專利名稱：Pig3基因或蛋白表達量檢測試劑在制備診斷唐氏綜合癥的試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及PIG3基因或蛋白表達量檢測試劑在制備診斷唐氏綜合癥的試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
唐氏綜合癥(Down’ s syndrome, DS)是人類最常見的ー種染色體病，由于在配子 (生殖細胞)形成期或合子期(約在受精后24小時內(nèi))細胞內(nèi)多了一條21號染色體所致。 患者有嚴重的智力障礙，生活難以自理，且多合并多系統(tǒng)的疾病，給家庭與社會帶來了沉重的負擔(dān)。因此自上世紀60年代起，人們即致力于唐氏綜合癥的產(chǎn)前篩查。產(chǎn)前檢查可以作入侵性診斷，入侵性診斷通常有以下幾種
I.羊水細胞制備染色體
羊膜穿刺抽出羊水細胞，培養(yǎng)9-12天后，進行染色體核型分析。常規(guī)羊膜腔穿刺木通常在孕16-20周進行，此期間羊水量已達200-400ml，胎兒漂浮羊膜腔內(nèi)，穿刺危險小，且羊水中有活力的細胞比例最高，易成功。羊水細胞診斷染色異常疾病的可靠性超過99%，但是侵入性檢查對胎兒可造成一定的損害，如導(dǎo)致醫(yī)源性流產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計進行羊膜腔穿刺檢查流產(chǎn)率約為0. 3%(0. 1%-0. 4%)，再加上羊水細胞需培養(yǎng)2至3周，確診后孕婦只能行引產(chǎn)術(shù)、承受很大痛苦。2.絨毛細胞制備染色體
1983年，Simon用直接法成功地進行了絨毛組織的染色體核型分析，并用于I例DS的產(chǎn)前診斷。絨毛組織檢查提供了 I個孕早期產(chǎn)前診斷方法。孕9-11周時，在超聲監(jiān)測下從胎盤邊緣取少量絨毛組織進行培養(yǎng)，并作染色體核型分析。絨毛活檢比妊娠中期羊膜穿刺更易引起流產(chǎn)，據(jù)統(tǒng)計進行絨毛取樣檢查流產(chǎn)率約為0. 6%。同時，還應(yīng)注意避免母體細胞及其他細胞污染。3.胎兒血細胞培養(yǎng)制備染色體
該方法經(jīng)腹穿刺胎兒臍血，培養(yǎng)48-72小時后制片，此法能校正羊水細胞。絨毛細胞培養(yǎng)出現(xiàn)的假嵌合體，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。此法自然流產(chǎn)發(fā)生率0. 5%-1. 5%，反復(fù)的臍帶穿刺，可導(dǎo)致穿刺點出血，造成胎兒急性貧血，嚴重者可致胎兒及新生兒死亡。以上方法都是通過把一支細針頭穿過孕婦的肚皮，進入子宮，然后抽取妊娠的細胞進行檢驗。由于需要把儀器放進母親體內(nèi)，所以這兩種檢查稱為入侵性檢查。以上三種入侵檢測方法會引起0. 3%-1. 5%的流產(chǎn)機會。但是，由于這兩種檢查抽取的胎盤絨毛組織和胎水的細胞成分和胎兒的一祥，檢驗細胞樣本的染色體便可準(zhǔn)確驗出胎兒是否患上唐氏綜合癥，準(zhǔn)確度達到99%。經(jīng)典的細胞遺傳學(xué)方法是診斷唐氏綜合癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法有實驗周期長、費力、羊水細胞培養(yǎng)成功與否多種因素的影響等缺點，這說明僅靠常規(guī)的細胞遺傳學(xué)方法進行唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查是不夠的。
由于入侵性的絨毛抽吸和羊膜穿刺術(shù)等篩查手段可能導(dǎo)致流產(chǎn)，所以較安全的方法是進行非入侵性篩查試驗，以評估胎兒患上唐氏綜合癥的幾率，篩查結(jié)果顯示懷有唐氏綜合癥胎兒幾率較高的孕婦才需要接受入侵性的診斷，經(jīng)過篩查，只有約5%的孕婦需要作入侵性診斷，但非入侵性篩查準(zhǔn)確度不及上述入侵性的診斷高。非入侵性篩查試驗有三種方法超聲唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查法、孕婦血清篩查和將二者結(jié)合起來進行產(chǎn)前篩查。I.超聲唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查法
超聲進行唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查是ー種非侵入性的檢查方法，既能有效降低出生缺陷， 又可以極大地減少由于侵入性檢查所造成地正常胎兒地流產(chǎn)。超聲唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查方法是通過超聲測量10-13周孕胎兒的頭臀長(Crown Rump Length, CRL),確定“超聲孕周”后，再測量胎兒的頸部半透明層厚度((Nichol Translucency, NT), NT大于等于2. 5mm為篩查陽性病例((NT閾值((Cut-of)值為2. 5)。 對篩查陽性的病例建議羊水穿刺，再經(jīng)細胞遺傳學(xué)證實，進而研究各地區(qū)或民族的胎兒NT 與CRL以及孕周的關(guān)系。目前該篩查方法主要運用于妊娠10-13周產(chǎn)前篩查，即妊娠早期唐氏綜合癥風(fēng)險篩查中。2.孕婦血清篩查
孕婦血清篩查是通過抽取母親的血液樣本，檢驗其中一項或幾項指標(biāo)的含量，和相同懷孕天數(shù)正常孕婦血清中的同種標(biāo)記物含量相比較，通過計算機軟件計算胎兒患唐氏綜合癥的風(fēng)險值。目前，測定孕婦血清標(biāo)志物含量方法有以下幾種
2.I磁性分離酶聯(lián)免疫測定法
該方法為夾心法酶鏈免疫分析系統(tǒng)與分離技術(shù)相結(jié)合的一種測定方法，并使用兩種高親合力單克隆抗體，標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)液、質(zhì)控液中的血清篩查標(biāo)志物和與該標(biāo)志物單克隆抗體起作用。酶聯(lián)單克隆抗體和熒光素標(biāo)單克隆抗體分別與篩查標(biāo)志物分子不同的部位結(jié)合，形成“三明治”機構(gòu)。加入過量與磁性微粒偶聯(lián)的抗熒光素抗體后，它快速、特異地與熒光素標(biāo)單克隆抗體形成復(fù)合物，不需離心，在磁場中沉淀，倒去上清液，清洗后加入基質(zhì)液孵育。 加入終止液結(jié)束酶/基質(zhì)反應(yīng)。用光度計測量所形成的顔色的強度。酶反應(yīng)所生成的顔色強度，在測定工作范圍內(nèi)與患者標(biāo)本中的標(biāo)志物的濃度成正比。這樣，患者標(biāo)本、質(zhì)控液中的標(biāo)志物濃度可用內(nèi)插法直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。2. 2膠體金免疫層析法的唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查定量測試系統(tǒng)
膠體金免疫層析法(gold immunochromatographic assay簡稱GICA)是上世紀90年代初發(fā)展起來的快速免疫分析技術(shù)，它應(yīng)用抗原、抗體特異性規(guī)律及膠體金顯色原理工作。 用金免疫層析法之稱得測試試條稱為金免疫層析條，簡稱金標(biāo)試條。當(dāng)待測血清滴入試條時，試液通過吸水前衛(wèi)的毛細作用，將膠體金一起帶到抗體的測試線上，若試液中的抗原與抗體相對應(yīng)，則產(chǎn)生特異性結(jié)合，膠體金呈紅色或紫紅色， 稱為陽性；反之不顯色，稱陰性。配合金標(biāo)試條讀數(shù)儀，定量測量孕婦血清樣本指標(biāo)含量，結(jié)合相應(yīng)的篩查軟件，利用計算機分析唐氏綜合癥的風(fēng)險值。該方法還可以用于尿液中相關(guān)指標(biāo)的含量測定。2. 3放射免疫法該方法的特異性和靈敏度作為定量測定的可靠方法已為大家公認，然而用于檢測的試劑的穩(wěn)定性和有效期短的問題，而且這種方法對設(shè)備的要求特殊，使它在一般試驗室開展受到了限制。3.超聲篩查和孕婦血清篩查相結(jié)合
據(jù)資料統(tǒng)計，頸皮厚度試驗?zāi)軌虮O(jiān)測出大約69%唐氏綜合癥胎兒；懷孕15-20周進行的孕婦血清篩查能夠檢測出約70%的患病胎兒；綜合頸皮厚度和對懷孕15至20周的孕婦血清篩查能夠監(jiān)測出大約86%的患病胎兒。4.無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷唐氏綜合癥
近年來發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在少量胎兒細胞，國外己從孕婦靜脈外周血中分離到少量胎兒細胞，對孕婦及胎兒均未造成任何不良影響，并成功地對ー些主要的遺傳性疾病，如各型地中海貧血、Duchenne's肌營養(yǎng)不良癥、囊性纖維化癥、苯丙酮尿癥、血友病等進行產(chǎn)前基因檢測，因?qū)儆讴`種無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查而日益受到重視和深入研究。國內(nèi)少數(shù)単位也開始嘗試此種方法，但均因胎兒細胞在孕婦外周血中的含量極少，估計胎兒有核紅細胞數(shù)量僅為母血細胞的1/105-1/109，而明顯阻礙了產(chǎn)前基因診斷的開展。為此，可以通過優(yōu)化孕婦外周血胎兒細胞的分離方法，簡化胎兒細胞的鑒定步驟，以提高胎兒細胞的富集率，并嘗試對21三體綜合征進行無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷。目前該方法的檢出精度，還沒有資料有統(tǒng)計， 正在研究和探索中。血清學(xué)篩查中最關(guān)鍵的是標(biāo)記物的確定。目前唐氏綜合癥篩查常用以下標(biāo)記物。AFP是胎兒血清中最早產(chǎn)生的球蛋白。在妊娠早期，它產(chǎn)生于卵黃囊；妊娠后期， 大量產(chǎn)生于胎兒肝臟，后進入胎兒血漿，在排尿過程中進入羊水，進而通過胎盤屏障轉(zhuǎn)移進入母親的血液循環(huán)。在妊娠前六個月，母體AFP水平持續(xù)升高，30周左右達到ー個平臺。在孕婦懷有唐氏綜合征胎兒吋，母體血清AFP水平比正常妊娠低23%左右。hCG是由胎盤細胞合成的，由a-和0 -兩個亞單位構(gòu)成，主要以完整的hCG和単獨的￠-鏈兩種形式存在。大約1%的￠-亞基以游離形式存在。文獻報道，應(yīng)用游離 ^ -hCG較hCG可以顯著提高DS產(chǎn)前篩查的檢出率。hCG在妊娠前8周迅速增高，然后在 18-20周時下降到穩(wěn)定水平。當(dāng)胎兒為DS時，母體血清P - hCG主要表現(xiàn)為升高異常(一般 >2. 5M0M )。UE3是經(jīng)胎兒腎上腺和肝臟，最后由胎盤合成的ー種留體類激素，它以游離形式直接由胎盤分泌進入母體循環(huán)，在母體肝臟內(nèi)很快地以硫酸鹽和葡萄糖苷酸雌三醇的形式代謝，其在母體血清中的水平隨著孕周的增長而増加。1988年Canick等人最先報道受DS影響的孕婦血清uE3明顯降低，提出在孕中期測定uE3水平是ー項有效的指標(biāo)。患有唐氏綜合征的母體血清uE3的水平比正常妊娠水平平均低29%。妊漏相關(guān)血衆(zhòng)蛋白A (pregnancy-associated plasma protein A, PAPP-A)是由胎盤滋養(yǎng)層合成的蛋白，并釋放到母血中。PAPP-A的功能目前還不清楚。早孕期母血中 PAPP-A水平快速升高，但是在DS綜合癥和18染色體三體患者母血中明顯降低(約0. 44 MOM )。抑制素是ー個異ニ聚體的糖蛋白。P -亞單位與ー個P A-亞單位組成抑制素-A， 與eB-亞單位組成抑制素-B。血液中以無生物活性的游離亞單位存在。妊娠時母體血清中的大量抑制素被認為來源于胎盤的合體滋養(yǎng)層。抑制素-A在孕10-12周時增加并達到高峰，在妊娠中期下降成ー個平臺，但到妊娠晚期時再一次升高，足月時達最高水平。抑制素-A和hCG —祥在胎兒唐氏綜合征時升高。Isozaki等人1997年發(fā)現(xiàn)尿促性腺激素P核心片斷可能成為DS妊娠的另ー種標(biāo)記物；這種多膚被發(fā)現(xiàn)在母體尿中的水平很高，但在DS妊娠時水平更高。Laigaard等人2003年研究發(fā)現(xiàn)解整合素樣金屬蛋白酶-12 (A disintegrin and metalIoprotease, DSAM-12)也是ー種有潛力的早孕期篩查因子。早孕期篩查有利于早期診斷，如果需要可以較早終止妊娠。1998年Wald等人研究發(fā)現(xiàn)，用P-hCG，PAPP-A組合，在早孕期(10-14周)DS的陽性檢出率可達62%。若在此基礎(chǔ)上增加胎兒頸部半透明度的檢測，結(jié)果陽性檢出率増加到80%。DSAM-12、人胎盤催乳素 (hPL)均為近期報道的在早孕期有用的唐氏綜合征篩查指標(biāo)。但是尚需要更多的研究來證實這兩種標(biāo)志物的作用。中孕期篩查國際上常用的方法是檢測母親血中的P -HCG和AFP(ニ聯(lián)篩查)，Jou 等人曾在亞洲人群中，采用中孕期ニ聯(lián)篩查結(jié)合孕齡及母親的其他因素，應(yīng)用計算機綜合分析發(fā)生DS的危險機率，篩查出62. 5%的DS患兒。將AFP、HCG和uE三項指標(biāo)合起來進行三聯(lián)篩查，檢出率可達到60%-70%(假陽性率為5%)。近年，抑制素-A加盟唐氏綜合征產(chǎn)前篩查后(四聯(lián)篩查)使檢出率提高到70-80%左右，而假陽性率不增加。Wald等人進ー步探討將早孕期和中孕期標(biāo)志物綜合在一起得到一個單ー的風(fēng)險估計值的可能性。在早孕期測量NT及檢測母體血清的PAPP-A，在中孕期進行四聯(lián)檢驗，將所有標(biāo)志物綜合進行風(fēng)險評估，檢出率可達到93%(假陽性率為5%)。DS的發(fā)生是一個復(fù)雜的病理生理過程，是細胞內(nèi)多個基因結(jié)構(gòu)和功能異常改變的結(jié)果，受許多基因和信號通路調(diào)控，單純從某單一因素進行分析無法了解整個疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，必須在基因水平進行整體的、網(wǎng)絡(luò)化的研究，才能全面了解發(fā)病的機制。而傳統(tǒng)的研究方法(例如，Northern-blot和RT-PCR) —次只能研究ー個或幾個基因的改變，掲示的只是病理生理中的過程ー個或幾個方面，不能滿足需要。而通過各種高通量的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，例如蛋白質(zhì)組、基因芯片等，篩選可用于DS早期診斷的蛋白質(zhì)或基因標(biāo)志物，可大大有利于DS的早期干預(yù)，控制DS的進展。由于21世紀人類基因組計劃和隨后的蛋白質(zhì)組計劃相繼啟動，基因序列數(shù)據(jù)及蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)正以前所未有的速度迅速增長，傳統(tǒng)方法己很難適應(yīng)對如此龐大數(shù)據(jù)的研究，因此生物芯片技術(shù)應(yīng)運而生。真正實現(xiàn)基因分析的大規(guī)模、平行、小型和自動化。目前研究最成功的且形成一定商業(yè)市場的是狹義的生物芯片，也稱為DNA芯片、DNA陣列、微陣列等(DNA chip, DNA Microarray, Gene chip等)。基因芯片是用娃、玻璃、聚丙烯等材料作承載基片，在大小Icm2左右的芯片上將成千上萬個不同的基因片段經(jīng)光刻、化學(xué)合成點樣等技術(shù)微加工而成。按其性能和用途分為毛細管型和基因探針型兩類。醫(yī)學(xué)研究常用后者，它的構(gòu)件用光蝕刻法、壓電印刷法、預(yù)先合成寡核苷酸或肽核酸后，再通過機械接觸組成方陣。應(yīng)用的基本原理是分子雜交。用熒光染料標(biāo)記樣本DNA或 cDNA，與微陣列雜交。經(jīng)激光共聚雋熒光顯微鏡檢出雜交信號，通過計算機處理、分析，即可獲得所需信息。用紅、綠熒光分別標(biāo)記實驗樣本和對照樣本的cDNA，混合后與微陣列雜交， 可顯示實驗樣本和對照樣本基因的表達強度(顯示為紅、綠或黃色)，由此則在同一微陣列上同時檢測兩樣本的基因差異表達。
應(yīng)用基因芯片可以一次性獲得大量的數(shù)據(jù)并進行平行分析，極大地加快了實驗進程。同時在ー個陣列上進行多祥本比較，由于排除了一系列復(fù)雜因素導(dǎo)致的各項比較實驗的內(nèi)在差異，使一次性多祥本比較性分析的精確性大大提高，與計算機相連的圖像分析系統(tǒng)使研究結(jié)果更客觀、準(zhǔn)確。它的應(yīng)用范圍很廣，可以進行基因表達譜分析、基因功能分析、基因制圖和基因測序、檢測基因突變及多態(tài)性等。醫(yī)學(xué)常用它研究腫瘤的發(fā)生機理、分型和診斷、傳染病診斷、 藥物篩選和指導(dǎo)合理用藥、環(huán)境保擴，和監(jiān)測等。p53可誘導(dǎo)基因3 (p53_inducible gene 3,PIG3)是PIG家族的成員之一，與多種氧化還原酶同源，并參與細胞氧化應(yīng)激或輻射引起的細胞凋亡。通常，PIG3受腫瘤抑制蛋白p53調(diào)控,其表達與細胞中活性氧(reactive oxygen species, R0S)的產(chǎn)生相關(guān)。到目前為止，尚無文獻報道其與唐氏綜合癥的發(fā)病相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用基因芯片檢測方法，對確診為唐氏綜合癥的母體以及作為對照的健康母體羊水細胞樣品中的基因表達水平進行整體研究，尋找該疾病的發(fā)病機制，并通過高通量的方法鑒定DS的生物分子標(biāo)記物。經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)多種基因在DS發(fā)病時出現(xiàn)顯著的差異化表達，通過基因表達驗證，確證PIG3基因的表達在DS患者和健康母體羊水細胞樣品中的確存在顯著的差異。通過臨床病例進ー步證實，PIG3基因的高表達與唐氏綜合癥的發(fā)病存在密切的正相關(guān)性。基于PIG3與DS的這種相關(guān)性，本發(fā)明首次證實，該基因及其蛋白可以作為DS的分子標(biāo)記物，對其表達量進行檢測可以用于檢測DS。PIG3蛋白與DS的相關(guān)性為DS的診斷和/或治療提供了一條全新的途徑。本發(fā)明的ー個目的在于提供一種檢測唐氏綜合癥的試劑盒。本發(fā)明的另ー個目的在于提供ー種PIG3基因或蛋白表達量檢測試劑在制備用于檢測唐氏綜合癥試劑盒中的應(yīng)用。通過上述試劑盒，可以簡單、快捷的實現(xiàn)唐氏綜合癥的特異性檢測，從而為唐氏綜合癥的確診提供有力的輔助指標(biāo)。


圖I為DS患者和健康母體羊水細胞樣品的基因表達譜。其中，紅色代表與健康母體樣品相比，表達量上調(diào)的基因，緑色代表與健康母體樣品相比，表達量下調(diào)的基因。而顏色的深淺與表達量差異正相關(guān)。圖2為4個DS患者和I個健康母體羊水細胞正常樣品中PIG3基因表達量的 Real-time PCR檢測結(jié)果。所有結(jié)果均以P-actin作為內(nèi)參進行校正,并以健康母體PIG3 基因表達量為相對參照。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進ー步對本發(fā)明加以說明。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，按照常規(guī)條件操作或按照制造廠商建議的條件。
實施例I、差異表達基因的基因芯片篩選
I.細胞培養(yǎng)
收集接受常規(guī)羊水診斷的孕婦羊水細胞，其中10例確診為DS，10例為正常個體。所述羊水細胞與2300rpm離心IOmin后，0. 5ml的沉淀羊水細胞樣品添加2ml CHANG培養(yǎng)基 (IRVINE SCIENTIFIC)，于培養(yǎng)皿中，5% C02，37°C繼續(xù)培養(yǎng)。2.細胞總RNA提取及濃度測定
取對照組、處理組細胞，棄去培養(yǎng)液，以0. 25%胰蛋白酶消化細胞，終止消化后用滴管反復(fù)吹打細胞，IOOOrpm離心5分鐘,棄上清進行RNA提取。采用Qiagen公司easy微量抽提試劑盒抽提其總RNA，并用Beckman DU530測定其濃度，_80°C保存。(參照easy操作說明書)
3.RNA質(zhì)量檢測
使用Agilent公司的2100生物分析儀進行微流路芯片高壓凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，參照RNA 6000Nano芯片操作程序。4. RNA標(biāo)本的線性熒光擴增標(biāo)記
取對照組總RNA、處理組總RNA樣品，采用Agilent公司生產(chǎn)的低樣品量RNA線性擴增試劑盒進行雙色熒光標(biāo)記，實驗步驟按說明書進行，大致如下
4.I逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
1)在兩個I.5 ml的去RNA酶微量離心管中分別加入對照組與處理組總RNA各0. 5 ii g， 兩管分別加入5 Ul T7啟動子引物，加無核酸酶水至總的反應(yīng)體積為11. 5iU ;
2)65°C水浴10 min，冰上放置5 min ；
3)然后在兩管樣品中分別加入8.5iil cDNA Master Mix，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；
4)40°C水浴 2h;
5)65°C孵育15 min滅活MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；
6)冰上孵育5min。4. 2熒光標(biāo)記cRNA的合成
Cy5-CTP標(biāo)記處理組cDNA樣品，Cy3_CTP標(biāo)記對照cDNA樣品，避光條件下，在合成好的 cDNA樣品中分別加入 2. I Cy3-CTP (10mmol/L)和 2. 4ul Cy5-CTP (IOmmoI/L);各加入 57. 6 ill的轉(zhuǎn)錄Master混合液合成cRNA，并在合成的過程中摻入熒光物質(zhì)，40°C避光水浴 2 h04. 3熒光標(biāo)記cRNA的純化
采用Qiagen公司的RNeasy微型純化柱來純化標(biāo)記的cRNA樣品，具體操作步驟按照說明書進行。5 Agilent Human IB 基因芯片雜交
采用Agilent公司生產(chǎn)的原位合成試劑盒、60 mer Human IB寡核苷酸基因芯片試劑盒及進行樣品的準(zhǔn)備及雜交，采用Agilent 2565BA基因芯片掃描儀進行雜交結(jié)果的掃描， Feature extraction軟件數(shù)據(jù)分析，具體操作步驟如下
5.1 2xcRNA樣品溶液的準(zhǔn)備
取第一組Cy3及Cy5標(biāo)記的線性擴增cRNA各0. 75 y g混合，同樣第二組Cy3及Cy5標(biāo)記的線性擴增cRNA各0. 75 ii g混合，分別加入到I. 5ml去RNA酶的微量離心管中。在第一組管和第二組管中分別加入50 ii I的IOx對照質(zhì)控樣品(control target ),用去核酸酶水調(diào)整終體積至215 ill，混勻。-80 V避光保存。5. 2 2x雜交溶液的準(zhǔn)備
在以上兩組準(zhǔn)備好的2xcRNA樣品溶液中分別加入9. OiU的25x片段化緩沖液 (fragmentation buffer),輕輕混勻。60°C水浴中避光孵育30 min。各加入225111的2叉雜交緩沖溶液，輕輕混勻。短暫離心沉淀標(biāo)本。5. 3芯片雜交
I)在SL基因芯片雜交爐中安裝上轉(zhuǎn)子，將轉(zhuǎn)速調(diào)整到4轉(zhuǎn)/分，并預(yù)熱到60°C待用。2)準(zhǔn)備好需要用的Agilent芯片雜交盒套裝部件。3)從盒中拿出Agilent蓋玻片套裝，用鑷子小心的揭去覆蓋在蓋玻片上的透明塑料膜，戴清潔無塵手套，持邊緣，小心地將蓋玻片從包裝盒中拿出，然后立刻放入雜交盒中， 以免表面受污染。4)將蓋玻片具有Agilent的標(biāo)記字樣的一面向上，輕輕放入雜交盒的底座上，并保證貼標(biāo)簽一端位于雜交盒底座的矩形端。5)加樣，自上述第2)部分準(zhǔn)備好的440ul 12x雜交溶液中吸取400 ul雜交液，將槍頭從蓋玻片表面的一端緩慢移行到另一端，在此過程中，槍頭不接觸蓋玻片表面，ー邊移動ー邊將樣品慢慢滴在玻片上。6)芯片放入,戴清潔無塵手套,持邊緣,小心地將芯片從玻片盒中拿出，Agilent 的標(biāo)記字樣向下，條形碼標(biāo)簽向上，與蓋玻片方向一致(即貼標(biāo)簽一端位于雜交盒底座的矩形端)放入雜交盒中，正好蓋在蓋玻片表面的橡膠墊上，從兩端對齊芯片和蓋玻片，這樣雜交液就在芯片與蓋玻片之間形成了一個夾層，構(gòu)成一個雜交的“三文治”結(jié)構(gòu)。7)組裝雜交盒，將雜交盒的頂蓋放在芯片的上方，對齊芯片邊緣，并留下一條狹縫而防止上夾后芯片碎裂，從圓型端放置芯片夾于雜交盒的中央，擰緊頂蓋上的螺絲。8)樣品濕片，垂直按順時針方向輕輕旋轉(zhuǎn)雜交盒，使樣品液均勻的覆蓋在玻片的表面。9)檢查氣泡，在旋轉(zhuǎn)雜交盒的過程中，芯片與蓋玻片夾層中除液體外，仍會存在一些氣泡，這些氣泡應(yīng)該隨雜交盒的旋轉(zhuǎn)而自由移動，發(fā)現(xiàn)有小氣泡不移動，則輕打雜交盒的一角，重新垂直旋轉(zhuǎn)，使氣泡重新移動，形成大的氣泡。
10)在放入芯片后3 min內(nèi)，將組裝好的雜交盒循雜交爐轉(zhuǎn)子上的卡槽放入雜交爐，在該雜交盒對應(yīng)的位置放好平衡的雜交盒后，保持60°C 4轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速雜交17 h。6雜交后洗脫
6.I在孵育結(jié)束前，準(zhǔn)備好三個Wheaton公司的洗片缸，
I)其中第一個洗片缸中加入漂洗液I約200 ml,放置在室溫下。2)在第二個洗片缸中放入玻片架，并在缸內(nèi)放入磁力攪拌棒，倒入漂洗液I直到淹過玻片架，然后將其放置在磁力攪拌器上。 3)將第三個洗片缸缸置于冰浴中，加入保存在4°C的漂洗液2直到淹過玻片架，并溶液盡可能的保持低溫。(I)從烤箱中拿出雜交盒，平放在桌面上，松開翼形螺釘，拆卸雜交盒，移開頂蓋。(2)戴手套，持芯片的邊緣小心的從雜交盒拿出整個片(蓋片和芯片)，快速將其(數(shù)字面朝向操作者)放入染缸I中，使漂洗液淹沒整個玻片。(3)用鑷子分開兩片玻片，并使蓋玻片沉在洗片缸底部。(4)迅速將芯片移至染缸2中的片架上，在此過程中盡量減少與空氣的接觸。(5)調(diào)整磁力攪拌器中等速度，室溫下洗片10 min
(6)將片架放入冰浴下的染缸3(其中為漂洗液2)中，磁力攪拌器中等速度，洗片5min
(7)用鑷子輕輕從洗液2中取出玻片，印有Agilent字符面向上，迅速用Millipore公司的濾過性氮氣槍吹干陣列表面的水潰。(8)將芯片置于干燥遮光的盒子內(nèi)室溫下保存，可供進ー步掃描檢測。7芯片掃描
將芯片Agilent字符面向內(nèi)，放入Agilent芯片夾中，并將其置入Agilent2565BA基因芯片掃描儀中，采用Agilent scanner軟件由儀器自動平衡紅綠熒光的激發(fā)光能量及増益值進行掃描，獲得雙色疊加的雜交結(jié)果圖，保存該結(jié)果。8掃描結(jié)果初步分析
(I)在Agilent FeatureExtraction軟件中打開前面保存的圖象,調(diào)整紅綠顏色范圍， 獲取最佳圖象結(jié)果。(2)點擊窗ロ菜單欄的“Grid”按鈕，在彈出的對話框中選擇“Agilent Design File”選項，然后從芯片配套的數(shù)據(jù)光盤中導(dǎo)入HumanlB陣列的設(shè)計文件，將陣列圖片上的每個點與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的編號、Genbank索取號、基因名稱、功能描述以及相關(guān)信息建立關(guān)聯(lián)。(3)點擊“Auto Fit〃按鈕，將預(yù)先設(shè)定好的格子固定到陣列上，然后依次調(diào)整格子的四個角以及每一行的中心，使每個格子方框的十字中心對準(zhǔn)陣列上的每ー個點的中心。(4)點擊，"Save Grid〃按鈕保存此格子，然后點擊“Grid on/off’，開關(guān)，關(guān)閉格子設(shè)置，此時即可進行數(shù)據(jù)的提取。(5)點擊FeatureExtraction選項，此時彈出數(shù)據(jù)提取對話框，設(shè)定好數(shù)據(jù)保存的途徑后，調(diào)整好各項參數(shù)
9表達差異的基因按照功能進行分類
I)以EXCEL打開數(shù)據(jù)文件，刪除芯片掃描實驗等與結(jié)果無關(guān)的信息。2)對Probe Name進行排序，刪除162個陰性對照基因和918個內(nèi)參照基因。3)對 LogRatio P Value 進行排序，刪除 P Value 彡 0. 05 或 0. 01 的數(shù)據(jù)。10基因芯片雜交結(jié)果分析
通過以LogRatio P Value值蘭0.01的標(biāo)準(zhǔn)篩選表達差異基因得到1938個基因，再根據(jù)rprocessedsignal/gprocessedsignal = 0. 5標(biāo)準(zhǔn)得到209個表達下調(diào)基因，根據(jù) rprocessedsignal/gprocessedsignal ^ 2得到541個表達上調(diào)基因。使用ABI公司的 PANTHZER數(shù)據(jù)庫(http://www.pantherdb.org)對差異表達的基因進行分析,按生物功能進行分類得到147類。結(jié)合PANTHER數(shù)據(jù)庫按生物功能和細胞通路對表達差異基因的分類以及對差異基因功能描述的分析，得出與DS密切相關(guān)的基因(部分節(jié)選)
權(quán)利要求
1.一種檢測唐氏綜合癥的試劑盒，其特征在于，包括能檢測PIG3基因或蛋白表達量的試劑，用于測量來自受測對象生物樣本中的PIG3基因或蛋白表達量。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中，所述試劑為PIG3蛋白抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，所述PIG3蛋白抗體為單克隆或多克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述PIG3蛋白抗體偶聯(lián)有標(biāo)記物。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中，所述標(biāo)記物選自由熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素組成的組。
6.PIG3基因或蛋白表達量檢測試劑在制備診斷唐氏綜合癥的試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒用于測量來自受測對象生物樣本中的PIG3基因或蛋白表達量，通過與正常個體生物樣本中的PIG3基因或蛋白表達量進行比較，以確定所述受測對象是否患有唐氏綜合癥。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述試劑為PIG3蛋白抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中，所述PIG3蛋白抗體為單克隆或多克隆抗體如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述PIG3蛋白抗體偶聯(lián)有標(biāo)記物。
9.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，所述標(biāo)記物選自由熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素組成的組。
全文摘要
本發(fā)明利用基因芯片檢測方法，對確診為唐氏綜合癥的母體以及作為對照的健康母體羊水細胞樣品中的基因表達水平進行整體研究，以鑒定DS的生物分子標(biāo)記物。經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)多種基因在DS發(fā)病時出現(xiàn)顯著的差異化表達，通過基因表達驗證，確證PIG3基因的表達在DS患者和健康母體羊水細胞樣品中的確存在顯著的差異。通過臨床病例進一步證實，PIG3基因的高表達與唐氏綜合癥的發(fā)病存在密切的正相關(guān)性。由此，可利用PIG3基因或蛋白表達量檢測試劑制備用于檢測唐氏綜合癥試劑盒，通過上述試劑盒，可以簡單、快捷的實現(xiàn)唐氏綜合癥的特異性檢測，從而為唐氏綜合癥的確診提供有力的輔助指標(biāo)。
文檔編號C12Q1/68GK102586467SQ201210079610
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者吳健 申請人:常熟市虞山綠茶有限公司