專利名稱：具有改善鑒別能力的y染色體str基因座熒光標記復合擴增試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術領域，一般地涉及在個體中檢測短串聯重復序列基因座(Short Tandem Repeat,簡稱STR)多態性所采用的擴增試劑盒。具體地,本發明涉及一種具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座熒光標記復合擴增試劑盒。
背景技術：
人類基因組DNA中有3X109bp，其中10%是串聯重復序列，稱為衛星DNA。按重復單位的長短又可以分為大衛星、中衛星、小衛星和微衛星，其中重復單位僅由2-7個堿基對組成的叫微衛星，又稱它為短串聯重復序列基因座(Short Tandem Itepeat，簡稱STR)，這種串聯重復形成的DNA序列可以產生數以億計的基因型組合，而每一種組合在群體中出現的頻率都非常低，也就是說，STR基因座具有極高的個體鑒定能力，所以常作為遺傳標記而被用于DNA分析技術中法醫個體識別、親緣關系鑒定，同時也是DNA數據庫建立的主流技術。同時，STR基因座的片段小、容易擴增，適宜于檢驗微量和降解檢材，而且各基因座的擴增條件相似而能夠復合擴增，因而具有靈敏、準確、快速、信息量大等優點。由于這些優點STR基因座的分型研究與篩選已在國內外人類學、醫學遺傳學和法醫學及各相關領域中得到了廣泛的應用。在實踐中，DNA檢驗流程一般包含DNA提取、基因座擴增和電泳分析三大步驟，同時，在基因座擴增時，為觀察擴增反應的情況，通常會對基因座所對應的引物進行熒光標記，這樣就能實現實時跟蹤，對在線反應過程進行監控，并在后續可結合相應的軟件對產物進行分析。人類Y染色體是小的近端著絲粒染色體，它由長臂和微小的短臂兩部分組成。Y染色體，除擬常染色體區外，在減數分裂中不發生交換重組，呈單倍型獨立向下傳遞，表現出父系遺傳特征，同時序列的變異完全由累積的突變所致，并非重組引起。由于Y染色體的這些特點，Y染色體STR基因座(簡稱Y-STR)遺傳標記作為一種工具已經被廣泛應用于法醫鑒定、親權鑒定、失蹤人員鑒定、人類遷移進化研究、歷史和家系進化研究等多個領域。已發現的Y-STR基因座已有400多個，常用來檢測的Y-STR基因座有9個歐洲最小單倍型基因座，包括 DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393 和 2 個美國 DNA 分析方法技術工作組(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,簡稱 SWGDAM)推薦的基因座，包括DYS438、DYS439。在法醫鑒定與親子鑒定領域，DNA分析主要依賴商業化的試劑盒進行。第一個Y-STR試劑盒是由ReliaGene Technologies在2001年研發的Y_PLEX 6，可復合擴增DYS19、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393、DYS385a/b ；2002 年 ReliaGene Technologies又研發了可復合擴增 DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS438、DYS392 的 Y_PLEX 5，到 2003 年9月ReliaGene Technologies推出了整合了 Y_PLEX 6和Y_PLEX 5所有基因座在內的Y-PLEXtmI2。同年10月，Promega公司推出了 PowerPlex Y試劑盒，可復合擴增12個基因座，其中包括 DYS19、DYS385a/b、DYS3891、DYS38911、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439。2004 年秋，Applied Biosystems 公司(簡稱 AB 公司)發布了包含 17 個Y-STR基因座的yfiler 試劑盒，其在PowerPlex Y的基礎上增加了另外5個具有高度多態性的 Y-STR 基因座，即 DYS456、DYS458、DYS635、Y GATAH4、DYS448。Yfiler 試劑盒是目前可復合擴增Y-STR最多的商品化試劑盒。然而，長期的DNA檢驗試驗表明，STR基因座的遺傳多態性在種族間存在一定差異，各個基因座之間的差別也很大。即使是在美國FBI推薦的13個核心基因座中，也有部分基因座遺傳多態性不高，或者在不同人群間的差異較大，由此給DNA檢驗技術的應用及其效率造成一定影響。甚而，應用于法醫學實踐的Y染色體遺傳標記位于Y染色體的非重組區，整個非重組區相當于一個遺傳標記，因此Y染色體遺傳標記的個人識別能力和親權鑒定能力不能像常染色體那樣使用相乘原則。所以，為了達到足夠的排除概率和個人識別概率，就必須不斷的增加新的Y染色體遺傳標記。所以，為了提高個人鑒別能力，Y-STR試劑盒就需在現有基礎上增加多個具有高度遺傳多態性的新的Y染色體遺傳標記。
由此，為了進一步改善市售擴增試劑盒的靈敏性和效率，申請人對男性人群的Y-STR基因座的遺傳多態性進行了深入的研究，并以此為依據開發了一種具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座熒光標記復合擴增試劑盒，此種試劑盒目前未見報道與使用，且目前我國尚無Y-STR熒光標記檢測試劑盒，因此是本領域術人員一直期望解決的問題。

發明內容
解決的技術問題本發明針對以上技術問題，對男性人群的Y-STR基因座的遺傳多態性進行了深入的研究，并提供一種具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座熒光標記復合擴增試劑盒，繼而驗證本發明所提供試劑盒在法醫鑒定及親子鑒定中的應用。技術方案(一 )具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座的確定為實現上述目的，本發明通過對DYS19、DYS381、DYS385a/b、DYS388、DYS3891/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS425、DYS426、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS450、DYS468、DYS522、DYS527a/b、DYS630、DYS635、DYS710和Y-GATA-H4等31個基因座在男性人群中的遺傳多態性調查。最后確定DYS19、DYS385a/b、DYS388、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS522、DYS527a/b、DYS635 和 Y-GATA-H4等24個基因座。其中包括目前國內使用最多的AB公司出品的Yfiler試劑盒可擴增的17個基因座，如下DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b ;這其中已包括 9 個歐洲最小單倍型和2個SWGDAM推薦基因座。在此基礎上，又增加了 7個具有高度多態性的Y-STR基因座，包括 DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447 和 DYS444。這些基因座既與現有試劑盒兼容，保證已有DNA數據的共享與交流，又能夠提高DNA檢驗系統的累計個體識別能力和累積非父排除率，更加符合DNA檢驗的技術要求。( 二)具有改善鑒別能力的Y-STR熒光標記復合擴增試劑盒的確定
基于以上具有改善鑒別能力的Y-STR基因座的確定，本發明還提供一種具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座熒光標記復合擴增試劑盒，包含下列17個Y染色體STR基因座的特異性寡核苷酸擴增弓I物對DYS391、DYS3891/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b ;同時還包含下列7個基因座的特異性寡核苷酸擴增引物對DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一個。進一步地，本發明所提供試劑盒同時包含下列24個Y染色體STR基因座的特異性寡核苷酸擴增引物對DYS391、DY S389I/II、DYS439、DYS438、DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、、Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b、DYS444。參考24個STR基因座的等位基因范圍和Genbank登記號見下表
等
權利要求
1.一種具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座熒光標記復合擴增試劑盒，包含下列17個Y染色體STR基因座的特異性寡核苷酸擴增引物對DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b，其特征在于還包含下列7個基因座的特異性寡核苷酸擴增引物對DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447 和 DYS444 中的至少一個。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其包含下列24種Y染色體STR基因座的特異性寡核苷酸擴增引物對DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b、DYS444。
3.根據權利要求I或2所述的試劑盒，其中每對所述引物具有一定的引物序列，其用于擴增相應STR基因座，對應關系為基因座引物序列(5’-3’) ~CATTCAATCATACACCCATAGATAGGTAGGCAGGCAGA DYS389T/TT CAGAAGAATGTCATAGATAGA ACCTACTTCTGTATCCAACC ATTT AAGTCTTT AATCT ATCTTG CATTTAAGTCTTTAATCTATCTTG TGATT ACC AAAATT AGTGGGGCCAGGGTCTGGAGTTCGA … CTC AAGCCTGTTCT ATGAADYS449CTGGGGCCGGATAATTGCT … ATGGTCTGTTGTGGGACC DYS456 AGAGGGACAGAACTAATGGA … AGACTGAGC AAC AGGAATGADYS458TTACAAGCATGAGCCACCTATGGGCGTGAGTGCAGAGGAAGACCCTGTCATTC T AGC AGC AAAATTC AC AG DYS635TCTCACTTCAAGCACCAA,,o AGAGGC AAGGATCC AA DYS448TTTCCTCATATTTCTGGCGTGGAAATTGTAGTGAGCa ATTCTAGGAAGATTAGCCYCATA H4 TCATCCATCTAATCTATCC' ' AATGTTATGCTGAGGAGA_
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述引物濃度為
5.根據權利要求1、2或4所述的試劑盒，其特征在于所述的各STR基因座采用位于該基因座核心重復區兩側的一對引物擴增，其中每對引物中有一條引物的5’端用熒光染料
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述熒光染料標記的方法為DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438 和 DYS449，采用 FAM 標記；DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448 和 DYS527a/b，采用 HEX 標記；Y-GATA_H4、DYS447、DYS19、DYS392 和 DYS522，采用TAMRA 標記；DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b 和 DYS444，采用 ROX 標記；內標選用橙色突光標記，突光標記物為SIZ。
7.根據權利要求1、2或4所述的試劑盒，其特征在于其中至少2個基因座的復合擴增采用聚合酶鏈式反應，其擴增產物的檢測采用多道或單道毛細管測序基因分析儀來測定。
8.根據權利要求1、2或4所述的試劑盒，其特征為所述基因座采集自基因組DNA樣品，包括人的血液、血痕、精液、唾液、體液、毛發、肌肉或組織器官。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征為所述基因組DNA樣品的處理方法為Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法。
10.根據權利要求1、2、4或6所述的試劑盒在法醫鑒定或親子鑒定中的應用。
全文摘要
本發明提供一種具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座熒光標記復合擴增試劑盒，用其進行DNA基因的檢測不僅能擴增分析市售試劑盒能夠分析的17種STR基因座DYS391、DYS389/、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b，而且能同時擴增分析STR基因座DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一個，提高了系統的累計個體識別力和累積非父排除率，總體上提高個體的鑒別力。
文檔編號C12Q1/68GK102703583SQ201210079459
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者葛斌文, 鄭衛國 申請人:無錫中德美聯生物技術有限公司