 預病毒性感染的有效技術，因此無論是在功能基因組研究，還是病毒相關地基因治療方面 均具有廣闊地應用前景。發明人通過研究發現過表達DRP能夠促進I型干擾素的產生并抑制水皰性口炎病 毒(vesicular stomatitis virus, VSV)病毒在小鼠巨噬細胞內的復制和擴增。在水泡口 炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)的感染模型中，觀察到DRP能夠顯著增高血清 中IFN-β的水平，抑制VSV在小鼠肝臟的復制，減輕VSV誘導的小鼠肝臟損傷，提示DRP可 能具備病毒性疾病的應用前景。因此本發明還公開了應用該抗病毒分子于病毒感染性疾病 的預防和治療的方法和策略，特別是可用于病毒感染所導致的肝臟損傷。換言之，本發明針對具有抗病毒作用的新型抗病毒分子DRP，對免疫細胞中巨噬細 胞在微生物成分作用下的干擾素的產生進行了研究，并且驗證了應用該分子的序列對病毒性疾病動物模型的治療和保護作用。實驗證明1)過表達DRP可以促進巨噬細胞系IFN-β 的產生；2)過表達DRP可以抑制巨噬細胞系中VSV病毒的復制和擴增；3)DRP腺病毒靜脈 注射可以抑制VSV病毒在肝臟的擴增；4)DRP轉基因可以促進小鼠來源的腹腔巨噬細胞 IFN-β的產生；5)DRP轉基因可以促進小鼠來源的腹腔巨噬細胞IFN-β和IRF3報告基因 的活化；6)DRP轉基因抑制VSV病毒在腹腔巨噬細胞內的復制和擴增；7)DRP轉基因可以促 進VSV感染后血清中IFN-β的產生；8)DRP轉基因可以抑制VSV感染后所導致的肝臟損傷； 9)DRP轉基因可以抑制VSV感染后在肝臟的復制和擴增。本發明針對DRP基因的不同的核苷酸和蛋白質產物，用以促進I型IFN的表達，抑 制病毒體內外的復制和擴增，降低病毒感染所造成的肝臟損傷。這些發明證實DRP的相關 產物可望成為治療和預防病毒性疾病的有效手段。DRP蛋白(多肽)如本文所用，術語“死亡抵抗蛋白(多肽)”、“DRP蛋白(多肽)”、“DRP”、“Nrdpl”、 “FLRF”或者“RBCC”可互換使用，是指SEQ ID NO 1的序列(即GenBank No. AF077599)所 編碼的蛋白質或這些蛋白質具有抗炎作用的變異或修飾形式。例如，所述DRP蛋白可選自 (a) SEQ ID NO 2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加 一個或幾個氨基酸且具有抑制炎性因子的活性的由(a)衍生的蛋白質或多肽。本發明的蛋白質或多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重 組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等動物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。本 發明中DRP蛋白或多肽優選由人DRP基因或其同源基因或家族基因編碼。本發明蛋白質或多肽的變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50 個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個 以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或 相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質或多肽的功能，例如本發明的DRP蛋白 質或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有抑制炎性因子的活性。可采用輻射或暴露于誘變劑下來產生隨機誘變，也可通過定點誘變法或其它已知 的分子生物學技術來獲得上述(b)中的蛋白質或多肽。可利用編碼所述蛋白質或多肽的編 碼序列來構建轉基因動物，并觀察該轉基因動物對炎癥的抗性是否有所改良來篩選和鑒別 所得蛋白質或多肽。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的蛋白質或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。該術語還包括DRP蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導 突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與DRP蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以及 利用抗DRP蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還可使用其它多肽，如包含DRP蛋白或 其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 DRP蛋白的可溶性片段。通 常，該片段具有DRP蛋白序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較 佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨 基酸。
DRP蛋白編碼基因如本文所用，術語“DRP基因”或“DRP蛋白編碼序列”可互換使用，均是指一種編 碼本發明所述的DRP蛋白或多肽的序列，其可為SEQ ID NO :1的序列、在嚴格條件下與SEQ ID NO :1序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表達對炎性 因子的產生和影響具有一定的抑制作用。本發明的DRP基因可選自(i)SEQ ID N0:1的序 列；或(ii)在嚴格條件下與(i)限定的序列雜交且具有抑制炎性因子活性的分子。如本文所用，術語“嚴格條件”是指⑴在較低離子強度和較高溫度下的雜交和 洗脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優 選是95%以上時才發生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補序列。本發明的DRP基因核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人 工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放 閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備 的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴 增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。應理解，本發明的DRP基因優選獲自人，獲自其它動物的與人DRP基因高度同源 (如具有50%以上，優選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更 優選85 %以上如85 %、90 %、95 %、甚至98 %序列相同性)的其它基因也在本發明優選考慮 的等同范圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，如BLAST。載體、宿主及轉基因動物本發明還涉及包含DRP基因的載體，以及用該載體經基因工程產生的宿主細胞， 以及通過轉基因獲得高表達DRP的轉基因動物。通過常規的重組DNA技術(Science，1984 ；224 1431)，可利用本發明的編碼序列 可用來表達或生產重組的DRP蛋白。一般來說有以下步驟(1)用本發明的編碼DRP蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重 組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養的宿主細胞；和(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質或多肽。本發明中，術語“載體”與“重組表達載體”可互換使用，指本領域熟知的細菌質粒、 噬菌體、酵母質粒、動物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其它載體。總之，只要能在宿主體內 復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟 動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含DRP編碼序列和合適的轉錄/翻譯 控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。 所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體 還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。本發明中優選使用PCDNA3. 1載體、 PIRES2-EGFP 載體、Adeno-X 表達系統和 pSilencer 2. l-U6_neo 干擾載體。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適 當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質或多肽。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或 是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如動物細胞。代表性例子有大腸桿菌， 鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；動物細胞等。在本發明中，優選采用大腸桿菌細菌細 胞或小鼠巨噬細胞作為宿主細胞。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將 會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用 于啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增 強子和宿主細胞。本發明中術語“轉基因動物”、或“轉化動物”可互換使用，均指通過常規轉基因的 方法獲得的轉入本發明DRP基因并穩定高表達DRP蛋白或多肽的細胞、器官、組織或個體。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些 方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
I=I O藥物組合物本發明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有有效量的本發明的DRP蛋白 或其編碼序列，以及藥學上可接受的載體。在較佳的實施方案中，所述藥物組合物可用于治療與現有技術中已知可治療或預 防病毒感染相關疾病和/或征狀，例如病毒感染后的復制；病毒感染后的復制；病毒感染 局部的細胞(皮膚的上皮細胞、外周血的免疫細胞、免疫器官中的免疫細胞以及實體器官 的組成細胞)和組織(包括皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺臟)損傷；病毒感染造成的器官(包括 皮膚、肝臟、腎臟、腦、肺、脾臟)功能損傷。在本發明中，所述病毒感染相關疾病和/或征狀可選自帶狀皰疹、皰疹性口咽、 小兒病毒性肺炎、流行性乙型腦炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖銳濕疣、SARS。病毒感染可由選自下組的一種或多種病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB 病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷病毒、嚴重急性呼吸綜合征病毒、流感病毒。如本文所用，術語“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構成”、和 “由……構成”。如本文所用，術語“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副 反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。如本文所用，術語“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和 /或動物所接受的量。如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》 (Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關于藥學上 可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些 載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳 化劑、矯味劑、PH緩沖物質等。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受 的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發明的組合物中DRP蛋白或其編碼序列有效成分占組合物總重量的0. 001 99. 9wt% ；優選為組合物總重量的1 95wt%，較優選為5 90wt%，更優選10 80wt%。 余量為藥學上可接受的載體以及其它添加劑等物質。如本文所用，術語“單位劑型”是指為了服用方便，將本發明的組合物制備成單次 服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發明的另一優選實施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中DRP 蛋白或其編碼序列的含量為0.01 2000mg/劑，優選0. 1 1500mg/劑，更優選1 lOOOmg/劑。在本發明的另一個優選例中，每天施用1 6劑本發明的組合物，優選施用1 3劑；最優選的，每天服用的劑量為1齊U。應理解，所用DRP蛋白或其編碼序列的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴重 程度而變化。具體情況根據對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達到的 效果)來決定，這在熟練醫師可以判斷的范圍內。本發明的組合物，可以為固態(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或 液態(如口服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用(1)直接裸DNA或者蛋白質注射 法；(2)將DRP的cDNA、mRNA和蛋白質與轉鐵蛋白/多聚L-賴氨酸復合物連接，以增強其 生物效應；(3)cDNA、mRNA和蛋白質與帶正電荷的脂類形成復合物，以克服磷酸骨架負電荷 所致的穿越細胞膜的困難；(4)用脂質體包裹cDNA、mRNA和蛋白質后介導進入細胞，既有利 于大分子的順利進入又免受細胞外各種酶的水解作用；(5) cDNA、mRNA和蛋白質與膽固醇 結合使其胞漿保持時間增加10倍；(6)用免疫脂質體轉運cDNA、mRNA和蛋白質可使其特異 性轉運至靶組織和靶細胞；(7)將cDNA、mRNA和蛋白質體外轉染給轉載細胞(如成纖維細 胞)也可較好地將DRP相關藥物載入靶細胞內；(8)電打孔(electroporation)，即借助于 電流將cDNA、mRNA和蛋白質導入靶細胞。此外，本發明的組合物中還可含有用于改善和治療病毒感染性疾病的其它活性物 質，所述的其它活性物質選自下組臨床常用抗病毒藥物(包括抗甲型流感病毒表面M2受 體、抗神經氨酸苷酶、抗單磷酸次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、抗病毒DNA多聚酶、抗HIV逆轉錄 酶、抗HIV蛋白酶、抗唾液酸酶、抗解旋酶)的一種或多種。本發明的DRP相關的核苷酸和蛋白質藥物相互間可以聯合應用，還可以與其它藥 物和治療手段聯合，用于病毒感染性疾病的預防和治療。本發明的優點1.本發明揭示了 DRP及其編碼序列的新功能，即有效促進I型IFN的產生，抑制病 毒復制和擴增，并保護機體器官的正常功能；2.本發明提供了 一種可有效促進I型IFN的產生，抑制病毒復制和擴增，并保護機體器官的正常功能的新型抗病毒感染性疾病藥物。 實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1 :DRP對巨噬細胞系RAW264. 7的IFN- P和干擾素誘導件基因的產牛的促 講作用首先采用pcDNA3. 1 (購自Invitrogen公司)作為真核表達載體，將帶有BamHI/ Kpnl酶切位點的DRP的cDNA產物插入該載體的相應位置，在E. Coli菌株DH_5 a內擴 增該載體，測序鑒定后純化得到DRP的真核表達載體。穩定轉染(轉染試劑JetPei購自 Polyplus公司)小鼠RAW264.7細胞(購自ATCC)，然后將所得穩定轉染細胞系(1X105 個細胞/ml RPMI 1640培養基)，以lOOng/ml LPS(又稱脂多糖，為TLR4的配體，購自 Sigma公司)處理不同時間后，收集細胞和培養上清，制備cDNA用于定量RT-PCR(94°C， 30Sec ；58°C,30Sec ；72°C,30Sec ；共30循環)檢測IFN_0mRNA水平；或者用培養上清通 過ELISA(所用試劑盒購自R&D公司)檢測IFN-0蛋白水平。為了穩定干擾DRP的表達， 我們采用了 pSilenCer2. l-U6-neo干擾載體(購自Ambion公司)，將包含有DRP干擾序列 的合成的21核苷酸雙鏈片段(帶有BamHI/HINDIII酶切位點)插入該載體，然后測序證 明序列正確性，純化后應用于后續試驗。穩定轉染DRP干擾載體(轉染試劑JetPei購自 Polyplus公司)至小鼠RAW264. 7細胞(購自ATCC)，然后將所得穩定轉染細胞系(1 X 105個 細胞/ml RPMI 1640培養基)用100ng/ml LPS, 1 u M CpG 0DN(由上海生工合成，然后去內 毒素純化),10u g/ml poly (I C) (p (I C)(購自Sigma)，分別處理細胞，制備cDNA用于定量 RT-PCR(94°C，30Sec ；58°C，30Sec ；72°C，30Sec ；共 30 循環)檢測 IFN-3、CXCL10、CCL5mRNA 水平；或者用培養上清通過ELISA(所用試劑盒購自R&D公司)檢測IFN-0、CXCL10、CCL5 蛋白水平。IFN- 3 mRNA的定量RT-PCR分析和IFN- 3的ELISA分析的結果分別如圖la和圖 lb所示。結果顯示DRP真核表達載體穩定轉染RAW264. 7細胞促進脂多糖(LPS)誘導的 IFN-3的產生。穩定干擾DRP對RAW264. 7細胞中誘導表達的抑制效果如圖2所示。結果顯示我 們所構建的DRP干擾載體能夠明顯抑制DRP的表達(圖2a)，干擾DRP的表達后可以抑制 LPS、Poly (I:C)、CpG 誘導的 RAW264. 7 細胞 IFN-3、CXCL10、CCL5 的 mRNA 和蛋白質的表達 (圖 2b，c)。該結果表明DRP可以促進巨噬細胞系IFN-0的產生。實施例2 過表達DRP對VSV病毒在RAW264. 7細胞內的復制與擴增的抑制作用
將0. 1M0I的活VSV(武漢大學生命科學院舒紅兵教授惠贈)以及紫外線滅活的 VSV(VSV-UV)加入RAW264. 7細胞中，培養12小時，收集細胞和培養上清。其中，將細胞應用 于VSV L基因的mRNA水平檢測，上清應用于噬斑形成實驗(PFU，參照文獻Xu，L. G.等.Mol. Cell. 19 :727-740(2005))。試驗結果如圖3所示。結果顯示穩定過表達DRP可以顯著抑制VSV病毒在 RAW264. 7細胞系內的復制以及VSV病毒釋放到上清中。該結果表明過表達DRP可以抑制巨噬細胞系中VSV病毒的復制和擴增。t施徹丨3 :DRP腺病毒靜脈灃射對VSV病毒在肝_的擴1曾的抑制作用首先采用Adeno-X病毒載體系統(購自Clontech公司)中的pShuttle2作為克 隆載體，在Sail和Xhol酶切位點間插入DRP的cDNA，在HEK293細胞中將穿梭質粒與病毒 DNA進行重組，并且擴增后，用腺病毒純化試劑盒(購自Clontech公司)。1 X 107PFU Ad-DRP 尾靜脈注射入小鼠(6周雄性SDF級C57BL6小鼠，購自Sipper BK公司)，48h后腹腔內注 射VSV病毒(5X106PFU/小鼠)。12或24h后收集小鼠肝臟，將裂解液應用于噬斑形成實 驗(PFU，參照文獻 Ciavarra, R. P.等.Virology. 342 177-189 (2005)進行)。試驗結果如圖4所示。結果顯示Ad_DRP腺病毒在小鼠體內的過表達可以顯著抑 制VSV病毒在小鼠肝臟的復制和擴增。該結果表明DRP腺病毒靜脈注射可以抑制VSV病毒在肝臟的擴增。實施例4 :DRP轉某因對小鼠來源目復脖巨噬細胞』IFN- P的產牛的促講作用采用pIRES2-EGFP載體(來自于北京生物技術研究所所贈)作為表達載體，使用 Ub啟動子，將DRP的編碼cDNA插入Bglll/Sall位點，通過顯微注射的方法將線性化后的 載體注射入小鼠卵子，移植入雌性C57BL6小鼠(所用小鼠同實施例2)子宮，然后檢測新生 鼠是否表達DRP (檢測鼠尾DNA中DRP的表達)，建立轉基因小鼠。給DRP轉基因小鼠腹腔 注射lml肉湯(購自Sigma)，三天后以PBS沖洗腹腔獲得巨噬細胞。然后分別用lOOng/ml LPS, 1 u M CpG 0DN(由上海生工合成，然后去內毒素純化)，10ii g/ml poly (I C) (p (I C) (購自 Sigma)，1 u g/ml 肽聚糖 PGN(p印tidoglycan，購自 Sigma), 20 u g/ml R837 (購自 Invivogeng公司)處理腹腔巨噬細胞(1X105個細胞/ml RPMI 1640培養基)。2h后收集 細胞做定量RT_PCR(方法同實施例1)分析，4h后收集培養上清用于ELISA(所用試劑盒購 自R&D公司)分析。DRP轉基因小鼠的鑒定結果如圖5所示。結果顯示我們所得小鼠鼠尾基因組DNA 中包含DRP序列，而且轉基因小鼠腹腔巨噬細胞能夠表達DRP的mRNA和蛋白質。DRP轉基 因小鼠腹腔巨噬細胞在受到TLR配體刺激后表達的IFN-0的mRNA和蛋白均明顯升高。該結果表明DRP轉基因可以促進小鼠來源的腹腔巨噬細胞IFN-0的產生。實施例5 :DRP轉基因對小鼠來源腹腔巨噬細胞IFN-g和IRF3報告基因的活化的 促講作用用lml肉湯給DRP轉基因小鼠(所用小鼠同實施例4)腹腔注射，三天后以PBS沖 洗腹腔獲得巨噬細胞(方法同實施例4)。轉染IFN-0和IRF3報告基因(參考文獻An， H.等 Nat. Immunol. 9 :542_550 (2008)進行)，然后用 100ng/ml LPS, 1 u MCpG 0DN, 10 u g/ ml poly(I:C) (p(I:C))處理腹腔巨噬細胞(1X105個細胞/mlRPMI 1640培養基，所采用 處理的試劑和方法同實施例1)，最后檢測熒光素酶(參考文獻An，H.等.Nat. Immunol. 9 542-550(2008)進行)的含量。DRP轉基因小鼠腹腔巨噬細胞IFN-3和IRF3報告基因的活化結果如圖6所示。結 果顯示DRP轉基因小鼠腹腔巨噬細胞在受到TLR配體(LPS和Poly (I:C))刺激后IFN-旦 和IRF3報告基因的轉錄活性均明顯升高。該結果表明DRP轉基因可以促進小鼠來源的腹腔巨噬細胞IFN-3和IRF3報告 基因的活化。t施例6 :DRP轉某因對VSV病毒在目復脖巨卩策細胞內的復制和擴J曾的抑吿lK乍用用1ml肉湯給DRP轉基因小鼠(所用小鼠同實施例4)腹腔注射，三天后以 PBS沖洗腹腔獲得巨噬細胞(方法同實施例4)。將0. 1M0I的活VSV以及紫外線滅活的 VSV(VSV-UV)加入原代細胞，然后培養12小時，收集細胞和培養上清，其中細胞應用于VSV L基因的mRNA水平檢測，上清應用于噬斑形成實驗(PFU)(方法同實施例2)。試驗結果如圖7所示。結果顯示VSV病毒在DRP轉基因(Nrdpl)小鼠的腹腔巨 噬細胞內的復制和擴增相較于野生型(WT)小鼠組明顯受到抑制。該結果表明DRP轉基因可以抑制VSV病毒在腹腔巨噬細胞內的復制和擴增。實施例7 :DRP轉基因對VSV感染后血清中IFN_ P的產牛的促講作用。向DRP轉基因小鼠(所用小鼠同實施例4)腹腔內注射VSV病毒(5X 106PFU/小 鼠)。12、24或48h后收集小鼠血清，ELISA法檢測IFN-0 (方法同實施例1)的含量。試驗結果如圖8所示。結果顯示DRP轉基因小鼠血清中IFN-0的水平在VSV感 染后較野生型(WT)小鼠組顯著升高。該結果表明DRP轉基因可以促進VSV感染后血清中IFN-0的產生。實施例8 =DRP轉基因對VSV感染后所導致的肝臟損傷的抑制作用DRP轉基因小鼠(所用小鼠同實施例4)腹腔內注射VSV病毒(5xl06PFU/小鼠)。 12、24或48h后收集小鼠血清，采用生化自動分析儀(購自SRL公司)檢測血清中谷丙轉氨 酶(AST)和谷草轉氨酶(ALT)的水平。試驗結果如圖9所示。結果顯示DRP轉基因小鼠血清中AST和ALT的水平在VSV 感染后較野生型(WT)小鼠組顯著降低。該結果表明DRP轉基因可以抑制VSV感染后所導致的肝臟損傷。實施例9 =DRP轉基因對VSV感染后在肝臟的復制和擴增的抑制作用DRP轉基因小鼠腹腔內注射VSV病毒(5X 106PFU/小鼠，方法同實施例7)。12、24 或48h后收集小鼠肝臟，將裂解液應用于噬斑形成實驗(PFU，方法同實施例3)。試驗結果如圖10所示。結果顯示DRP轉基因小鼠肝臟的VSV滴度在VSV感染后 較野生型(WT)小鼠組顯著降低。。該結果表明DRP轉基因可以抑制VSV感染后在肝臟的復制和擴增。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國人民解放軍第二軍醫大學
140157]<120> 一種新型抗病毒分子DRP的抗病毒作用、實施方法及用途0158]<130)0927400159]<160>20160]<170>PatentIn version 3.30161]<210>10162]<211>31290163]<212>DNA0164]<213> 智人(Homo sapiens)0165]<220>0166]<221>CDS0167]<222>(214).(1167)0168]<220>0169]<221>misc_feature0170]<222>(2703) (2703)0171]<223>n ==a,c，g，t或u0172]<400>10173]gggcgagtactcctgattgt gacatcacat tcatcccctgggcgatggagottgtcactg600174]ggaaggaata"teagtegga gaatagccaacaagatgggttactgggaga atctcttcag1200175]tggcactgag；ggaggcatc agggggttgg agccttgtga acagggaacc tgccccccaa1800176]cacttggaag^acctgggtt tcagtgatgagacatggggtatgatgtaacccgt2340177]Met Gly Tyr Asp Val Thr Arg0178]150179]ttccagggggatgttgacgaagatcttatetgccctatttgcagtgga2820180]PheGinGlyAspValAspGluAspLeulieCysProlieCysSerGly0181]1015200182]gtcttggaggagccagtacaggcacctcattgtgaacatgetttctgc3300183]ValLeuGluGluProValGinAlaProHisCysGluHisAlaPheCys0184]2530350185]aacgcctgcateacccagtggttctctcagcaacagacatgtccagtg3780186]AsnAlaCyslieThrGinTrpPheSerGinGinGinThrCysProVal0187]404550550188]gaccgtagtgttgtgacggtcgcccatctgcgcccagtaccteggate4260189]AspArgSerValValThrValAlaHisLeuArgProValProArglie0190]6065700191]atgeggaacatgttgteaaagctgcagattgcctgtgacaacgetgtg4740192]MetArgAsnMetLeuSerLysLeuGinlieAlaCysAspAsnAlaVal0193]7580850194]ttcggctgtagtgccgttgtceggcttgacaacctcatgtctcacctc5220195]PheGlyCysSerAlaValValArgLeuAspAsnLeuMetSerHisLeu
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aa3129<210>2<211>317
Met Ala Cys Glu Asn Gin His Met Gly Asp290295Gly Leu Val Met lie Phe Ala His Gly Val305310
Asp Met Val Gin Glu Pro
300 Glu Glu lie 31權利要求
死亡抵抗蛋白及其編碼序列在制備用于預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀的藥物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒感染相關疾病和/或征狀為選自下 組的一種或多種因病毒感染引起的疾病和/或征狀病毒感染后的復制；病毒感染局部的 細胞和組織損傷；或病毒感染造成的器官功能損傷。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒感染是由選自下組的一種或多種 病毒引起的人乳頭狀瘤病毒、乙肝病毒、EB病毒、流行性出血熱病毒、人獲得性免疫缺陷 病毒、嚴重急性呼吸綜合征病毒或流感病毒。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述死亡抵抗蛋白選自(a)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；(b)與SEQID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制病毒感染相關疾病和/或征狀活性 的蛋白；(c)(a)或(b)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸、且具有預防 或治療病毒感染相關疾病和/或征狀活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質或多肽。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述死亡抵抗蛋白的編碼基因選自(i)SEQID NO 1 的序列；或(ii)在嚴格條件下與(i)限定的序列雜交且具有預防或治療病毒感染相關疾病和/或 征狀的分子。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥方法選自直接裸DNA注射 法、脂質體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法、 復制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法或目的基因所編碼蛋白質。
7.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；以及(B)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中死亡抵抗蛋白及 其編碼序列占藥物組合物總重量的0. 001 99. 9wt%。
9.一種藥物組合物，其包含(A)治療有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列；(B)預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀活性的其它活性物質；以及(C)藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。
10.一種預防或治療病毒感染相關疾病和/或征狀的方法，所述方法包括給予需要預 防或治療的對象有效量的死亡抵抗蛋白及其編碼序列。
全文摘要
本發明涉及了一種新型抗病毒分子DRP(死亡抵抗蛋白，Death Resistant Protein)的抗病毒作用、實施方法及用途。本發明提供這種分子在抗病毒感染過程中的應用方法及相應的免疫學原理。本發明公開了這種分子在抗病毒感染中的用途和策略，特別是應用于病毒感染導致的相關疾病的預防和治療。本發明證實了這種分子可以促進I型干擾素的產生，并且對病毒感染機體后在機體內部的復制有抑制作用，保護肝臟等臟器內病毒復制導致的器官損傷。
文檔編號A61P31/14GK101897950SQ20091005224
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月31日 優先權日2009年5月31日
發明者曹雪濤, 汪晨, 陳濤涌 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學