專利名稱：Pcr結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中禽貧血病病毒感染的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種PCR結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中禽貧血病病毒感染， 屬于獸醫微生物學領域分子生物技術。
背景技術：
目前，在規?；B禽業和養豬業，病毒的多重感染是普遍性的問題，也是臨床發病的真正原因。但是，對多種病毒的病原學檢測對養殖場來說是一個困難問題。這是因為，很難對多個個體的不同病料同時做不同病毒的分離培養?，F代分子生物學技術PCR和核酸探針斑點分子雜交技術有助于解決這一問題。在一切條件完美時，PCR的靈敏度非常高。但在實際應用時，常常出現假陽性和假陰性問題。如，有時PCR產生的DNA條帶雖染大小與預期的一樣，但測序結果表明，卻是一種無關核酸。此外，由于技術性原因，PCR的可重復性也較差，特別是其靈敏度的可重復性較差，常常PCR產物在電泳時看不到核酸條帶。這是因為， PCR產物電泳時，如果加入的DNA量小于50pg，則很難看到條帶。用特異性核酸探針做斑點分子雜交，其特異性較穩定，其檢測靈敏度可達Ipg的同源核酸。但如果病毒感染量小時， 在I μ g病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來。如過將PCR和斑點雜交結合起來，則既能確定PCR產物的特異性，也能提高PCR產物的檢出靈敏度。但如果再結合斑點雜交，則只要Ipg就可顯現陽性了。而且，電泳顯示的條帶，并不代表是特異的。

發明內容
本發明的目的是為克服PCR在實際應用時，常常出現假陽性和假陰性問題；用特異性核酸探針做斑點分子雜交，但如果病毒感染量小時，在I μ g病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來這些不足，而將PCR和斑點雜交結合起來， 則既能確定PCR產物的特異性，也能提高PCR產物的檢出靈敏度。但如果再結合斑點雜交， 則只要Ipg就可顯現陽性了。先將疑是病毒感染的肉雞樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增后，再對PCR的產物用該病毒的特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR 產物的特異性，也大大提高了檢出率。發明的詳細描述I本發明主要步驟(I)病料的收集及樣品DNA的制備取因患病引起不同臨床表現的動物、病死動物的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。按常規方法提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液制備成為樣品DNA。
(2)擴增樣品中可疑病毒的特異性核酸片段設計可疑病毒特異性引物(F2/R2)擴增出樣品DNA可疑病毒特異性核酸片段(樣品PCR擴增的片段大小長于探針)，如圖I所示。用于擴增樣品的引物(F2/R2)序列必須在探針標記用引物(F1/R1)序列之外，即被標記探針DNA序列之外；其擴增的產物長于標記探針DNA序列。(3)地高辛PCR法標記病毒核酸探針制備及特異性及敏感性的測定利用已知病毒基因組DNA克隆用于標記病毒核酸探針。設計引物(F1/R1)采用地高辛PCR法標記技術，進行地高辛標記制備探針，將純化的病毒的特異性DNA片段作為標記 DNA探針的模板，探針標記方法按以上試劑盒操作說明書進行。(4)各樣品及其相應PCR產物用標記的病毒核酸探針進行斑點雜交檢測。2本發明的具體描述(以雞貧血病病毒為例)(I)病料的收集及樣品DNA的制備取疑似雞貧血病病毒(CAV)感染引起不同雞群臨床表現的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mL DNA抽提緩沖液 (IOOmmoI/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl, pH 8. 0,0. 25mmol/L EDTA，pH 8. 0,0. 5% SDS)和終濃度為lOOyg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學出版社， 1996)提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應組織的DNA作陰性對照。(2)樣品DNA針對CAV的特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設計的一對引物CAV-vpl_F2和CAV_vpl-R2擴增出樣品DNA的特異性核酸片段(樣品1-12)，片段長度及引物序列如表I所示，樣品PCR擴增的片段大小長于探針，如圖I所示。表I :樣品PCR所用的弓I物序列(序列4，序列5)
權利要求
1.一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中禽貧血病病毒感染的方法，其特征在于先將疑是禽貧血病病毒感染的動物(已死亡動物)組織樣品DNA用針對禽貧血病病毒的特異性引物PCR擴增后，再對PCR的產物用該禽貧血病病毒的特異性核酸探針做斑點雜交；檢測禽貧血病病毒的探針標記的引物CAV-vp 1-Fl/CAV-vpI-Rl序列為序列I/序列2， 擴增樣品的引物CAV-vpl-F2/CAV-vpl-R2序列為序列4/序列5。
2.如權利要求I所述的一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法， 其特征在于本發明在利用PCR技術結合斑點雜交檢測樣品時，用于擴增樣品DNA的引物F2/ R2序列必須在探針標記用引物F1/R1序列之外，也就是在被標記核酸探針DNA序列之外。
全文摘要
本發明涉及一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中禽貧血病病毒感染的方法。本發明將疑是禽貧血病病毒感染的動物(已死亡動物)組織樣品DNA用針對禽貧血病病毒的特異性引物PCR擴增后，對PCR產物再用禽貧血病病毒特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產物的特異性，也大大提高了檢出率。本發明試驗結果表明，PCR結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中禽貧血病病毒感染，可顯著提高禽貧血病病毒感染檢測的靈敏度和特異性。
文檔編號C12Q1/68GK102586489SQ20121008220
公開日2012年7月18日 申請日期2010年4月9日 優先權日2010年4月9日
發明者崔治中 申請人:山東農業大學