專利名稱：一種中國白酒中耐酸、耐乙醇的產揮發酸的酵母及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中國白酒中耐酸、耐乙醇的產揮發酸的酵母，以及耐酸、乙醇性能的產揮發酸酵母在酒類及食品釀造工業中的應用。
背景技術：
酸類成份是中國白酒的重要口味物質，起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用。白酒中的揮發酸，其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸等酸對白酒的風味貢獻尤其顯著。它們與其它香味物質共同組成內酒所特有的口味，同時也是生成酯類物質的前體物質。 適量的酸有助于增強白酒的口感和后味，可使酒體豐滿、醇厚，回味悠長。揮發酸含量的多少，對酒的等級、香型等具有重要的影響。酸在白酒中的生成途徑，主要來自發酵產生揮發酸的微生物，它們利用糖類等原始物質，通過較復雜的生化反應完成酸類物質的生成與轉化。目前對白酒釀造過程中的生酸細菌研究較多，包括己酸菌、丁酸菌等，但這些細菌在白酒生產中只能提供有限的幾種酸類物質。但是白酒中還存在其它一些重要的酸類物質，如異丁酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等。 目前，在中國白酒釀造工業中對于這些重要的揮發酸的形成及產生微生物并不清晰。因此尋找合成這些酸類物質的微生物，以及將這些微生物應用于白酒釀造中以提高酸類物質的含量具有重要的意義。目前，國外對葡萄酒、啤酒已有一定的研究，發現酵母對酒的風味貢獻較大，尤其在揮發酸類物質產生方面作用較大，但是對于中國白酒釀造過程中的產揮發酸酵母的篩選及其應用相關的研究幾乎沒有。因此尋找中國特色白酒釀造過程中特定的產酸酵母，不但能夠認識白酒中重要酸類物質的產生來源，而且將這些功能產揮發酸酵母應用于白酒釀造工藝中能夠有效提高白酒中酸類呈味物質的含量，對于中國特色白酒的理論發展及白酒釀造工業技術水平的提升都具有極其重要的作用。本發明所篩選獲得的酵母是從中國白酒釀造大曲、酒醅、釀造原料或釀造環境中篩選所得，具有耐酸、耐乙醇的性能，產揮發酸能力強，是優良的釀酒用功能菌株。菌株能夠有效應用于中國白酒的釀造過程中，有效調控白酒酸度、優化釀造酒生產工藝，降低釀造酒生廣成本，提聞白酒品質。

發明內容
( I)要解決的技術問題
本發明要解決的一個技術問題是提供耐酸、耐乙醇的產揮發酸酵母菌株。本發明所要解決的另一個技術問題是提供了一種產揮發酸酵母在中國白酒釀造工業中的應用。(2)技術方案
一種中國白酒中耐酸、耐乙醇的產揮發酸的酵母，其分類命名為東方伊薩酵母 (Jssatchenkia or !entails'),該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No. 4741。所述的東方伊薩酵母CGMCC No. 4741，其耐酸范圍為pH2. O 5.0 ;耐乙醇范圍為0 15%。所述的東方伊薩酵母CGMCC No. 4741，其產酸為乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸揮發性酸，產總揮發酸濃度為400 600mg/L。該產揮發酸酵母的篩選
取O. 5 5g大曲曲樣、酒醅或釀造原料溶于15 150mL無菌生理鹽水搖床振蕩30 150分鐘，再稀釋，涂布產酸初篩培養基，挑選周圍變黃明顯的菌落及產酸顯著菌株，再將菌株分別轉接于酸性和含乙醇的培養基，搖瓶培養進行復篩，挑選酵母，搖瓶發酵培養，經 HS-SPME-GC-MS測定產酸種類及含量，篩選獲得產酸能力強的菌株。產揮發酸初篩培養條件為產酸培養基(g/L):酵母粉2. O、蛋白胨2. O、葡萄糖 40. O、磷酸二氫鉀O. 25、氯化鉀O. 4、氯化鈣O. I、硫酸鎂O. I、氯化鐵O. 002、硫酸錳O. 002、 溴甲酚綠O. 05、瓊脂20. 0，用去離子水配制，調pH5. 0，30°C培養2 5天，根據菌落周圍變色圈判斷產酸性能。搖瓶發酵培養條件為高粱汁、麥芽汁或YPD發酵培養基，高粱汁或麥芽汁培養基制作方式為20 200g高粱或麥芽樣品經粉碎后，加I 4倍體積的水，蒸煮l_5h，呈糊狀，冷卻后加入糖化酶10 50單位/g樣品，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，糖度為1(Γ 5°Βχ，pH為3 5，25 35°C，150rpm,搖瓶培養24 120h。產揮發酸種類及濃度測定采用HS-SPME-GC-MS方法測定，15 mL頂空瓶中加入 5 10 mL澄清發酵液，I 5 g NaCl，以4-甲基-2-戊醇為內標，進行頂空固相微萃取。 頂空固相微萃取的條件為三相(Car/DVB/PDMS)萃取頭，60 °C預熱5 10 min，萃取吸附 30 50 min, GC 解吸 5 10 min。菌株的耐酸、乙醇性能高粱汁液體培養基中，30°C，靜止培養48h。利用酶標儀在 600nm處測定菌濃度，利用無菌水調節OD6citlnm=L O。取50 μ L菌液(OD6tltlnm=L O)于pH I 7、乙醇O 20%梯度YPD培養基中，30°C培養24小時，然后利用酶標儀在600nm處測定菌濃。東方伊薩酵母CGMCC No. 4741在各種釀造酒、蒸餾酒、配制酒的釀造工業和食品工業中的應用。將用東方伊薩酵母CGMCC No. 4741制成液體或固體等一切形式的微生物菌劑，添加于各類酒及食品釀造過程中進行應用，能夠有效增加其在釀造酒中的生物量，并有效協調釀造酒中的酸種類及濃度，最終提高產品的品質。(3)有益效果
本發明所篩選獲得的酵母是從中國白酒釀造大曲或釀造酒醅中篩選所得，具有耐酸、 耐乙醇的性能，產揮發酸能力強，是優良的釀酒功能菌株。菌株能夠有效應用于中國白酒的釀造過程中，有效調控白酒酸度、優化釀造酒生產工藝，降低釀造酒生產成本，提高白酒品質。生物材料樣品保藏一種中國白酒中耐酸、耐乙醇的產揮發酸的酵母，其分類命名為東方伊薩酵母該菌株已保藏于北京中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，其保藏編號為 CGMCC No. 4741，保藏日期2011年4月6日。


圖I :東方伊薩酵母orientalis)CGMCC No. 4741 細胞形態電鏡照片。
具體實施例方式實施例I :
產揮發酸酵母的篩選取O. 5g酒醅溶于20mL無菌生理鹽水搖床振蕩30分鐘，再稀釋， 涂布產揮發酸初篩培養基，挑選周圍變黃明顯的菌落即為產酸顯著菌株，再將菌株分別轉接于產酸培養基搖瓶培養，經HS-SPME-GC-MS測定產揮發酸種類及含量，篩選獲得產揮發 Ife能力強的囷株。產酸初篩培養條件為產酸培養基(g/L):酵母粉2. O、蛋白胨2. O、葡萄糖40. O、磷酸二氫鉀O. 25、氯化鉀O. 4、氯化鈣O. I、硫酸鎂O. I、氯化鐵O. 002、硫酸錳O. 002、溴甲酚綠
O.05、瓊脂20. 0，用去離子水配制，調pH5. 0，30°C培養2 5天，根據菌落周圍變色圈判斷
產酸性能。搖瓶發酵培養條件為麥芽汁培養基，制作方式為20g麥芽樣品經粉碎后，加4倍體積的水，蒸煮5h，呈糊狀，冷卻后加入50單位/g的糖化酶，于40°C保持2h，過濾、離心所得濾液，糖度為l(Tl5°Bx, pH為5，28°C，150rpm,搖瓶培養48h。實施例2
產揮發酸酵母及其分子生物學鑒定對獲得的不同的產揮發酸酵母進行分子生物學鑒定，利用酵母特異分類鑒定引物分別擴增菌株的26srDNA片段，經凝膠電泳檢測。隨后進行測序比對，確定所篩得酵母的種屬。將菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，酵母種屬及保藏編號東方伊薩酵母ori en tali s ) CGMCC No.4741。實施例3
菌株的耐酸性能實驗取一環酵母接種于裝有3mL高粱汁液體培養基中，30°C，靜止培養48h。利用酶標儀在600nm處測定菌濃度，利用無菌水調節OD6tltol=L O。取50 μ L菌液 (OD600nm=L O)于pH梯度YPD培養基中，30°C培養24小時，然后利用酶標儀在600nm處測定菌濃，菌株生長情況如表I所示。表I菌株耐酸性能(OD600值)
權利要求
1.一種中國白酒中耐酸、耐乙醇的產揮發酸的酵母，其分類命名為東方伊薩酵母 (Jssatchenkia orientalis \該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No. 4741。
2.如權利要求I所述的東方伊薩酵母CGMCCNo. 4741，其特征在于，耐酸范圍為 pH2. O 5. O ;耐乙醇范圍為0 15%。
3.如權利要求I所述的東方伊薩酵母CGMCCNo. 4741，其特征在于，產酸為乙酸、丙酸、 丁酸、異丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸揮發性酸，產總揮發酸濃度為400 600mg/L。
4.權利要求I所述的東方伊薩酵母CGMCCNo. 4741的培養方法，其特征在于搖瓶發酵培養條件為高粱汁、麥芽汁或YPD發酵培養基，高粱汁或麥芽汁培養基制作方式為20 200g高粱或麥芽樣品經粉碎后，加I 4倍體積的水，蒸煮l_5h，呈糊狀，冷卻后加入糖化酶10 50單位/g樣品，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，糖度為1(Γ 5°Βχ， pH 為 3 5，25 35°C，150rpm,搖瓶培養 24 120h。
5.權利要求I所述的東方伊薩酵母CGMCCNo. 4741的應用，其特征在于在各種釀造酒、 蒸餾酒、配制酒的釀造工業和食品工業中的應用。
6.如權利要求5所述的的應用，其特征在于用東方伊薩酵母CGMCCNo. 4741制成液體或固體的微生物菌劑，添加于各類酒及食品釀造過程中進行應用。
全文摘要
一種中國白酒中耐酸、耐乙醇的產揮發酸的酵母及其應用，屬于生物工程技術領域。所述菌株為東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)CGMCCNo.4741。菌株是從中國貴州名酒廠的釀造過程中分離得到，其篩選方法是取曲樣、酒醅、釀造原料或釀造環境物質，經過稀釋涂布產酸初篩培養基，挑選產酸顯著的菌落，搖瓶培養進行復篩。菌株經搖瓶發酵培養，經HS-SPME-GC-MS測定產揮發酸種類及含量，篩選獲得產揮發酸能力強的菌株。該菌株可應用于各種釀造酒、蒸餾酒、配制酒的釀造工業和食品工業中。
文檔編號C12G3/02GK102604845SQ20121007968
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者吳群, 徐巖 申請人:江南大學