專利名稱：一種高產α-酮戊二酸酵母工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高產α -酮戊二酸酵母工程菌，特別是一種通過代謝工程手段過量表達RoPYC2基因提高胞內丙酮酸羧化酶活性來強化三羧酸循環的回補途徑，從而調控碳代謝流從丙酮酸進入三羧酸循環，實現α-酮戊二酸過量積累的酵母工程菌。
背景技術：
α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，簡稱a-KG)是一種重要的有機酸，在食品、 醫藥、化工和化妝品等行業都有廣泛應用。作為三羧酸循環(TCA)的重要中間產物之一， α-酮戊二酸參與氨基酸、蛋白質、維生素合成以及能量代謝等重要過程，在微生物細胞碳氮代謝調控中起著重要的作用。目前，工業上生產α-酮戊二酸主要采用化學合成的方法，但是高污染、使用有毒和有害化學試劑等缺點限制了它的發展空間，而微生物發酵法正以高產量、高生產強度、環境友好等優點受到越來越多的關注。國內外關于微生物發酵法生產α-酮戊二酸的研究主要集中于對發酵條件的優化和控制，但是簡單的發酵優化并不能很好地解決副產物積累的問題，代謝工程作為一種理性的菌種改造方法能夠更加有效地實現目標產物的高產。雖然， 目前采用代謝工程手段來強化α -酮戊二酸積累的研究鮮有報道，但是鑒于丙酮酸羧化途徑在丙酮酸代謝和TCA循環中的重要作用，強化丙酮酸羧化途徑應該是一條促進碳代謝流進入TCA循環的有效策略。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種高產α -酮戊二酸酵母工程菌，其通過過量表達丙酮酸羧化酶基因，強化胞內丙酮酸代謝途徑中的重要支路-丙酮酸羧化途徑的代謝通量，實現α-酮戊二酸的過量積累。以下是本發明技術方案的詳細描述。替換質粒上原有的標記基因賦予重組質粒對潮霉素B的抗性根據NCBI網站上hph基因序列(Genbank :K01193. 1)，采用化學全合成方法， 獲得 hph 基因序列并克隆到質粒 p0 (Swennen, D. , M. F. Paul, L. Vernis, J. M. Beckerich, A. Fournier, and C.Gaillardin. 2002. Secretion of active anti—Ras single-chain Fv antibody by the yeasts Yarrowia lipolytica and Kluyveromyces lactis. Microbiol-Sgm 148 :41-50)中，利用hph基因替換質粒pO上原有的URA3標記基因，賦予重組質粒PO (hph)對潮霉素B的抗性，便于后續重組菌的篩選。構建好的重組質粒經酶切分析，并進行DNA測序?；驕y序結果與預期一致，表明質粒改造成功。目的基因RoPYC2擴增與表達質粒的構建根據NCBI網站上Genbank HM130700. 1，采用基因全合成方法獲得丙酮酸羧化酶 RoPYC2基因，克隆到pO (hph)，得到表達載體pO (hph) -RoPYC2。重組質粒經酶切分析，并進
行DNA測序?；驕y序結果與預期一致，表明重組質粒構建正確。
過量表達RoPYC2的Y. Iipolytica重組菌的篩選將重組質粒pO (hph)-RoPYC2經AvrII酶切、純化后,醋酸鋰法轉化Y. Iipolytica WSH-Z06感受態細胞。將能在YPD+HygB平板上生長的菌落，在YPD+HygB平板上連續轉接三代，得到遺傳穩定的重組子。挑取陽性重組子若干提基因組，利用引物RoPYC2-F 和RoPYC2-R進行PCR驗證，得到大約3. 5kb的片段，表明RoPYC2基因已成功整合到 Y. Iipolytica WSH-Z06 (保藏編號CCTCC NO :M207143)基因組中。所得重組菌命名為 Y. lipolytica-RoPYC20該菌在以甘油為唯一碳源的培養基上生長時，丙酮酸羧化酶活性為
O.87U/mg protein,是出發菌株的10. 2倍。微生物菌株的種子培養與發酵種子培養基(g/L):葡萄糖20g,蛋白胨IOg,磷酸二氫鉀Ig,七水硫酸鎂O. 5g,瓊脂20g(斜面用)，ρΗ5·5，自來水定容至IL0發酵培養基(g/L):甘油100g，硫酸銨3g，磷酸二氫鉀3g，七水硫酸鎂I. 2g，氯化鈉O. 5g/L,磷酸氫二鉀O. Ig,鹽酸硫胺O. 2 μ g,碳酸|丐20g (搖瓶時添加),自來水定容至 1L。種子培養基和發酵培養基的滅菌溫度為115-121°C，15min。維生素等熱敏性材料配制后O. 22 μ m膜過濾除菌，接種前加入。將實驗菌株接種到種子培養基中，500mL搖瓶裝液50mL，于28°C、200rpm條件下培養 20-24h。按10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，28°C，200rpm條件下培養 144h。細胞干重的測定取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加2mL鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10mL，搖勻，用UV 7500型可見分光光度計，于570nm處比色測OD值，用細胞干重標準曲線算得細胞干重。甘油、丙酮酸和α -酮戊二酸濃度的測定高效液相色譜(HPLC)儀器=Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、示差折光檢測器和工作站)，色譜條件色譜柱AminexΗΡΧ-87Η ion exchange column流動相5mMH2SO4流速0.6mL/min柱溫35°C進樣量5μ L紫外檢測器波長210nm(檢測丙酮酸和α -酮戊二酸)示差折光檢測器檢測甘油樣品制備500 μ L發酵液在10，OOOrpm下離心lOmin，取上清液移入I. 5mL離心管
中測甘油、丙酮酸和α-酮戊二酸的含量。取100 μ L上清液移入5mL容量瓶中，超純水定容至刻度線，經0. 45 μ m濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。本發明的有益效果本發明的特點是以一株能以甘油為唯一碳源，過量積累 α -酮戊二酸的Y. Iipolytica WSH-Z06為出發菌株，利用代謝工程手段構建了一株能過量表達RoPYC2基因的重組菌Y. Iipolytica WSH_Z06-RoPYC2。通過強化丙酮酸羧化途徑，加大碳代謝流進入TCA循環的通量，促進a -酮戊二酸的過量積累，同時減少副產物-丙酮酸的生成。在發酵144h后，a-酮戊二酸產量達到47. 2g/L，是出發菌株的I. 3倍。這一調節微生物細胞中TCA循環的回補途徑，促進代謝流流向TCA循環中間代謝產物，實現代謝產物過量積累的策略，為工業生物技術特別是采用代謝工程手段改造菌株來提高目的產物的生成提供了新的技術思路。
具體實施例方式實施例I替換質粒上原有的標記基因賦予重組質粒對潮霉素B的抗性根據NCBI網站上hph基因序列(Genbank K01193. I)，采用化學全合成方法，獲得 hph基因序列并克隆到載體質粒p0中，利用hph基因替換質粒p0上原有的URA3標記基因， 得到重組質粒PO (hph)。重組質粒轉化大腸桿菌JM109，挑取能在Amp平板上生長的菌落，以 hph-F和hph-R為引物進行菌落PCR鑒定，得到大小約為I. 6kb的條帶。菌落PCR驗證正確的轉化子提取質粒，送上海生工進行測序，測序結果與預期一致，表明質粒改造成功。質粒經AvrII酶切，膠回收酶切片段，得到可用于轉化的整合片段，醋酸鋰法轉化Y. Iipolytica WSH-Z06感受態細胞。將能在YPD+HygB平板上生長的菌落，提取全基因組作為模板，hph_F 和hph-R為引物PCR擴增得到約I. 6kb大小的片段，表明含有hph基因的片段已成功整合到Y. Iipolytica WSH-Z06基因組上，重組菌命名為Y. lipolytica-CON，作為后續發酵性能驗證中的對照菌株。將重組菌Y. Iipolytica-CON涂布YPD+HygB平板，28°C靜置培養至長出單菌落。挑取500個單菌落分別點種于YH)和YPD+HygB平板上。根據YTO和YPD+HygB 平板上菌體的生長情況進行重組質粒的穩定性驗證。結果顯示所有接種于YPD和YPD+HygB 平板上的菌都長出了單菌落，表明重組質粒具有良好的穩定性，可用于外源基因的表達。其中YPD 培養基(g/L)葡萄糖20g, Tryptone 20g, Yeast extract IOg,固體培養基添加 20g 瓊脂。YPD+HygB 抗性平板(g/L)YPD+200mg潮霉素B，固體培養基添加20g瓊脂。實施例2重組菌Y. lipolytica-RoPYC2的構建及鑒定根據NCBI網站上RoPYC2基因序列(Genbank HM130700. I)，采用化學全合成方法，得到RoPYC2目的片段(大小約為3. 5kb)。利用酶切連接技術將RoPYC2基因與經SfiI和 NotI酶切后的質粒pO (hph)連接，得到RoPYC2基因表達載體pO (hph) -RoPYC2。構建好的重組質粒經酶切分析，并進行DNA測序?；驕y序結果與預期一致，表明重組質粒構建正確。 將重組質粒PO (hph) -RoPYC2經AvrII酶切、純化后，醋酸鋰法轉化Y. Iipolytica WSH-Z06 感受態細胞。將能在YPD+HygB平板上生長的菌落，在YPD+HygB平板上連續轉接三代，得到遺傳穩定的重組子。挑取陽性重組子若干提基因組，利用引物RoPYC2-F和RoPYC2-R進行PCR驗證，得到大小約3. 5kb的目的片段，表明RoPYC2基因已成功整合到Y. Iipolytica WSH-Z06基因組中。所得重組菌命名為Y. lipolytica-RoPYC2。該菌在以甘油為唯一碳源的培養基上生長時，胞內丙酮酸羧化酶活性達到0. 87U/mg protein，是對照菌株的10. 2倍。其中YPD 培養基(g/L)
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葡萄糖20g, Tryptone 20g, Yeast extract IOg,固體培養基添加 20g 瓊脂。YPD+HygB 抗性平板(g/L)YPD+200mg潮霉素，固體培養基添加20g瓊脂。實施例3甘油為唯一碳源時重組菌與對照菌發酵特性的比較以甘油為唯一碳源，發酵144h后，重組菌和對照菌相比(I)對照菌中α-酮戊二酸產量為36. 3g/L，重組菌中α -酮戊二酸產量可達47. 2g/L，是對照菌的I. 3倍；(2) 對照菌中丙酮酸含量為21. 2g/L，而重組菌中丙酮酸含量僅為10. 4g/L，丙酮酸積累減少了 51%，過量表達RoPYC2基因有效地將碳代謝流從丙酮酸導向中α _酮戊二酸的生成，在提高α-酮戊二酸產量的同時減少了丙酮酸的積累。
權利要求
1.一種高產a-酮戊二酸酵母工程菌，其特征在于過量表達外源丙酮酸羧化酶基因。
2.權利要求I所述的酵母工程菌，其特征在于所述丙酮酸羧化酶基因核苷酸序列如 Genbank HM130700. I 所不。
3.權利要求I所述酵母工程菌的構建方法，其特征在于根據GenbankHM130700. 1，化學全合成方法獲得米根霉(Rhizopus oryzae)丙酮酸羧化酶基因，克隆到表達載體后轉化 Y. Iipolytica WSH-Z06 后得到重組菌。
4.權利要求I所述酵母工程菌應用于a-酮戊二酸的生產，其特征在于采用所述基因工程菌為出發菌株，接種到種子培養基中，500mL搖瓶裝液50mL，于28°C、200rpm條件下培養20-24h ;按10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，28°C，200rpm條件下培養 144h。
5.根據權利要求書4所述的方法，其特征在于種子培養基組成為(g/L):葡萄糖20g， 蛋白胨10g，磷酸二氫鉀lg，七水硫酸鎂0. 5g，瓊脂20g(斜面用)，pH 5.5，自來水定容至 1L。
6.根據權利要求4所述的生產方法，其特征在于發酵培養基組成為(g/L):甘油100g， 硫酸銨3g，磷酸二氫鉀3g，七水硫酸鎂I. 2g，氯化鈉0. 5g，磷酸氫二鉀0. Ig,鹽酸硫胺0.2 u g,碳酸I丐20g (搖瓶時添加),自來水定容至1L。
7.根據權利要求5所述的方法,其特征是重組菌Yarrowialipolytica_RoPYC2在以甘油為唯一碳源，發酵144h后，a -酮戊二酸產量達到47. 2g/L，是出發菌株的I. 3倍，成功實現了 a-酮戊二酸的過量積累。
全文摘要
本發明公開了一種通過強化丙酮酸羧化途徑促進α-酮戊二酸積累的方法，將來源于米根霉(Rhizopus oryzae)中編碼丙酮酸羧化酶的基因RoPYC2過量表達于發酵法生產α-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06中，獲得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重組菌，其丙酮酸羧化酶活性提高了10.2倍(達到0.87U/mg protein)；以甘油為唯一碳源，發酵144h后，α-酮戊二酸產量達到47.2g/L，是出發菌株的1.3倍；丙酮酸產量降低到10.4g/L，是出發菌株的49.0％。本發明通過調控三羧酸循環的回補途徑，成功實現了碳代謝流從丙酮酸節點流向α-酮戊二酸節點，在提高α-酮戊二酸產量的同時，減少了副產物-丙酮酸的生成。為今后利用代謝工程手段改造菌株促進目標產物過量積累提供了一定的借鑒意義。
文檔編號C12N1/19GK102586128SQ20121006644
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年3月14日
發明者周景文, 堵國成, 殷曉霞, 陳堅 申請人:江南大學