專利名稱：細腳擬青霉人工培養方法及其制藥用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥和天然藥物技術領域，具體涉及細腳擬青霉人工培養方法及其制藥用途。
背景技術：
細腳擬青霉[Paecilomycestenuipes (Peck) Samson]是高雄山蟲草(Cordycepstakaomontana Yakushiji & Kumazawa)的無性型。研究表明，細腳擬青霉的主要化學組分如甾醇類、糖醇類、生物堿、有機酸類和微量元素與天然冬蟲夏草十分相似，所含氨基酸種類亦相同，但是多種氨基酸卻高出冬蟲夏草。藥理研究表明，細腳擬青霉在體外對乙型肝炎病毒、乙醇性肝損傷、肝纖維化，體內對四氯化碳急性肝損傷有很好的防護作用，且效果比同劑量的冬蟲夏草更顯著，因此認為細腳擬青霉可能是肝臟組織良好的保護劑或對治療肝臟各種疾病具有較好的輔助作用。同時細腳擬青霉人工培養物來源簡單易得，可以解決天然藥用蟲生真菌資源稀缺，生產周期長，產量低，質量不穩定等問題。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，提供一種細腳擬青霉人工培養方法，及其產物在制藥中的用途。本發明一方面提供了一種細腳擬青霉人工培養方法，包括下列步驟I)斜面菌種制備將細腳擬青霉菌株接種到斜面培養基上，20 25°C下，培養7 10天；所述斜面培養基為PSA (馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基)、PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)或YMB固體培養基。2)搖瓶種子液的制備從步驟I)中制得的斜面上刮取菌絲接種到以PSB (馬鈴薯蔗糖液體培養基)或TOB (馬鈴薯葡萄糖液體培養基)為種子培養基的培養液中，24 26°C下，140 160rpm,培養3 5天即制得細腳擬青霉搖瓶種子液；3)將步驟2)中制得的搖瓶種子液按重量百分比為5% 10%接入滅菌后的PSB或PDB液體培養基為種子培養基的發酵罐中，24 26°C下，140 160rpm，培養I 2天即制得細腳擬青霉發酵罐種子液；4)將步驟3)中制得的發酵罐種子液按重量百分比為5% 10%接入滅菌后的固相培養基中，在溫度為23 26°C，濕度為50 90%的條件下，靜置封閉式培養30 35天；濕度優選為70-80%。5)采收。所述細腳擬青霉子實體的固相培養基的組分及各組分的重量份為大麥30-40H2O70-60用此種培養基培養出來的細腳擬青霉產量分別比用小米、小麥、大米、大麥加高粱、小麥加大麥為培養基培養的細腳擬青霉產量分別高90%、31%、200%、250%和30%。
步驟I)所述菌株優選菌種保藏號為CGMCC NO. 4176的細腳擬青霉菌株。此菌種為申請人從采集的鱗翅目幼蟲感病體中分離純化后篩選獲得。
該菌株已于2010年9月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 4176,分類命名為細腳擬青霉Paecilomyces tenuipes,保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。經中國科學院微生物研究所形態特征鑒定，細腳擬青霉菌CGMCC No. 4176的主要形態特征為在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基上菌落白色，致密，初期背面淺黃色，后期菌落上形成大量孢梗束，背面呈淺黃褐色。菌絲無色，分枝，平滑，具隔膜，寬I. 5-3. Oy m。分生孢子梗從菌絲上伸出，無色，平滑，分枝，長達110. 0 y m，寬達4. 0 y m。孢梗束白色至奶油黃色，長10-30厘米，產孢細胞瓶狀，無色，2-6個簇生在孢子梗上呈帚狀，頂部變細窄，5. 0-8. 0 X 2. 5-3. 2 u m。分生孢子大部分圓柱形，部分橢圓形，也有臘腸形彎曲，單孢，無色，平滑，鏈生，5. 0-6. 7X2. 0-2. 5 (3.0) Um0在查氏培養基上，灰白色，拱起，蓬松，絨毛狀，孢梗束生長差或不長。在薩氏培養基上未見菌落生長。該菌生長最適溫度為24-26°C，在pH 3-11之間均能夠生長，但pH5. 0-6. 7之間生長最佳。在固體谷物培養基上發酵，菌苔灰白色，子實體(孢梗束)色澤鮮黃，生育甚佳，采收期30-40天。此菌培養產物通過分析表明，化學組分均含天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等；微量元素含鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鎳、硒等；此外，多糖、腺苷、甘露醇、留醇、有機酸和生物堿類與冬蟲夏草活性成分上基本一致或超過冬蟲夏草。優選的，步驟3)接種固體培養基后，靜置固體發酵，加人工散射光源(連續增加光照強度100-150LUX)，并定時通風排氣(間隔6-8小時進行通風排氣，每次送風、排氣30-40分鐘)，調節空氣中氧氣、二氧化碳濃度。上述培養條件更利于形成子實體。本發明的培養方法獲得的細腳擬青霉子實體，腺苷含量可達I. 4mg/g以上，蟲草酸含量可達47mg/g,總糖含量可達186mg/g。本發明第二方面提供了一種細腳擬青霉人工培養產物，為上述培養方法培養后采收獲得。進一步的，所述細腳擬青霉人工培養產物可以是采收獲得的子實體。本發明第三方面提供了上述細腳擬青霉人工培養產物在制備預防及治療肝臟疾病的藥物或保健品中的應用。所述肝臟疾病可以是化學性肝損傷、病毒性肝炎或肝纖維化等。本發明第四方面，提供一種預防及治療肝臟疾病的中藥制劑，所述中藥制劑的主要藥效成分為所述細腳擬青霉人工培養產物或所述細腳擬青霉人工培養產物的有效成分提取物。本發明還提供了所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑的制備方法，所述制備方法選自如下方法中的任一種I)粉碎將所述細腳擬青霉人工培養產物干燥后直接粉碎，過篩制得所述中藥制劑；2)將所述細腳擬青霉人工培養產物提取有效成分后干燥獲得所述中藥制劑。所述細腳擬青霉人工培養產物提取有效成分的方法可以采用常規的中藥有效成分提取方法來提取其有效成分，如采用溶劑提取。較佳的，所述采用溶劑提取為采用有機溶劑、水或有機溶劑與水的混合液提取；所述有機溶劑可選自乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮和石油醚中的一種或多種的混合物；所述有機溶劑和水的混合溶液優選為乙醇水溶液。進一步優選為水提。較佳地，所述水提的方法為將所述細腳擬青霉人工培養產物加水煎煮(所用水量為細腳擬青霉人工培養產物重量的6-10倍)，過濾，濃縮至適量。所述煎煮次數較佳為2 3次，每次煎煮時間為15 60分鐘。優選地，所述水提法中，煎煮后得到的煎液先過80目篩，抽濾除雜。優選地，所述水提法中，所述濃縮為減壓薄膜濃縮。進一步的，水提法濃縮后采用噴霧干燥法干燥。本發明的中藥制劑中除含有所述細腳擬青霉人工培養產物或細腳擬青霉人工培養產物的有效成分提取物外，還可含有藥物可接受的載體，載體的重量百分比含量可為1-50%，優選為 20%-38%。本發明的中藥制劑可以按照藥劑學上的通用方法制成任何常規的制劑形式，包括口服制劑。優選的是膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、粉劑、糖漿劑，最優選為膠囊劑。本發明的中藥制劑可用于預防及治療化學性肝損傷、病毒性肝炎、肝纖維化等肝臟疾病。安全有效、無明顯毒副作用。本發明的發酵方法而獲得的細腳擬青霉人工培養產物人具有產量高的優勢。用此種發酵方法培養出來的細腳擬青霉產量分別比用小米、小麥、大米、大麥加高粱、小麥加大麥為培養基培養的細腳擬青霉產量高90%、31%、200%、250%和30%。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例I細腳擬青霉的人工培育。將細腳擬青霉菌株(CGMCC NO. 4176)接種到PSA斜面培養基上，22°C下，培養10天；從斜面上刮取菌絲接種到以PDB液體為基礎的三角瓶液體培養基中，24°C下，140rpm,培養3天即可制得蟬擬青霉搖瓶種子液；將細腳擬青霉搖瓶種子液按體積百分比為10%接入滅菌后的PSB液體為種子培養基的發酵罐中，24°C下，攪拌速率140rpm，培養2天即可制得細腳擬青霉發酵罐種子液；將制得的發酵罐種子液按重量百分比為5%接入滅菌后的所述固相培養基中，在溫度為24°C，濕度為70%的條件下，固體發酵時，增加人工散射光源(連續增加光照強度150Lux)，并定時通風排氣(間隔8小時進行通風排氣，每次送風、排氣30分鐘)靜置封閉式培養35天后采收。本實施方式所述的固體培養基配比為大麥40重量份，水為60重量份；其制備方法為將大麥和水按比例混合，高壓蒸汽滅菌后，即得。實施例2、
細腳擬青霉的人工培育將細腳擬青霉菌株(CGMCC NO. 4176)接種到PSA斜面培養基上，23°C下，培養9天；從斜面上刮取菌絲接種到以PSA液體為基礎的三角瓶液體培養基中，25 °C下，150rpm，培養3天即可制得蟬擬青霉搖瓶種子液；將細腳擬青霉搖瓶種子液按體積百分比為5%接入滅菌后的PSB液體為種子培養基的發酵罐中，25°C下，攪拌速率150rpm，培養2天即可制得細腳擬青霉發酵罐種子液；將制得的發酵液按重量百分比為10%接入滅菌后的所述固相培養基中，在溫度為25°C，濕度為75%的條件下，固體發酵時，固體發酵時，增加人工散射光源(連續增加光照強度140Lux)，并定時通風排氣(間隔6小時進行通風排氣，每次送風、排氣40分鐘)靜置封閉式培養33天后采收。
本實施方式所述的固體培養基配比為大麥30重量份，水為70重量份；其制備方法為將大麥和水按比例混合，高壓蒸汽滅菌后，即得。實施例3細腳擬青霉的人工培育將細腳擬青霉菌株(CGMCC NO. 4176)接種到PSA斜面培養基上，24°C下，培養8天；從斜面上刮取菌絲接種到以PDA液體為基礎的三角瓶液體培養基中，26°C下，160rpm,培養3天即可制得蟬擬青霉搖瓶種子液；將細腳擬青霉搖瓶種子液按體積百分比為8%接入滅菌后的PSB液體為種子培養基的發酵罐中，26°C下，攪拌速率160rpm，培養I天即可制得細腳擬青霉發酵罐種子液；將制得的發酵液按重量百分比為10%接入滅菌后的所述固相培養基中，在溫度為26°C，濕度為80%的條件下，固體發酵時，固體發酵時，增加人工散射光源(連續增加光照強度130Lux)，并定時通風排氣(間隔6小時進行通風排氣，每次送風、排氣40分鐘)靜置封閉式培養30天后采收。本實施方式所述的固體培養基配比為大麥30重量份，水為70重量份；其制備方法為將大麥和水按比例混合，高壓蒸汽滅菌后，即得。實施例4細腳擬青霉人工培養產物的有效成分檢測I、腺苷含量測定I. I儀器與試藥Waters 高效液相色譜儀(1525BINARY HPLC PUMP, 2998 Photodiode ArrayDetector，美國Waters公司);SB25_12DT超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);Millipore Simplicity超純水儀(美國Millipore公司)；乙腈(HPLC級，Fisher);磷酸二氫鉀(AR級，國藥集團化學試劑有限公司)；石油醚(AR級，60-90°C，國藥集團化學試劑有限公司)；腺苷(A9251-1G，Sigma公司)。I. 2 方法I. 2. I色譜條件色譜柱XBridgeC18 色譜柱(Waters, 4. 6mmX 250mm, 5 u m) ;XBridgeC18Guard4. 6mmX 20mm, 5 u m ;流動相乙臆-0. 04mol/L 憐酸二氫鉀(5:95);流速:1. OmT,/min ;檢測波長260nm ;柱溫35°C ;進樣量20 u L。I. 2. 2對照品溶液的制備精密稱取50mg腺苷對照品，置50mL容量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度制成lmg/mL溶液。精密移取適量lmg/mL腺苷對照品溶液,分別配制成IOOii g/mL>50 u g/mL、30 u g/mL、10 u g/mL>5 u g/mL 和 I ii g/mL 腺苷對照品溶液,備用。I. 2. 3供試品溶液的制備精密稱取I. 0118g細腳擬青霉樣品粉末(實施例I采收子實體)，于IOOmL具塞錐形瓶中，加IOmL石油醚(60-90°C )，超聲30min。過濾，揮干石油醚，連同濾紙一并放入瓶中。在瓶中加入20mL超純水,稱總重(包括錐形瓶重量),超聲30min。快速冷卻后稱重，以超純水補至總重，混勻后離心，取上清液，過針筒式濾器得樣品提取液。I. 2. 4標準曲線繪制將對照品I ii g/mL、5 u g/mL、10 u g/mL、30 u g/mL、50 u g/mL、100 U g/mL 溶液進樣，按I. 2. I項下色譜條件測定，以樣品濃度(U g/mL)為橫坐標，峰面積(微伏 秒)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。 I. 2. 5供試樣品腺苷含量測定取I. 2. 3項下制備的供試樣品溶液與超純水以I :1的比例混勻，制成待測液。取待測液按I. 2. I項下色譜條件進樣，由回歸方程得待測液腺苷濃度X，根據下列公式得到供試品腺苷含量(mg/g)。計算公式
權利要求
1.一種細腳擬青霉人工培養方法，包括下列步驟 1)斜面菌種制備將細腳擬青霉菌株接種到斜面培養基上，20 25°C下，培養7 10天; 2)搖瓶種子液的制備從步驟I)中制得的斜面上刮取菌絲接種到以PSB或PDB為種子培養基的培養液中，24 26°C下，140 160rpm，培養3 5天即制得細腳擬青霉搖瓶種子液； 3)將步驟2)中制得的搖瓶種子液按重量百分比為5% 10%接入滅菌后的PSB或TOB液體培養基為種子培養基的發酵罐中，24 26°C下，140 160rpm，培養I 2天即制得細腳擬青霉發酵罐種子液； 4)將步驟3)中制得的發酵罐種子液按重量百分比為5% 10%接入滅菌后的固相培養基中，在溫度為23 26°C，濕度為50 90%的條件下，靜置封閉式培養30 35天； 5)采收。
2.如權利要求I所述細腳擬青霉人工培養方法，其特征在于，步驟3)所述固相培養基的組分及各組分的重量份為 大麥30-40 H2O70-60。
3.如權利要求I所述細腳擬青霉人工培養方法，其特征在于，步驟4)接種固體培養基后，靜置固體發酵，增加人工散射光源，并定時通風排氣。
4.如權利要求I所述細腳擬青霉人工培養方法，其特征在于，所述人工散射光源為連續光源，光照強度為100-150LUX。
5.如權利要求1-4任一權利要求所述細腳擬青霉人工培養方法，其特征在于，步驟I)所述菌株為菌種保藏號CGMCC NO. 4176的細腳擬青霉菌株。
6.—種細腳擬青霉人工培養產物，為權利要求1-5任一權利要求所述細腳擬青霉人工培養方法培養后采收獲得。
7.如權利要求6所述細腳擬青霉人工培養產物，其特征在于，所述培養產物為細腳擬青霉的子實體。
8.如權利要求6或7所述細腳擬青霉人工培養產物在制備預防及治療肝臟疾病的藥物或保健品中的應用。
9.如權利要求8所述細腳擬青霉人工培養產物的應用，其特征在于，所述肝臟疾病為化學性肝損傷、病毒性肝炎或肝纖維化。
10.一種預防及治療肝臟疾病的中藥制劑，所述中藥制劑的主要藥效成分為權利要求1-5任一權利要求所述細腳擬青霉人工培養產物或所述細腳擬青霉人工培養產物的有效成分提取物。
11.如權利要求10所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑，其特征在于，所述中藥制劑中還含有重量百分比含量為1-50%的藥物可接受的載體。
12.如權利要求11所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑，其特征在于，所述藥物可接受的載體的重量百分比含量為20% -38%。
13.如權利要求10-12任一權利要求所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑，其特征在于，所述中藥制劑為口服制劑。
14.如權利要求10-13任一權利要求所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑的制備方法，所述制備方法選自如下方法中的任一種 1)粉碎將權利要求1-5任一權利要求所述細腳擬青霉人工培養產物干燥后直接粉碎，過篩制得所述中藥制劑； 2)將權利要求1-5任一權利要求所述細腳擬青霉人工培養產物提取有效成分后干燥獲得所述中藥制劑。
15.如權利要求14所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑的制備方法，其特征在于，在方法2)中，所述細腳擬青霉人工培養產物提取有效成分的方法采用有機溶劑、水或有機溶劑與水的混合液提取。
16.如權利要求15所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑的制備方法，其特征在于，所述有機溶劑選自乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮和石油醚中的一種或多種的混合物。
17.如權利要求15所述預防及治療肝臟疾病的中藥制劑的制備方法，其特征在于，所述有機溶劑和水的混合溶液為乙醇水溶液。
全文摘要
本發明涉及細腳擬青霉人工培養方法及其制藥用途。本發明公開了一種細腳擬青霉人工培養方法，包括下列步驟1)斜面菌種制備；2)搖瓶種子液的制備；3)發酵罐種子液制備；4)接種固相培養基中，靜置封閉式培養30～35天；5)采收。本發明還進一步公開了采用上述培養方法獲得培養產物及其制藥用途。本發明提供的細腳擬青霉培養產物，對于化學性肝損傷、病毒性肝炎、肝纖維化等肝臟疾病的發生及發展具有明顯的治療和預防作用。
文檔編號C12R1/79GK102676397SQ201210066048
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月14日 優先權日2011年3月14日
發明者呂雯婷, 孫長勝, 張程艷, 譚悠久, 陳祝安 申請人:上海泛亞生命科技有限公司