專利名稱：簇毛麥6vl染色體上抗稈銹病基因連鎖標記、引物對及用法的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物信息學和植物遺傳育種科學技術領域，具體涉及簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記引物對及其用法。
背景技術：
小麥(Triticum aestivum L.)是全球三大糧食作物之一 ,也是我國總產第一的糧食作物，是保障我國糧食安全的重要決定因素之一。小麥在其生育進程中常會受到生物或非生物脅迫的影響。小麥桿鎊病(Puccinia graminis f. sp. tritici Eriks. &E. Henn.)是一種世界性小麥病害，起源于烏干達的Ug99是一種致毒性極高，在全球范圍內抗源極少的桿銹病生理小種。Ug99及其衍生物已克服了全球小麥生產中廣泛利用的幾個抗桿銹病基因的抗性，導致世界范圍內絕大部分小麥品種對桿銹病缺乏抗性。已有研究表明，小麥二倍體近緣野生種簇毛麥(Dasypyrum vi I losum (L.)Candarge)的大部分種質對桿銹病生理小種Ug99表現較高的抗性,其抗桿銹病基因被定位于簇毛麥6VL上。美國堪薩斯州立大學通過遠緣雜交和染色體工程手段獲得了中抗桿銹病生理小種Ug99的小麥-簇毛麥易位系T6AS. 6VL(見參考文獻Qi LL, Pumphrey MO, FriebeB, Zhang P, Qian C, Bowden RL, Rouse MN, Jin Y, Gill BS. A novel Robertsoniantrans location event leads to transfer of a stem rust resistance gene (Sr52)effective against race Ug99 from Dasypyrum villosum into bread wheat. Theor ApplGenet, 2011，123:159-167)。T6AS. 6VL易位系是在普通小麥遺傳背景中由簇毛麥6V染色體長臂(6VL)替換了普通小麥6A染色體的長臂(6AL)，從而形成6AS. 6VL易位染色體。由于簇毛麥與普通小麥親緣關系較遠，在雜種后代中6VL和6AL間不發生染色體重組，T6AS. 6VL易位染色體始終以易位的形式出現在后代中，因此，由簇毛麥6VL控制的抗桿銹病性狀及其載有的全部DNA序列均以協同傳遞的方式出現在后代中。現有技術中追蹤抗病染色體的細胞學方法主要包括染色體分帶(C-banding)和基因組原位雜交(GISH)，但這些技術成本高、效率低，特別是在小麥育種實踐中對大群體進行輔助選擇工作量巨大。ESTCexpres sed sequence tag,表達序列標簽)是指從植物不同組織來源的cDNA文庫中隨機挑選克隆，對其5’和3’端進行測序獲得的短cDNA序列。基于EST的STS標記(sequence-tagged site, STS),即EST-STS標記，是直接依據已定位于基因組物理圖上的EST序列設計引物，對基因組進行擴增，從中尋找與目的基因連鎖或具有染色體特異性的EST標記。由于EST-STS標記直接來源于表達基因序列，保守性較高，特別有利于界定物種之間的差異(見參考文獻La Rota M, Sorrells ME. 2004. Comparative DNA sequenceanalysis of mapped wheat ESTs reveals the complexity of genome relationshipsbetween wheat and rice. Funct Integr Genomics, 4:34-46)。因此，基于比較基因組學原理，利用普通小麥EST圖譜，可以開發與普通小麥部分同源的簇毛麥特定染色體的特異性分子標記。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記及所用引物對，為小麥-簇毛麥T6AS. 6VL易位系在小麥抗桿銹病育種中的應用提供一種新型、實用的標記輔助選擇方法。本發明解決上述技術問題的技術方案如下一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記引物對，是根據普通小麥bin-Map圖譜第6部分同源群長臂的EST序列BE471191為模板設計得到的，所述弓I物對中的一條弓I物的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. I所示，所述引物對中的另一條引物的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列 SEQ ID NO. 2 所示。 本發明還提供一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記，是采用引物對SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2自簇毛麥DNA中擴增出來的一段358bp的核苷酸序列，所述358bp DNA片段的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. 3所示；所述引物對從簇毛麥DNA中擴增出來的358bp DNA片段位于簇毛麥6VL染色體FLO. 64-1. 00的區段內(圖
2)可特異地追蹤簇毛麥6VL染色體及其攜帶的抗小麥桿銹病基因。所述引物對從普通小麥DNA中擴增出的230bp DNA條帶位于6AL染色體上，可特異地追蹤6AL染色體。本發明還提供一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記引物對的用法，采用上述的引物對對以小麥-簇毛麥T6AS. 6VL抗桿銹病易位系為親本的分離群體進行PCR擴增及其產物檢測，若所述擴增產物出現6VL特異的358bp條帶而不出現6AL特異的230bp條帶，則所述待測植物為含有I對T6AS. 6VL易位染色體的抗桿銹病純合體；若所述擴增產物同時出現358bp和230bp條帶，則所述待測植物為含有單個T6AS. 6VL易位染色體的抗桿銹病雜合體；若所述PCR擴增產物中僅擴增出230bp條帶，則所述待測植物不含T6AS. 6VL易位染色體，相應喪失對桿銹病的抗性。所述PCR擴增的反應體系10uL (微升)反應體系中含約10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmo IL-1MgCl2JOOmmol ΓΜΝΤΡ，左右引物終濃度各為O. 2umol Λθ·5υTaq DNA聚合酶；所述PCR擴增的反應程序94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32個循環；72°C延伸10分鐘；所述PCR擴增的產物檢測PCR擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。本發明的有益效果是本發明標記6VL-358在鑒定簇毛麥6V染色體長臂時特異性強，拓寬了小麥EST的使用范圍。根據普通小麥已定位的EST序列開發的EST-STS標記，由于標記序列來自表達基因，在物種內部具有很高的保守性，在物種間也有較高的同源性，特別有利于鑒別物種間DNA序列的微小差異，本發明標記6VL-358即可顯著區分普通小麥與簇毛麥間的DNA差異，無論雜交組合涉及何種親本，只要后代中出現358bp條帶，就可以確定材料中具有簇毛麥6VL染色體。本發明標記6VL-358與6VL上抗小麥桿銹病基因完全連鎖，因此利用本發明標記引物對追蹤以T6AS. 6VL易位系為親本的抗小麥桿銹病性狀時，凡是能擴增出358bp條帶的材料，都對桿銹病表現抗病；凡是不能擴增出358bp條帶的材料，則丟失由6VL染色體控制的桿銹病抗性。本發明的標記為共顯性標記，可同時擴增簇毛麥6VL特異的358bp條帶和小麥6AL特異的230bp條帶，對于在育種早代(如F2代)篩選出純合抗桿銹病基因型特別有效凡是擴增出358bp條帶而不具230bp條帶的單株即為抗桿銹病純合單株，它具有一對純合的T6AS. 6VL易位染色體。本發明的標記引物對對PCR條件的要求較為寬泛，容易為育種實踐利用標記引物與模板的結合能力強，具有較寬泛的退火溫度，其最佳設計退火溫度為60°C，但在52 62°C的較大范圍內均有較好的擴增效果。同時，由于目標條帶較短，只有358bp，在PCR反應時，在同等時間內可運行較多的循環數，有利于提高標記輔助選擇的效率。本發明標記的輔助選擇方法與染色體分帶(C-banding) 、基因組原位雜交(GISH)等細胞學篩選方法相比，本發明成本低、效率高，容易在小麥育種實踐中實現在大群體中進行標記輔助選擇。


圖I為以不同待測植物DNA模板為底物用本發明中的6VL-358標記引物進行擴增得到的產物電泳結果圖。其中M =MarkerU :普通小麥中國春(AABBDD)、2 簇毛麥(VV)、3 :硬簇麥(AABBVV),4 :普通小麥-簇毛麥6V (6A)代換系、5 :普通小麥-簇毛麥T6AL. 6VS易位系、6 6VL缺失系(DSdel6VL，斷裂位點FL. 64),7 13 :普通小麥分別添加I對簇毛麥1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V染色體的添加系DNA模板。圖2為本發明6VL-358標記在簇毛麥6V染色體上的物理定位模式圖。圖3為本發明所擴增得到的簇毛麥6VL染色體上與抗小麥桿銹病基因連鎖的DNA片段，圖中下劃線分別表示正反引物序列。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下列實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用到的試驗試劑，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。實施例I1、EST序列的獲得根據美國農部網站http://wheat. pw. usda. gov的信息,搜索定位于普通小麥第6部分同源群長臂的EST序列。2、引物的設計與合成將步驟I搜索的EST序列,利用Primer Premier5. O軟件進行引物的設計，引物由上海聯合基因有限公司合成。3、簇毛麥6VL染色體特異性標記的篩選I)種質材料普通小麥中國春(AABBDD)、簇毛麥(Dasypyrum villosum, W)、硬簇麥(T. durum-H. villosa amphiploid, AABBVV)、小麥-簇毛麥6V(6A)二體代換系DS6V(6A)、小麥-簇毛麥易位系T6VS. 6AL、6VL缺失系DSdel6VS (斷裂位點FL0. 64)、小麥-簇毛麥IV 二體添加系(DA1V)、小麥-簇毛麥2V 二體添加系(DA2V)、小麥-簇毛麥3V 二體添加系(DA3V)、小麥-簇毛麥4V 二體添加系(DA4V)、小麥簇毛麥5V 二體添加系(DA5V)、小麥-簇毛麥6V 二體添加系(DA6V)、小麥-簇毛麥7V 二體添加系(DA7V)。上述種質材料均為公知公用種質材料，由南京農業大學提供。2)利用步驟2設計合成的EST-STS引物，對上述種質材料DNA進行多態性擴增分析。PCR試劑組成10uL反應體系中含約10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmolL-1MgCl2^OOmmol Γ1 dNTP，左右引物終濃度各為 O. 2umol L_1,0. 5U Taq DNA 聚合酶。PCR程序為94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32個循環；72°C延伸10分鐘；4°C保存。PCR產物檢測PCR擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。3)篩選出的6VL特異性分子標記6VL-358對簇毛麥 6VL染色體表現特異性，具體如圖I各條帶所示簇毛麥、硬簇麥、DS6V(6A)、DA6V等具有完整6VL染色體的材料均能擴增出358bp的條帶，其它不具完整6VL染色體的材料均沒有該條帶，說明標記6VL-358確為簇毛麥6VL染色體特異性標記。由于該標記在6VL缺失系DSdel6VL (斷裂位點FL. 64)中缺失，進而將6VL-358定位到簇毛麥6VLFL. 64的遠側端區域，如圖2所示。實施例2簇毛麥6VL染色體特異性標記在標記輔助選擇育種中的應用待測材料為中國春(公知公用)與抗桿銹病T6AS. 6VL易位系(公知公用)雜交組合的分尚群體。用實施例I中所述的引物對對上述待測材料DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增的反應體系10uL反應體系中含約10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmoI T1MgC 12,200mmol Γ1 dNTP，左右引物終濃度各為 O. 2 μ mo I Λθ·5υ Taq DNA 聚合酶;PCR擴增的反應程序94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32個循環；72°C延伸10分鐘。PCR擴增的產物檢測PCR擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。對組合“中國春/T6AS. 6VL易位系”的F2群體111個單株的的分子標記檢測顯示，22株含有I對純合T6AS. 6VL易位染色體的單株都能擴增出358bp條帶但不具有230bp條帶，表現為6VL-358標記陽性，為小麥桿銹病抗病純合體；43株僅含有I條T6AS. 6VL易位的單株可同時擴增出358bp和230bp條帶，為抗病雜合體；46株不含T6AS. 6VL易位的單株不能擴增出358bp條帶，表現為6VL-358標記陰性，對小麥桿銹病表現感病。
權利要求
1.一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記的引物對，其特征在于，所述引物對中的一條引物的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. I所示，所述引物對中的另一條引物的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. 2所示。
2.一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記，其特征在于，是采用引物對SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2自簇毛麥DNA中擴增出來的一段358bp的核苷酸序列，所述358bpDNA片段的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. 3所示。
3.根據權利要求2所述一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記，其特征在于，所述引物對擴增出的標記為共顯性標記，既可擴增出簇毛麥6VL染色體特異的的358bp條帶，也可擴增出普通小麥6AL染色體特異的230bp條帶，用于區分抗病單株為純合還是雜八口 ο
4.一種簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記引物對的用法，其特征在于，采用權力要求I至3任一項所述的引物對對以小麥-簇毛麥T6AS. 6VL抗桿銹病易位系為親本的分離群體進行PCR擴增及其產物檢測，若所述擴增產物出現6VL特異的358bp條帶而不出現6AL特異的230bp條帶，則所述待測植物為含有I對T6AS. 6VL易位染色體的抗桿銹病純合體；若所述擴增產物同時出現358bp和230bp條帶，則所述待測植物為含有單個T6AS. 6VL易位染色體的抗桿銹病雜合體；若所述PCR擴增產物中僅擴增出230bp條帶，則所述待測植物不含T6AS. 6VL易位染色體，相應喪失對桿銹病的抗性。
5.根據權利要求4所述的簇毛麥6VL染色體上抗桿銹病基因連鎖標記的用法，其特征在于 所述PCR擴增的反應體系IOuL反應體系中含約10 20ng模板DNA，IXPCR buffer,I.5mmol L-1MgCl2JQQmmol ΓΜΝΤΡ，左右引物終濃度各為 O. 2umol L_1,0. 5U Taq DNA 聚合酶； 所述PCR擴增的反應程序94 V預變性3分鐘；94 V變性30秒，60 V退火30秒，72 °C延伸45秒，32個循環；72°C延伸10分鐘； 所述PCR擴增的產物檢測PCR擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染色。
全文摘要
本發明公開了簇毛麥6V染色體長臂(6VL)特異性標記6VL-358的引物對序列及其用法，可用于小麥遺傳背景中6VL染色體的追蹤及其控制的抗小麥稈銹病性狀的標記輔助選擇。所述引物對中的一條引物的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.1所示，所述引物對中的另一條引物的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.2所示。利用所述引物對對小麥-簇毛麥T6AS.6VL抗稈銹病易位系為親本的分離群體進行PCR檢測時，若擴增產物中含有358bp條帶，則所述待測植物對稈銹病表現抗病；若擴增產物中不含358bp條帶，則所述待測植物喪失由6VL染色體控制的稈銹病抗性。本發明標記為共顯性標記，特別有利于在育種早代篩選出抗稈銹病純合體。
文檔編號C12Q1/68GK102816760SQ20121026831
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者別同德, 王春梅, 張勇, 張曉祥, 高德榮, 李海鳳, 呂國鋒 申請人:江蘇里下河地區農業科學研究所