專利名稱：云南紅梨PyTTG1基因及其原核表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種云南紅梨花青素合成調(diào)控、葉毛和毛狀體發(fā)生發(fā)育的調(diào)控基因基因及其原核表達(dá)載體，以及應(yīng)用原核表達(dá)載體制備云南紅梨花青素合成及葉毛、毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白PyTTGl。
背景技術(shù)：
植物花青素的合成是由轉(zhuǎn)錄復(fù)合物MYB-bHLH-WD40調(diào)控的。前人對(duì)MYB和bHLH 研究較多，而對(duì)植物中的WD40蛋白研究較少。WD40蛋白含WD40基序(約40氨基酸的保守序列，以甘氨酸-組氨酸(GH)開始，以色氨酸-天冬氨酸(WD)結(jié)尾)。WD40蛋白含
1-10個(gè)串聯(lián)的WD40基序，一般認(rèn)為至少4個(gè)以上的WD40基序才能形成高級(jí)和有功能的結(jié)構(gòu)。現(xiàn)有研究表明WD40蛋白是一個(gè)結(jié)構(gòu)多樣、功能各異的蛋白家族，通常它們具有兩個(gè)共同特征一是結(jié)構(gòu)域折疊成β_螺旋槳結(jié)構(gòu)，一是形成多蛋白可逆組裝但不具任何催化活性的平臺(tái)，它們主要是在真核生物的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成中起作用。Fritzius等人發(fā)現(xiàn)ProF蛋白是將激酶和底物匯集在一起的適配器蛋白。在植物中，WD40蛋白的作用主要是作為植物特異性發(fā)育事件如開花、花發(fā)育、分生組織形成、花粉發(fā)育和配子形成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。WD40蛋白主要通過其WD結(jié)構(gòu)域與其它蛋白互作，參與植物內(nèi)眾多代謝反應(yīng)的調(diào)控。Morita等人在牽牛花中發(fā)現(xiàn)具有隱性基因ca (編碼Jz7WDRl蛋白)的突變體中，除CHS 外，花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都協(xié)同地減少。Walker等人首次通過定位克隆和互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TTGl蛋白調(diào)控花青素的合成和毛狀體分化。擬南芥TTGl蛋白含4個(gè)WD40基序，其(反2突變體的特點(diǎn)是缺乏表皮毛、種皮透明、種子不經(jīng)休眠就直接萌發(fā)、植株完全缺乏花青素、具有異常的根發(fā)育模式等突變表型，這表明TTGl的功能是多效的。棉花GhTTGl 和GhTTG3具有擬南芥AtTTGl的類似功能不僅能夠恢復(fù)擬南芥ttgl突變體形成毛狀體和花青素，而且還能互補(bǔ)紫羅蘭ttgl突變體在花瓣產(chǎn)生紫色斑點(diǎn)。De等人在矮牽牛中首次發(fā)現(xiàn)WD40蛋白PhANlI，其定位于細(xì)胞質(zhì)，能夠連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活，能夠調(diào)控PhAN2 (MYB)的功能。玉米中的PACl與矮牽牛和擬南芥中花青素調(diào)節(jié)蛋白ANl 1、TTG1極為類似，且 35S-PAC1能夠互補(bǔ)ttgl突變體。Dressel等人發(fā)現(xiàn)WD基序中單個(gè)氨基酸的突變(W158R) 就可抑制DFR基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致白花表型，且MiTTGl的54. 1%高GC含量是進(jìn)化的信號(hào)。Matus等人在擬南芥中異位表達(dá)葡萄勝ZtV導(dǎo)致擬南芥地上部分和蓮座葉中花青素的合成，并通過GFP融合蛋白技術(shù)證明WDRl定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。Zhang等人通過酵母雙雜交和植物過表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGL3、GL3能夠與TTGl (WD40)和MYB蛋白(GL1，PAPl、PAP2、 CPC、TRY)組合，形成MYB/TTG1/WD40復(fù)合物進(jìn)行包括花青素生物合成和毛狀體形成的多功能的調(diào)控。Brueggemann等人通過互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了蘋果MdTTGl具有類似擬南芥AtTTGl的功能。Baudry等人通過遺傳和分子的方法發(fā)現(xiàn)TT2 (MYB)、TT8 (TTGl)和TTGl (WDR)能夠形成四元復(fù)合物直接調(diào)控BAN在植物中的表達(dá)。Payne等通過酵母雙雜交證實(shí)了在擬南芥中GL3/GL1/TTG1復(fù)合物調(diào)控毛狀體的發(fā)育。Bouyer通過克隆分析、異位表達(dá)和微注射試驗(yàn)提出了毛狀體形成的捕獲-耗盡機(jī)制在高濃度的毛狀體促進(jìn)蛋白GL3細(xì)胞中，GL3通過結(jié)合毛狀體形成蛋白TTGl來耗盡臨近細(xì)胞中的TTGl，從而導(dǎo)致毛狀體形成，而周圍的細(xì)胞因 TTGl的減少而不能形成毛狀體。而Zhao等人通過離子轟擊試驗(yàn)證明了 TTGl, GL3, GLl和 GL2并不在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，而R3-MYB，CPC則可在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，提出TTGl復(fù)合物直接調(diào)節(jié)激活子和抑制子，而抑制子的運(yùn)動(dòng)影響擬南芥葉上毛狀體的類型。TTG是多功效基因， Gonzalez等人還發(fā)現(xiàn)TTGl能夠與MYB5和TT2 (MYB)形成復(fù)合物控制外種皮的分化。在蘋果中，Brueggemann等人克隆并驗(yàn)證了 MdTTGl基因的功能,但是并沒有進(jìn)行原核表達(dá)和純化蛋白。但是，在體外驗(yàn)證蘋果和梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，需要純化TTGl蛋白。本發(fā)明選擇著色最好且穩(wěn)定的‘云紅梨I號(hào)’作為實(shí)驗(yàn)材料，克隆云南紅梨‘云紅梨I號(hào)’ PyTTGl基因，進(jìn)行原核表達(dá)和蛋白純化的研究，將為在體外驗(yàn)證蘋果核梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，進(jìn)而在蘋果和梨中構(gòu)建MYB-bHLH_WD40復(fù)合物模型及果樹和花卉的分子育種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種云南紅梨/TiW基因，該基因具有如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中PyTTGl基因來源于云南紅梨。本發(fā)明另一目的是提供南紅梨/TiW基因的原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7，該載體含有r/i 7基因和r/i 7基因的上游有T7啟動(dòng)子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，T7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，/TiW基因的N端和C端均帶有6 XHis標(biāo)簽。本發(fā)明另一目的是將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備云南紅梨花青素合成及葉毛、毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白PyTTGl中，PyTTGl純化蛋白應(yīng)用于研究梨和蘋果中TTGl與MYB和 bHLH等互作中。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
I、云南紅梨r/i 7基因、基因組序列的獲得
(1)根據(jù)蘋果量//TiW基因(GenBank登錄號(hào)為AF220203)編碼框序列和原核表達(dá)載體pET-32a多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)I對(duì)特異弓I物PyTTGl-F 5 ' - 076CCATGGAGAACTCT ACGCAAGAATCG-3' , PyTTGl-R 5/ -07gCTCGAGAACCTTCAAAAGCTGCATCTTG-3'，在上下游引物的5'端分別加入Afc0I和ZAoI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基(下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)堿基);提取云南紅梨果皮的總RNA，并以RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用PyTTGl-F和PyTTGl-R進(jìn)行擴(kuò)增；提取云南紅梨果皮中的基因組，使用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增；
(2)回收的cDNA和gDNA全長(zhǎng)片段。2、構(gòu)建原核表達(dá)載體及gDNA的T/A克隆
使用AfcoI和通ol MPyTTGl基因全長(zhǎng)片段和載體pET32a進(jìn)行雙酶切，分別獲得5'和 3'末端分別帶有Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)的PyTTGl基因和pET32a載體，瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收，然后在16 °C連接16 h，獲得原核表達(dá)載體pET32a-/y77^7，進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析；使用PMD18T載體，將回收的gDNA片段進(jìn)行T/A克隆，酶切驗(yàn)證后，進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)；
LPyTTGl的原核表達(dá)使用熱刺激法將pET32a-/y/7i 7轉(zhuǎn)入大腸桿菌力中，在終濃度I mM IPTG 誘導(dǎo)下篩選最佳表達(dá)條件，并在最適條件下進(jìn)行大量表達(dá)；
4、PyTTGl蛋白純化
收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，過鎳柱進(jìn)行純化，收集純化后的蛋白，純化后的蛋白用于制作PyTTGl蛋白抗體和PyTTGl蛋白表達(dá)檢測(cè)。5、云南紅梨PyTTGl純化蛋白在研究MYB-TTG1-WD40復(fù)合物功能中的應(yīng)用
使用Far-western技術(shù)體外驗(yàn)證PyTTG與PyMYB及PyTTGl的互作，為梨和蘋果中 MYB-bHLH-WD40復(fù)合物模型的建立奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明中克隆的基因是首次在梨中擴(kuò)增得到，進(jìn)行原核表達(dá)和蛋白純化，獲得的PyTTGI蛋白，將解決目前因缺乏該蛋白而無法在體外研究PyTTGI所結(jié)合的蛋白的問題，為在體外驗(yàn)證蘋果核梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，進(jìn)而在蘋果和梨中構(gòu)建 MYB-bHLH-WD40復(fù)合物模型及果樹花卉的分子育種中奠定了基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明云南紅梨果皮的總RNA電泳示意圖。圖2為本發(fā)明基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳示意圖，其中I是DNA Marker III ；2 是PyTTGl基因的PCR產(chǎn)物。圖3為本發(fā)明/TiW基因PCR產(chǎn)物的膠回收電泳示意圖，其中I是DNA Marker III ；2良PyTTGl基因的PCR產(chǎn)物。圖4為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7電泳示意圖，其中I是對(duì)照載體 pET32a-
PyMYB ,2-6 是載體 pET32a_/y/7^7。圖5為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7的酶切檢測(cè)示意圖，其中I是DNA Marker III ;2 是載體 pET32a-/y/7^i 的NcoI 和XhoI 雙酶切結(jié)果。圖6為本發(fā)明中PyTTGl蛋白與其它WD40蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析圖。圖7為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a-/y/7^7在16 °〇和37 V IPTG終濃度為I mM條件下，誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h的表達(dá)情況示意圖,其中M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0431 ；1是 pET-32a空載體轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)菌體的總蛋白；2-5是16 °C、IPTG終濃度為I mM條件下，工程菌誘導(dǎo)2、4、6、8 h后菌體的總蛋白；6-10是37 V、IPTG終濃度為I mM條件下，工程菌誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h后菌體的總蛋白；11是pET-32a空載體轉(zhuǎn)化菌在37 V IPTG終濃度為I mM條件下誘導(dǎo)8 h后菌體的總蛋白。圖8為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7在28 °C、IPTG終濃度為I mM時(shí)，誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h的蛋白表達(dá)情況示意圖，其中I是pET-32a空載體轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)8 h的菌體總蛋白；2_6是原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h的細(xì)菌總蛋白。圖9為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7在16 °C、不同IPTG終濃度下誘導(dǎo)8 h的細(xì)菌總蛋白示意圖，其中M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0431 ; 1-7是IPTG終濃度為分別為O、 O. 1、0. 3、0. 5、0. 7、0. 9、1. O mM/L時(shí)表達(dá)載體誘導(dǎo)8 h的細(xì)菌總蛋白；8是pET_32a空載體轉(zhuǎn)化IPTG終濃度為I mM/L誘導(dǎo)8 h的細(xì)菌總蛋白。圖10為本發(fā)明PyTTGl蛋白的純化電泳示意圖，其中I是加IPTG誘導(dǎo)前的細(xì)菌總蛋白；2是16 °C、IPTG終濃度O. 5 mM下原核表達(dá)載體誘導(dǎo)8 h的細(xì)菌總蛋白；3是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0431 ；4-8是鎳柱純化PyTTGl時(shí)分別使用30、150、200、300和500 mM咪唑洗脫的結(jié)果。圖11本發(fā)明原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7構(gòu)建策略示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍并不局限于所訴內(nèi)容。實(shí)施例中采用的試劑主要為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑，各種限制性內(nèi)切酶、pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄酶為Promaga公司的， 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)有限公司，基因組提取試劑盒購(gòu)自于上海生工生物工程技術(shù)公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。所有引物序列合成和基因測(cè)序均在上海捷瑞生物公司(上海，GeneRay)進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例I :云南紅梨基因、基因組序列的獲得
(I)引物設(shè)計(jì)
根據(jù)蘋果履/ni l基因(GenBank登錄號(hào)為AF220203)編碼框和原核表達(dá)載體pET_32a 多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)I對(duì)特異引物如下
PyTTGl-V 5/ - 076CCATGGAGAACTCTACGCAAGAATCG-3'，
PyTTGl-R 5/ KgCTCGAGAACCTTCAAAAGC TGCATCTTG-3'
在上下游引物的5'端分別加入Afc0I和通Ol酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基(下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)堿基)。(2)總RNA的提取
a、使用液氮將O.I g云南紅梨紅色果皮充分研磨成粉末以后，加入I ml RNA提取緩沖液(4 M異硫氰酸胍,25 mM朽1檬酸鈉,0.5 % (w/v)十二燒基肌氨酸鈉,2 %(w/v)聚乙烯批咯烷酮，巰基乙醇)，研磨均勻后，轉(zhuǎn)入2 ml離心管中，加入1/10體積2 M醋酸鈉(pH 4.2)；
b、顛倒離心管數(shù)次混勻，接著加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩 5 min,冰上靜置 15 min 后,4 °C離心 15 min (12000 g/min)；
C、轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管，加入等體積的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩5 min，冰上靜置 15 min 后,4 °C離心 15 min (12000 g/min)；
d、轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管，加入等體積異丙醇，在-80°C沉淀RNA 30 min，再次4 °C離心15 min (12 000 g/min),讓RNA沉淀在管壁；
e、RNA沉淀經(jīng)75%乙醇清洗兩次后進(jìn)行真空干燥，然后加入20 μ I無RNase的DEPC 處理水徹底溶解RNA ；
f、使用I.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA (見圖I)。(3 )反轉(zhuǎn)錄及 PCR 擴(kuò)增(RT-PCR)CN 102586279 A
以上述總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用PyTTGl-Y和/yrTiW-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到PyTTGl的cDNA序列片段。(4)云南紅梨果皮基因組的提取及基因組序列的擴(kuò)增
使用上海生工的植物基因組提取試劑盒，提取紅梨果皮的基因組；使用基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2。 (5)PyTTGl的cDNA和gDNA全長(zhǎng)片段的回收
對(duì)/>77^1 cDNA及基因組PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段；使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對(duì)目的片段進(jìn)行回收，結(jié)果如圖3。實(shí)施例2 :原核表達(dá)載體的構(gòu)建(見圖11)及PyTTGl gDNA的T/A克隆
使用AfcoI和通ol對(duì)PCR純化產(chǎn)物/TiW基因全長(zhǎng)片段和載體pET32a按照說明書進(jìn)行雙酶切，分別獲得5’端帶有AfcoI和3’端帶有通ol飽PyTTGl片段和pET32a載體， 電泳分析后分別進(jìn)行膠回收，按目的基因載體=照摩爾比3 :1加樣，然后加入連接液I， 16 °C連接16 h。將感受態(tài)大腸桿菌萬.co7i DH5a 100 μ I加入6 μ I連接體系中混勻； 混合液冰浴30 min, 42 °C熱刺激45 s后，冰浴2 min ;加入900 μ I液體培養(yǎng)基S0C，37 °C搖床200 rpm 60 min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后,常溫8 000 rpm離心I min收集菌體； 在超凈臺(tái)上吸去上清，剩余約O. I ml時(shí),使用移液槍混勻,接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37 °C過夜培養(yǎng)；挑取白色菌落，接種于LB液體+ Amp的培養(yǎng)基，37 0C >180 rpm培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒，結(jié)果如圖4 ;進(jìn)行酶切驗(yàn)證(見圖5)后，再送至上海杰瑞生物工程公司測(cè)序進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證插入基因的正確性，最后獲得原核表達(dá)載體 m^a-PyTTGl。按照pMD18T的載體說明書進(jìn)行操作，將基因組序列進(jìn)行T/A克隆， 獲得載體pMD18T-g/y/7i l，使用酶切進(jìn)行驗(yàn)證后，送上海杰瑞生物公司測(cè)序。實(shí)施例3 -.PyTTGl基因及gDNA序列的生物信息學(xué)分析和GenBank登錄號(hào)的獲得測(cè)序結(jié)果表明，該基因的讀碼框?yàn)?029 bp,該基因編碼342個(gè)氨基酸，分子量為
38. 4485 kDa，等電點(diǎn)為4. 87。BLASTp比對(duì)結(jié)果表明，PyTTGl與其它WD40類轉(zhuǎn)錄因子具有很高的同源性，如與桃中的PrTTGl的同源性為95. 32%，啤酒花HuWDR的為86. 69%，矮牽牛 PhANll的為83. 93%，擬南芥AtTTG182的為97%，與蘋果MdTTGl的同源性高達(dá)99. 12%。結(jié)構(gòu)域分析表明，其與蘋果、棉花、擬南芥等的WD40蛋白具有相同的WD40結(jié)構(gòu)域。因PyTTGl 與蘋果MdTTGl相似性較高(見圖6)，將其命名為隨后將其上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)， 獲得其登錄號(hào)為HQ641374。稀有密碼子分析結(jié)果表明基因含有大約10 %的稀有密碼子，其中三聯(lián)體稀有密碼子和二連體稀有密碼子各I個(gè)，因此需要使用能夠補(bǔ)充稀有密碼子的大腸桿菌辦力菌株進(jìn)行原核表達(dá)。測(cè)序結(jié)果表明的gDNA序列與其cDNA序列完全相同，這說明該基因不含有內(nèi)含子序列，在生物進(jìn)化過程中高度保守，因此，TTGl (WD40蛋白)在生命代謝過程中具有重要作用。實(shí)施例4 =PyTTGl蛋白的原核表達(dá)
使用熱刺激法將重組質(zhì)粒pET32a-/y/7i 7轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TfoMiia (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。涂LB + Amp固體平板，挑取pET32a-/y/7i 7的重組菌落于LB + Amp液體培養(yǎng)基中 37 0C >200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，按I :100的比例接種于相同的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至OD6tltl為 O. 6-0. 8，加IPTG至終濃度為O. 5 mM，分別在37°C、28°C和16°C條件下培養(yǎng)0、2、4、6和8 h 后收集菌液用于分析總蛋白。4 0C ,12 000 rpm離心I min，棄上清液，沉淀用100 μ I SDS
7凝膠加樣緩沖液(Tris-HCl 50 mM, pH 6. 8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚藍(lán)(λ I % ;甘油 10 %)重懸，煮沸5 min后，12 000 rpm離心I min，取20 μ I上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(O. I %考馬斯亮藍(lán)R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脫色液 (25 %甲醇，6 %冰乙酸)進(jìn)行脫色后，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。結(jié)果顯示插入有外源片段的重組質(zhì)粒pET32a-/y/7i 7經(jīng)終濃度I mM IPTG誘導(dǎo)后，在37、28和16 °C下均誘導(dǎo)出了預(yù)期的蛋白分子量約59 kD (包括載體上TRX蛋白)的蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和pET-32a對(duì)照質(zhì)粒未出現(xiàn)這條蛋白帶(圖7和圖8)。表明重組質(zhì)粒pET32a-/yr/i 7在大腸桿菌辦Miia 力中誘導(dǎo)表達(dá)了 PyTTGl蛋白。為獲得在16 °C條件下最佳誘導(dǎo)的 IPTG濃度，使用 IPTG終濃度梯度分別為 O mM/L、O. I mM/L、O. 3 mM/L、O. 5 mM/L、O. 7 mM/L、
0.9 mM/L、I mM/L分別對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)8 h。結(jié)果表明，當(dāng)IPTG終濃度為O. 5 mM/L時(shí)蛋白的表達(dá)量最高(圖9)。為獲得最大量的誘導(dǎo)目的蛋白，作者又進(jìn)行了 16 °C、IPTG終濃度為O. 5 mM/L條件下誘導(dǎo)10 h和22 h的試驗(yàn)，結(jié)果表明隨著時(shí)間的增加，蛋白的表達(dá)量繼續(xù)增加，22 h的表達(dá)量最高。實(shí)施例5 =PyTTGl蛋白的純化，具體步驟如下
a、菌體破碎將在16°C、0. 5 mM IPTG下大量誘導(dǎo)表達(dá)22 h的500 ml菌體，經(jīng)超聲破碎菌體(工作3 s,休息6 s) 5 min ；
b、收集上清和沉淀將菌體破碎液40C >12 000 rpm離心20 min，分別保留上清和沉
淀；
C、蛋白破碎上清液使用O. 22 μ M濾器進(jìn)行過濾，除去雜質(zhì)；
d、His-TrapHP柱的預(yù)處理使用5倍柱體積純水洗柱；5倍柱體積結(jié)合緩沖液(磷酸鈉緩沖液20 mM (pH7. 4), NaCl 0.5 M，咪唑30 mM)平衡柱子，流速為I ml/min ;
e、蛋白樣品上柱流速為Iml/min,收集流出液；
f、洗柱使用5倍柱體積結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.4，NaCl O. 5M，咪唑30 mM)洗脫；
g、洗脫分別使用5倍柱體積洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.4，NaCl 0.5 M， 咪唑30、150、500 mM)依次洗脫，收集洗脫液；
h、His-TrapHP柱的后處理5柱體積洗脫緩沖液(磷酸鈉緩沖液20 mM(pH7. 4)，NaCl
0.5 M，咪唑500 mM)洗去所有蛋白；5倍柱體積純水洗柱；5倍柱體積20 %乙醇洗柱；柱子前后封口，于4 °C、20 %的乙醇中保存；
i、SDS-PAGE檢測(cè)分別取50μ I各咪唑梯度流出液，加入5 μ I的5Χ蛋白上樣緩沖液，混勻后，煮沸5 min,4 °C>13 000 rpm離心5 min后，各取20 μ I上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 分析，純化結(jié)果如圖10，最終獲得PyTTGl純化蛋白。因?yàn)樘O果中的MdTTGl和梨中的PyTTGl蛋白具有高度的相似性，所以本發(fā)明中的 PyTTGl純化蛋白可用于研究梨和蘋果中TTGl-MYB和TTGl-bHLH等與其它與TTGl互作的蛋白。本發(fā)明將為蘋果和梨中MYB-bHLH-WD40互作模型的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.云南紅梨基因，其特征在于基因具有如SEQID NO. 3所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的云南紅梨基因，其特征在于基因來源于云南紅梨。
3.權(quán)利要求I所述云南紅梨/TiW基因的原核表達(dá)載體pET32a-/y/7i 7，其特征在于該載體含有r/i 7基因，/yr/i 7基因的上游有T7啟動(dòng)子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS， T7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，/TiW基因的N端和C端均帶有6XHis 標(biāo)簽。
4.權(quán)利要求3的所述的原核表達(dá)載體在制備云南紅梨花青素合成及葉毛、毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白PyTTGl中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種云南紅梨PyTTG1基因及其原核表達(dá)載體，具體涉及一種云南紅梨花青素合成、根毛、葉毛和毛狀體發(fā)生發(fā)育的調(diào)控蛋白PyTTG1基因及其原核表達(dá)載體，并將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備云南紅梨花青素合成及葉毛、毛狀體發(fā)生發(fā)育調(diào)控蛋白PyTTG1中，具體是利用RT-PCR技術(shù)從云南紅梨果皮中克隆PyTTG1基因全長(zhǎng)cDNA，然后再利用原核表達(dá)載體將該全長(zhǎng)基因在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進(jìn)行表達(dá)純化，獲得云南紅梨PyTTG1純化蛋白，及云南紅梨PyTTG1純化蛋白在研究TTG1-MYB、TTG1-bHLH等互作及MYB-bHLH-WD40模型構(gòu)建中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102586279SQ20121006499
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者崔道磊, 張曉東, 李昆志, 樊磊, 舒群, 蘇俊, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)